全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 7期
优化重叠 PCR法进行单链抗体基因扩增和点突变
符勇耀　李正国　李泮志　邓伟　杨迎伍　王中康
(重庆大学生物工程学院基因工程研究中心 重庆市高校功能基因与调控新技术重点实验室
重庆市杀虫真菌农药工程技术研究中心 ,重庆 400030)
　　摘 　要 : 　利用重叠 PCR技术扩增单链抗体基因或位点突变是抗体文库构建或稳定表达的关键和难点 ,国内外文献未见
其方法学的系统报道。以不同 VH、VL 和 L inker基因为拼接模板进行重叠 PCR,针对影响重叠 PCR扩增的拼接类型 ,引物设
计 ,反应条件等进行优化。结果表明两段重叠连接比三段更容易实现 ,且扩增效果好 ;引物的互补序列长度一般应大于 15 bp,
且在 18～24 bp时扩增效果最好 ;退火温度在 52～60℃,Mg2 +浓度在 1. 5～2. 5 mM时对拼接的效果影响较小 ;直接或间接使
用拼接模板均可以实现重叠 PCR的扩增。利用优化策略 ,首次构建了抗除虫菊酯的 scFv基因文库并引入抗 XAC糖蛋白 scFv
基因的点突变 ,为除虫菊酯抗体文库构建和抗 XAC重组抗体的稳定表达奠定了基础。
关键词 : 　重叠 PCR　优化 　单链抗体基因 　点突变
Study of Single Cha in Fvs Splic ing and Site2directed M utagenesis
Based on Optimal Overlap PCR
Fu Yongyao　L i Zhengguo　L i Panzhi　Deng W ei　Yang Yingwu　W ang Zhongkang
( Genetic Engineering R esearch Center of B io2engineering College, Key Laboratory of Functional Gene and N ew Regulation Technologies under
Chongqing M unicipal Education Comm ission, Engineering and Technology Research Center for Fungal Insecticides of
Chongqing, Chongqing University, Chongqing 400030)
　　Abs trac t: 　Single chain Fvs sp licing and site2directed mutagenesis by overlap PCR is a key point in construction of antibody li2
brary and stable exp ression of antibody. Several aspects affecting overlap PCR amp lification, including sp licing types, p rimer design, re2
action conditions and use patterns, were exp lored. The results indicated that sp licing by two fragmentswas easier and superior than that
of by three fragments usually. Secondly, the length of comp lementary sequences of p rimers could be above 15 bp, and 15 to 24 bp was
the best in the experiment. Then, annealing temperature from 52℃ to 60℃ and Mg2 + at 1. 5～2. 5 mM had little influence on sp licing
reaction and the temp late used by directly or indirectly was successful for overlap PCR. According to this strategy, we amp lified the
specific scFv repertories against pyrethrins and also introduced the site2directed mutagenesis of anti2XAC scFv gene successfully, which
laid the basis for the construction of anti2pyrethrins scFv library and the stable exp ression of anti2XAC scFv antibody.
