全 文 ：中草药 Chinese Traditional and Herbal Drugs 第 44 卷 第 17 期 2013 年 9 月

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茶黄素衍生物抗甲型流感病毒的作用研究
李湘潋，刘叔文，杨 洁*
南方医科大学药学院，广东 广州 510515
摘 要：目的 研究茶黄素衍生物的混合物（含茶黄素、茶黄素-3-没食子酸酯、茶黄素-3′-没食子酸酯和茶黄素-3, 3′-双没食子
酸酯，简称茶黄素衍生物）抗甲型流感病毒的作用及其机制。方法 采用 H5N1 假病毒检测体系，观察茶黄素衍生物对
A/Thailand/Kan353/2004 H5N1 毒株假病毒的抑制作用；采用血凝抑制实验和神经氨酸酶抑制实验进一步分析茶黄素衍生物抗甲
型流感病毒的作用机制；采用 H1N1 FM_1 病毒检测体系，观察茶黄素衍生物对甲型流感病毒 FM_1 的抑制作用；采用 MTT
法评价茶黄素衍生物对 MDCK 细胞的毒性。结果 茶黄素衍生物能明显的抑制 H5N1 假病毒的感染力，IC50为（151.88±18.95）
μg/mL；对血凝素 HA1 亚基无抑制作用；对神经氨酸酶具有抑制作用，IC50 为（129.09±1.33）μg/mL；能明显抑制甲型流
感病毒 FM_1 株。此外，茶黄素衍生物对 MDCK 细胞的毒性较小，CC50为（879.89±4.54）μg/mL。结论 茶黄素衍生物可
能通过与血凝素 HA2 亚基结合而抑制禽流感病毒的感染，同时能够在一定程度上抑制病毒的神经氨酸酶活性，提示茶黄素
衍生物是通过多靶点发挥抗 H5N1 亚型禽流感病毒的作用。
关键词：茶黄素衍生物；甲型流感病毒；H5N1 亚型；H1N1 亚型；血凝素；神经氨酸酶
中图分类号：R282.710.5；R978.7 文献标志码：A 文章编号：0253 - 2670(2013)17 - 2437 - 05
DOI: 10.7501/j.issn.0253-2670.2013.17.018
Effect of theaflavin derivatives on influenza A virus
LI Xiang-lian, LIU Shu-wen, YANG Jie
School of Pharmaceutical Sciences, Southern Medical University, Guangzhou 510515, China
Abstract: Objective To study the anti-influenza A virus effect of theaflavin derivatives which contain theaflavin (TF1),
theaflavin-3-gallate (TF2A), theaflavin-3′-gallate (TF2B), and theaflavin-3, 3′-digallate (TF3) and to investigate the mechanism.
Methods The inhibition of theaflavin derivatives on A/Thailand/Kan353/2004 H5N1 pseudovirus was investigated using pseudotype
H5N1 virus system. Hemagglutination inhibition assay and neuraminidase (NA) inhibition assay were used to investigate the
mechanism for their anti-influenza activities. The inhibition of theaflavin derivatives on influenza A virus FM_1 was observed by
H1N1 FM_1 system. Cytotoxicity of theaflavin derivatives on MDCK cells was determined by MTT assay. Results Theaflavin
derivatives could significantly inhibit the infection of pseudovirus H5N1 with IC50 of (151.88 ± 18.95) μg/mL. It had no inhibition on
HA1 subunit. Theaflavin derivatives had the inhibition on NA with IC50 of (129.09 ± 1.33) μg/mL. Theaflavin derivatives showed a
significant inhibitory activity on FM_1 influenza virus strain in MDCK cells. Theaflavin derivatives showed the low cytotoxicity on
MDCK cells with CC50 of (879.89 ± 4.54) μg/mL. Conclusion Theaflavin derivatives could inhibit the infection of avian influenza
virus through the combination with hemagglutinin (HA) HA2 subunit and inhibit the activity of viral NA to some extent, which
indicates that the anti-H5N1 avian influenza virus of theaflavin derivatives may be through multi-targets.
Key words: theaflavin derivatives; influenza A virus; subtype H5N1; subtype H1N1; hemagglutinin; neuraminidase

全球每年有 15%～20%的人感染流感病毒，导
致至少 50 万人死亡，流感已成为严重威胁人类健康
的疾病[1]。流感病毒属于 RNA 病毒的正粘病毒科，
分为甲、乙、丙 3 个类型，其抗原变异迅速，导致
对其防治存在很大的困难，现有的药物仅 4 种，且
只作用于 M2 离子通道和神经氨酸酶 2 个靶点，远
不能满足临床需求。因此，研发新机制的抗流感病
毒药物势在必行。中药抗病毒疗效显著且不良反应
少、作用靶点多，从中寻找有效的抗流感病毒药物
具有广阔的前景。

收稿日期：2013-01-18
基金项目：国家自然科学基金资助项目（81102792）；广东高校国际科技合作创新平台项目（gjhz1105）
作者简介：李湘潋（1987—），男，硕士研究生，研究方向为抗病毒药物与分子病毒学。Tel: (020)61648590 E-mail: herelxl@163.com
*通信作者 杨 洁（1980—） Tel: (020)61648590 E-mail: yjjy20071030@126.com
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茶黄素及其衍生物是红茶中的主要成分，具有
苯并 酚酮结构。目前已发现并鉴定的茶黄素类化
合物有 28 个，其中茶黄素（TF1）、茶黄素-3-没食
子酸酯（TF2A）、茶黄素-3′-没食子酸酯（TF2B）、
茶黄素-3, 3′-双没食子酸酯（TF3）是 4 种最主要的
茶黄素类物质[2]。茶黄素具有抗肿瘤、抗炎、抗氧
化、抗病毒、抗菌及抗增殖等作用，是一类极具开
发潜力的天然产物[3-6]。前期研究显示，茶黄素衍生
物具有广谱的抗 HIV 活性，可通过多种机制抑制
HIV 复制，为多靶点的 HIV 抑制剂[7-8]。流感病毒
与 HIV 类似，均为 I 型包膜病毒。鉴于茶黄素单体
化合物难于纯化且纯化的单体极不稳定，本实验采
用茶黄素衍生物，研究其对甲型流感病毒的影响，
为挖掘其抗流感活性潜力提供实验依据。
1 材料
1.1 药品与试剂
茶黄素衍生物（TF1、TF2A、TF2B、TF3 总质
量分数＞85%），厦门勋健中药植物化学有限公司，
批号 20050715；CL-385319[9]，本实验室合成，质
量分数为 99.7%；利巴韦林盐酸盐，广州肇庆星湖
生物化学制药厂生产，质量分数为 99.5%，批号
L090322；H5N1 抗原和抗体，哈尔滨兽医研究所；
DMEM 细胞培养基、新生胎牛血清、胰蛋白酶、青
霉素、链霉素，中国 Invitrogen 公司；荧光素酶检
测试剂盒、细胞裂解液，Promega 公司；感受态细
胞 DH5α，香港 Dgen 公司；转染试剂 PEI，起福生
物科技有限公司；神经氨酸酶抑制剂筛选试剂盒，
上海碧云天生物技术有限公司；其余生化试剂均为
国产分析纯。
1.2 细胞与质粒
293T 细胞和狗肾细胞（MDCK 细胞），由本实
验室保存。细胞培养液为含 10%胎牛血清、10 000
U/L 青霉素、链霉素的 DMEM 高糖培养基。
A/Thailand/Kan353/2004-HA 、 A/Thailand/Kan
353/2004-NA 质粒，德国乌尔姆大学 Frank Kirchhoff
教授惠赠；pNL4-3R-E-Luc（系在 pNL4-3 进行移码