Key wo rds: 　Overlap PCR　Op tim ization　Single chain Fvsgene　Site2directed mutagenesis
收稿日期 : 2008212222
基金项目 :重庆市科委自然基金重点项目 (2007BA1005)
作者简介 :符勇耀 (19832) ,男 ,四川人 ,硕士研究生 ,主要从事分子生物学研究
通讯作者 :李正国 , Tel: 023265120483, E2mail: zhengguoli@ cqu. edu. cn　　重叠延伸 PCR ( gene sp licing by overlap exten2sion PCR, SOE2PCR)是分子生物学和基因工程研究领域中的一种新型 PCR技术 [ 1 ] 。自 1989年 ,重叠PCR被 Ho[ 2 ]和 Horton[ 3 ]应用于定向诱变和融合基因构建以来 ,该技术得到了广泛应用 ,在基因定点改造 [ 4 ] , DNA重组构建 [ 5 ] 、长片段基因合成 [ 6 ] 、基 因敲除 [ 7 ] 、目的基因扩增 [ 8 ] ,以及基因体外分子进化 [ 9 ]等方面都有相关报道。重叠 PCR利用基因 3′端互补重叠形成引物并进行 PCR扩增的原理在体外进行有效的基因重组和拼接 ,不需要内切酶消化和连接酶处理 ,具有简便、高效、快速 ,易于操作等优点 ,已经逐渐取代传统的文库构建方法 ,应用
2009年第 7期 符勇耀等 :优化重叠 PCR法进行单链抗体基因扩增和点突变
于噬菌体和核糖体展示的抗体文库构建 [ 10, 11 ] 。
Horton[ 1 ]研究认为利用重叠 PCR技术可以 100%
实现全长基因的扩增 ,但而 Ito[ 12 ]和 warrens[ 13 ]的
研究表明该技术并不能完全实现某些基因的扩
增。尽管科研人员对重叠 PCR扩增全长基因持不
同的观点和实验技巧 ,但利用重叠 PCR技术扩增
全长抗体基因 (库 ) ,包括 scFv, dsFv[ 14 ] , Fab[ 15 ] ,
scFv2Fc[ 16 ] , scFab[ 17 ]已经成为抗体文库构建或抗
体表达的关键步骤。在大部分实验研究中 ,利用
重叠 PCR实现基因拼接 ,尤其是基因库拼接具有
一定的难度。目前 ,国内外文献未见其在抗体基
因 (库 )构建中的方法学研究报道。
作为新型 PCR技术 ,重叠 PCR分为两步 ,首先
是在无引物的条件下 ,具有互补末端的 PCR产物形
成重叠链 ,进而通过重叠链的延伸形成模板链 ,然后
后步则通过添加引物扩增获得目的基因产物。与常
规 PCR技术相比 ,影响重叠 PCR扩增的条件更多 ,
主要包括拼接类型、引物设计 ,退火温度 ,模板量和
反应循环数等。徐芳等 [ 18 ]认为重叠 PCR的关键在
于互补末端 ,即 5′或 3′端引物的设计 ,但其它影响
因素并不清楚。为使该技术更好的应用于单链抗体
基因扩增和位点突变以及其它分子生物学实验研
究 ,本研究针对影响重叠 PCR扩增的条件进行了优
化。利用优化的重叠 PCR技术 ,对抗除虫菊酯单链
抗体基因的扩增和抗 XAC糖蛋白单链抗体基因的
点突变进行了研究。
1　材料与方法
111　材料
Ex Taq、10 ×Buffer、MgCl2 Buffer ( 25 mmol·
L21 )、dNTP ( 10 mmol·L21 )、DNA marker、pMD182T
试剂盒等购于大连 TaKaRa公司 , mRNA 纯化试剂
盒购自美国 Amersham公司 ,M 2MLV反转录酶购自
美国 Promega公司 , DNA胶回收纯化试剂盒购于上
海生工生物技术有限公司。扩增小鼠可变区与 lin2
ker的模板由本实验室保存。小鼠免疫脾细胞和
GX95, GX44或 GX13菌株由本室制备。引物由上
海生工生物技术有限公司合成。
112　方法
11211　三段或两段基因拼接的比较 　 (1)引物设计
三段基因拼接时 ,扩增小鼠抗体可变区基因的引物与
袁青等 [ 19 ]报道的引物大致相符 ,其中扩增重链 (VH )
的前引物为 5′2CAGC TAA TAC GAC TCA CTA TAG
GAA CAG ACC ACC ATG AGG TSM ARC TGC AGS
AGT CW G G23′,VH、VL基因与 linker序列 ( GGGGS) 3
分别有 24 bp的重叠区。二段基因拼接时 ,将 linker
序列分别设计在 VH 基因的下游 ( a)和 VL 基因的上
游 ( b) , ( a) : 5′2GCC AGA GCC ACC TCC GCC TGA
ACC GCC TCC ACC TGA GGA GAC GGT GAC CGT
GGT CCC23′; ( b) : 5′2TCA GGC GGA GGT GGC TCT
GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATT GAG CTC ACC
CAG TCT CCA23′。下划线为 2种引物的 5′端互补序
列。 (2)重轻链的扩增与拼接 VH、VL 基因与 linker
的扩增按常规 PCR方法进行 ,纯化用 DNA胶回收试
剂盒回收。三段基因重叠 PCR连接时 ,拼接模板分
别采用三者等量加入 (VH、VL、linker各 30 ～50
ng) ,近等摩尔加入 (VH 30 ng、VL 50 ng、linker 15
ng)和优化配比加入 (VH 15 ng、VL 50 ng、linker 20
ng)的方式进行。反应体系 : VH、VL和 linker片段
为模板 , 10 ×Buffer 2. 5μl, 2 mM M gCl2 , 0. 2 mM
dNTPs, 1. 25 U Ex Taq DNA聚合酶 ,加双蒸水至 25
μl,在不加引物的条件下 , 94℃变性 1 m in, 56℃退
火 1 m in, 72℃延伸 1 m in, 7～10个循环。然后再
加入 10 ×Buffer 2. 5 μl, 1. 5 mM M gCl2 , 0. 2 mM
dNTPs, 1. 25 U Ex Taq DNA聚合酶 , 0. 4μM VH 5′
和 VL 3′引物 ,补水至 50μl体系。设定反应条件
为 94℃ 40 s, 55℃ 1 m in, 72℃ 1. 5 m in, 30个循
环 , 72℃延伸 10 m in, 4℃保存。二段重叠 PCR连
接时 ,拼接模板按 VH、VL 基因各 20～30 ng或 VH、
VL 近等摩尔数加入 ,其他反应条件不变。
11212　引物与扩增条件的优化　 (1)重叠引物大小的
设计分别设计了重叠片段在 15 bp, 18 bp, 21 bp, 23 bp,
45 bp (序列未列 )时 ,重叠 PCR的扩增情况 ,互补引物
对 : ① VH下游 5′2CGA TCC GCC ACC GCC TGA GGA
GAC GGT GAC CGT GGT CCC23′, ②VL 上游 5′2GGC
GGT GGC GGA TCG GAC ATT GAG CTC ACC CAG
TCT CCA23′; ③VH下游 5′2GTC CGA TCC GCC ACC
GCC TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC23′, ④与
②相同 ; ⑤VH下游 5′2GTC CGA TCC GCC ACC GCC
TGA GGA GAC GGT GAC CGT GGT CCC23′, ⑥VL上游
5′2TCA GGC GGT GGC GGA TCG GAC ATT GAG CTC
151
生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
ACC CAG TCT CCA 23′; ⑦VH下游 5′2CCC CCG CCA
CCA GAG CCG CCT CCA CCT GAG GAG ACG GTG
ACC GT 23′, ⑧VL上游 5′2GGA GGC GGC TCT GGT
GGC GGG GGA TCA GGA GGG GGC GGT TCT ACT
GAG CTC ACC CAG TCT 23′。下划线处为引物对的互
补序列。在第一步拼接时 ,退火温度设为 56℃或
60℃,其他扩增条件同上。 (2)退火温度和 Mg2 +的优
化 以上述引物⑦和⑧分别扩增的片段为模板 ,互补序
列为 23 bp,在第一步反应中设计退火温度为 50℃～
63℃(Tm 值约 60℃) ,间隔 2℃为一个梯度 ,延伸时间
为 2 m in,进行重叠 PCR扩增。为使重叠 PCR片段扩
增的效果更佳 ,在上述体系不变的情况下 ,设计 Mg2 +
浓度为 1. 5 mM, 2 mM, 2. 5 mM 3个梯度进行扩增 ,其
它反应条件不变。
11213　直接或间接模板应用的比较 　在重叠 PCR
扩增时 ,在不加引物的条件下加入等量 VH、VL 片段
各 20～30 ng,自身拼接 20～25个循环后 ,取 1～2
μl为模板进行下一步 PCR扩增 (同上 ) ,即间接利
用拼接模板进行扩增。另外 ,取 VH、VL 链各 20 ng,
加入 25μl无引物的反应体系进行 5～10个循环
后 ,直接加入目的基因 5′和 3′端引物进行扩增 ,即
直接利用模板进行重叠 PCR扩增。
11214　小鼠抗除虫菊酯 scFv基因的扩增 　取除虫
菊酯抗原免疫鼠的脾细胞分离成单细胞 ,按 RNA纯
化试剂盒说明分离 mRNA ,然后反转录合成第一链
cDNA,经β2actin内参检测合格后进行 PCR 扩增。
其中 ,扩增 VH 基因的上游引物与 1. 2. 1中重链的
上游引物相同 ,下游引物为 1. 2. 1 ( a) ;扩增 VL 基因
的上游引物与 1. 2. 1 ( b)相同 ,下游引物为 5′2GCT
CTA GAA CAC TCA TTC CTG TTG GAG CT23′。反
应体系为 4 μl cDNA2RNA, 10 ×Buffer 2. 5μl, 1. 5
mM MgCl2 , 0. 2 mM dNTPs, 1. 25 U Ex Taq DNA聚合
酶 , 0. 4μM VH (或 VL ) 5′和 3′端引物 ,加 ddH2O至
25μl。在 PCR反应条件为 94℃预变性 5 m in, 35个
循环 (94℃变性 40 s, 54℃退火 45 s, 72℃延伸 45 s)
后 , 72℃延伸 10 m in, 16℃保存。VH 和 VL 基因经凝
胶分析和纯化后 ,各取 25 ng为重叠 PCR第一步反
应的拼接模板 , 7个循环后加入引物 ,按上述反应体
系和条件进行下步扩增。将扩增产物纯化后 ,克隆
到 pMD218T载体 ,随机挑取 3个单克隆送上海生工
测序。
11215　抗 XAC 糖蛋白 scFv基因的点突变 　取
GX95, GX44或 GX13混合后 , 37℃摇菌过夜 ,提取质
粒 pCANTAB5E为模板 ,设计突变引物 , VH 上游 5′2
GGG AAT TCC ATA TGC AGG TGC AGC TGC AGG
AGT23′,下游为 1. 2. 2⑦; VL上游为 1. 2. 2⑧,下游 5′2
CCG CTC GAG TGC AGC ATC AGC CCG TTT GAT2
3′,按 1. 2. 4的扩增条件分别扩增抗体可变区基因。
以纯化的 VH和 VL 基因各 30 ng为模板进行拼接 ,采
用第二步模板间接加入的方法进行扩增 ,扩增条件同
上。扩增产物送上海生工测序。
2　结果与讨论
211　三段或两段基因重叠 PCR结果
利用小鼠 VH、VL 基因进行重叠 PCR扩增 ,首先
采用常规 PCR分别扩增 VH、VL 基因并纯化回收。
以此为模板 ,三段基因的重叠 PCR扩增显示 (图 12
A) , VH、VL 和 linker在等摩尔加入时 ,容易出现如
泳道 1, 2所示图像 ,泳道 1表现前方有拖带 ,后方出
现同 VL 大小的条带 ,这可能是三者拼接不当引起
的结果 ;泳道 2表现无目标带 ,说明三者等摩尔数加
入时扩增结果不稳定 ;三者在等量加入时表现如泳
道 3所示 ,目标片段无扩增 ,仅见 VL 大小的片段。
三者在按一定比例优化后 ,拼接效果表现较好 ,虽有
一些拖带但扩增结果稳定 (图 12B )。在进行二段基
因重叠 PCR拼接时 , VH 和 VL 基因无论等量或等摩
尔数加入 ,都能够实现较好的扩增 ,表现清晰无拖带
(图 12C)。
A 1, 2. VH、VL和 linker等摩尔加入时重叠 PCR 片段 ; 3. VH、VL和
linker等量加入时重叠 PCR片段 ;M. Marker 2000
B 1, 2. VH、VL和 linker重叠 PCR片段 ;M. Marker III
C 1, 2. VH ′和 VL ′重叠 PCR片段 ;M. Marker III
图 1　二段与三段基因重叠 PCR的扩增
251
2009年第 7期 符勇耀等 :优化重叠 PCR法进行单链抗体基因扩增和点突变
212　引物和扩增条件的优化
互补序列是影响重叠 PCR引物设计的重要因
素 ,实验中设计互补序列由 15 bp到 24 bp的重叠引
物拼接均获得了成功 (图 22A ) ,而互补序列长达 45
bp时 ,却出现弥散现象 (结果未列 )。本实验室认为
重叠互补序列在 15 bp以上均可以实现扩增 ,该结
果与之相符 ,但并非重叠序列引物越长越好 ,引物过
长更容易出现弥散或拖带 ,重叠引物大小以 18～24
bp最好。退火温度和 Mg2 +浓度是影响重叠 PCR扩
增的重要条件 ,试验中 8个温度梯度扩增结果显示 ,
各个温度下重叠 PCR扩增的条带无明显差异 (图 22
B) ,表明退火温度对重叠 PCR拼接的影响不显著。
因此 ,为避免非特异性扩增和错配 ,可提高退火温度
来提高重叠 PCR扩增的特异性。此外 ,各 Mg2 +浓
度下重叠 PCR扩增结果的差异也不显著 (结果未
列 ) ,Mg2 +浓度越大 ,扩增效果略有增加 ,所以 Mg2 +
浓度也并非主要因素 , 1. 5 mM或 2 mM即可实现较
好的扩增。
　　A M. Marker III; 1～4. 15 bp, 18 bp, 21bp, 23 bp互补序列的重叠
PCR片段
　　B 1～6. 63℃, 62℃, 60℃, 58℃, 56℃, 54℃时扩增条带 ; 7～10.
52℃; 11. 50℃; M. Marker II
图 2　互补序列与温度梯度的重叠 PCR扩增
213不同模板的重叠 PCR结果
试验采用了间接和直接利用拼接模板的方式进
行重叠 PCR,两种方法都取得了较好的扩增效果。
相比之下 ,前者获得的拼接模板更多 (图 3) ,有利于
目的基因的大量扩增 ,尤其是单基因的扩增 ;后者则
更适合基因文库的构建。其次 ,前者通常需要高浓
度凝胶 (2% ～3% )低压电泳的方式以纯化目的片
段 ,后者则不需要。
A 1. 间接法扩增的连接片段 ;M. Marker III
B 1. 直接法扩增的连接片段 ;M. Marker III
图 3　不同模板的重叠 PCR扩增
214　抗除虫菊酯 scFv基因的扩增
抗除虫菊酯的小鼠可变区基因被分别扩增 (图
42A ) ,凝胶电泳显示 VH和 VL基因条带清晰 ,大小合
适 ,便于下一步试验。利用优化的重叠 PCR 方法 ,
抗除虫菊酯 scFv基因被成功扩增 (图 42B ) ,扩增产
物经测序表明 , 3条序列都是完整的单链抗体基因 ,
VH和 VL基因均为开放阅读框 ,不含终止密码。通过
V2BASE DNA p lot分析 , 3条序列的重链属于 VH 1
和 VH 4基因家簇 ,轻链属于 VKⅢ和 VKⅣ亚基因
家簇。经过 Multalin比对 , VH基因的核酸序列变化
较大 , VL基因的核酸序列也有不同程度的变化 (结
果未列 ) ,表明构建的单链抗体 DNA 文库序列是完
整而多样的 ,可用于抗体库的构建和特异性抗原的
筛选。其中 , 1号克隆的 scFv基因通过 BLASN 分
析 , VH 基因与小鼠 Igγ, Igh, Igα有 70% ～73%的同
源性 , VL 基因与小鼠单抗 MST2 轻链区 ( XM _
001476823)有 69%的同源性 ;再用 IMGT分析表明 ,
A M. Marker 2000; 1, 2. VH和 VL扩增片段
B 1. scFv基因 ; M. Marker III
C 1. Scdsfv基因 ;M. Marker II
图 4　scF v基因的重叠 PCR扩增和点突变
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 7期
VH 和 VL 基因的互补决定区 (CDR s)和框架区 ( FR )
完整 (结果未列 ) ,其中 , VH 基因与小鼠的重链区 32
2 (AJ851868)有 92. 36%的同源性 ; VL 基因与小鼠
的轻链区 4～74 (AJ231217)有 85. 46%的同源性 ;并
通过 IMGT/Collier2de2Perles分析预测 scFv基因的
结构特点 (图 5)。
215　抗 XAC糖蛋白 scFv基因的点突变
抗 XAC糖蛋白的 VH 和 VL 可变区基因被分别
扩增 (结果未列 ) ,通过优化的重叠 PCR方法 , scFv
基因被成功拼接 (图 42C)。纯化的 scFv基因经测序
验证和氨基酸序列分析 ,二硫键位点突变正确且
linker正确连接 (图 6)。
A 1号 VH 的结构 IMGT/Collier2de2Perles分析表明 CDR s为 9 (CDR1残基 27～38) , 7 (CDR2残基 56～65) , 14 (CDR3残基 105～118) ,铰链区氨
基酸残基为 CARLYYGNYVYAMDYW
B 1号 VL 的结构 , IMGT/Collier2de2Perles分析表明 CDR s为 7 (CDR1残基 27～38) , 3 (CDR2残基 56～65) , 9 (CDR3残基 105～113) ,铰链区氨
基酸残基为 CHQYHRSPLTF;箭头表示β链折叠方向 ,疏水氨基酸用 LVCW IMFA表示 ,中性氨基酸用 PTSYG表示 ,亲水氨基酸用 EKRQND表
示 ; 2, 3号克隆未列出
图 5　抗除虫菊酯 scF v基因结构预测
“_”表示突变的半胱氨酸 (Cys) ,加粗序列表示 linker序列 ( Gly4Ser) 3
图 6　突变 scF v基因的测序分析
3　总结
在重叠 PCR中 ,两段基因或三段基因拼接是
重叠 PCR普遍采用的方式 ,通常需要分子片段等
摩尔加入。在本实验中 ,首先采用了三段基因等
摩尔加入的方式 ,结果拖带严重且不稳定 ;接着又
用等量加入的方法 ,效果也不佳 ;最后进行配比优
化 ,采用不同质量比进行连接时取得了较好的结
果。而两段拼接的重叠 PCR反应则容易扩增 ,条
带表现清晰无杂带。由此认为 :两段拼接要比三
段拼接更容易实现 ,三段拼接往往会出现拖带和
结果不稳定的现象。目前 ,在抗体基因 (库 )构建
中 ,还有一种方法是采用两步克隆拼接法体外组
装实现三段基因片段的拼接 ,即 VH (VL )先与 lin2
ker连接后 ,再与 VL (VH )进行拼接 [ 20 ] 。通常由于
三段拼接的机率比二段拼接要低 ,而错配的可能
性又比后者高 ,因此容易出现拖带、弥散或无扩
451
2009年第 7期 符勇耀等 :优化重叠 PCR法进行单链抗体基因扩增和点突变
增。这也许是国外多数研究人员采用两段拼接方
式来完成重叠 PCR 组装 scFv基因的原因 [ 21, 22 ] 。
当然 ,无论是两段或三段拼接 ,基因片段的纯度对
重叠 PCR都十分重要。
引物设计时 ,重叠片段在 15, 18, 21及 23 bp ,退
火温度分别在 56℃或 60℃时 ,均能够成功实现扩
增 ,与目前大多数研究报道相符 [ 23～25 ]。通常引物的
重叠片段设计在大于 15 bp时 ,都能够较容易的实
现扩增 ;因此 ,根据实验的需要可以灵活的设计重叠
片段。但也有研究报道 ,引物的重叠片段在 10 bp
时也可以实现扩增 [ 26 ]。一般认为重叠片段越长 ,越
容易实现扩增 ,本试验设计了长达 45 bp的重叠区
域 ,扩增结果不理想。从试验的难易程度考虑 ,将引
物设计 18～24 bp的重叠区应该是最佳的。重叠
PCR在第一步拼接时 ,退火温度通常有 52℃[ 27 ] , 54
～55℃[ 14, 28 ] , 58℃[ 29 ] , 60℃[ 19, 22 ] , 63℃[ 30 ]。为此 ,本
试验设计了退火温度从 50℃至目前最高温度 63℃
的重叠 PCR扩增 ,延伸时间为 2 m in,结果表明扩增
效果差异不明显。在 Mg2 + 浓度优化试验中 ,常规
1. 5 mM或 2 mM都能较好的扩增 ,因此 ,当引物设
计合理时 ,温度和 Mg2 +浓度对重叠 PCR拼接的效
果影响较小。
目前 ,几乎所有重叠 PCR都采用直接运用模板
的方法 [ 22, 30 ] ,即在重叠 PCR第一步反应 7～10个循
环后直接加入引物进行扩增。本试验运用了间接利
用拼接模板的方法进行扩增 ,效果与直接重叠 PCR
方法相当。在一般的建库反应中 ,为尽可能获得大
容量的文库 ,都采用直接重叠 PCR的方式 [ 21, 28 ]。尽
管间接重叠 PCR方法尚无运用报道 ,但该方式通过
提高第一步反应的循环数 (20或 25个循环 )积累模
板量 ,取 1～2μl为模板进行扩增 ,可以获得大量的
PCR产物。与前者相比 ,间接利用模板的方式更适
用于单基因的拼接 ,同时减少工作量和原材料。最
后 ,本研究利用所建立的优化策略 ,成功的构建了抗
除虫菊酯的 scFv基因文库 ,并在抗 XAC糖蛋白单
链抗体基因上引入点突变 ,扩增了单链二硫键稳定
的抗体基因 (S cdsfv)。
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