突变使其不表达 Env 蛋白和 Vpr 蛋白，并插入绿色
荧光蛋白基因的一个重组质粒），美国国立卫生研究
院艾滋病研究和参考试剂项目部门提供。
1.3 病毒株
甲型流感病毒 FM_1 株（A/FM/1/47，H1N1）
由广州中医药大学张奉学教授惠赠，经本实验室
SPF 鸡胚传代扩增，−80 ℃保存。
2 方法
2.1 对 H5N1 禽流感假病毒感染力的影响
通过共转染 HIV-1 骨架质粒，HA-质粒和 NA-
质粒到 293T 细胞中，48 h 后收获上清，进行 MDCK
细胞感染实验，成功构建 A/Thailand/Kan353/2004
H5N1 毒株假病毒。以水泡性口炎病毒（VSVG）基
因克隆质粒和 HIV 包膜蛋白基因缺失的骨架质粒
构建的 VSVG 假病毒为阴性对照。
MDCK 细胞按 1×104/孔接种于 96 孔细胞培养
板，培养 24 h。不同浓度的茶黄素衍生物（初始质
量浓度为 2 000 μg/mL，倍比稀释）50 μL 与假病毒
50 μL，37 ℃下孵育 30 min，CL-385319 作为阳性
对照药（终浓度为 50 μmol/L）。将孵育后的病毒与
茶黄素衍生物或 CL-385319 的混合物加至 MDCK
细胞中，培养 48 h，根据荧光素酶检测试剂盒说明
书检测细胞的化学发光值，判断药物抑制病毒侵入
细胞的活性。以茶黄素衍生物的半数抑制浓度
（IC50）作为其抗流感病毒活性的指标。
抑制率 = 1－(E－N) / (P－N)
E 为给药组的化学发光值，N 为阴性对照组的化学发光值，
P 为 CL-385319 组的化学发光值。
2.2 对血凝素的影响
2.2.1 血凝实验 向 96 孔 V 型血凝板中的 1～12
孔加入 25 μL 生理盐水，再向第 1 孔中加入 H5N1
病毒抗原 25 μL，第 2～11 孔依次加入倍比稀释的
H5N1 病毒抗原，第 12 孔加入 1%鸡红细胞 25 μL，
静置约 30 min，观察鸡红细胞凝集情况，计算凝集
单位。
2.2.2 血凝抑制实验 向 96 孔 V 型血凝板中加入
25 μL 生理盐水，再加入 25 μL 不同浓度（药物初
始质量浓度 10 mg/mL，倍比稀释）的茶黄素衍生物，
充分混合；阳性对照孔加入 25 μL 血清，阴性对照
孔加入 25 μL 生理盐水；最后向除阴性对照孔外的
其他孔中加入 4 个凝集单位的 H5N1 病毒抗原 25
μL，混匀，室温孵育 30 min，观察血凝结果。
2.3 对神经氨酸酶活性的影响
神经氨酸酶（NA）活性检测按照血凝素（HA）
抑制剂筛选试剂盒说明书操作。向 96 孔荧光酶标板
内加入 70 μL/孔 NA 检测缓冲液后，依次加入 10 μL
NA、10 μL 不同质量浓度的茶黄素衍生物（初始质
量浓度为 1 000 μg/mL，倍比稀释），振动摇匀 1 min，
37 ℃孵育 2 min，加入 10 μL 的 NA 荧光底物，再
振摇 1 min，37 ℃孵育 20 min 后进行荧光测定。
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2.4 对甲型流感病毒 FM_1 株的影响
取处于指数生长期的 MDCK 细胞铺于 96 孔板
上，细胞密度为 1×l04/孔，24 h 后细胞长成单层后
去掉培养基，每孔加入含有 100 倍半数组织培养感
染剂量（TCID50）的病毒液，再加入不同浓度（初
始质量浓度为 1 000 μg/mL，倍比稀释）的茶黄素衍
生物 100 μL，37 ℃培养 2 h，去掉病毒和茶黄素衍
生物的混合物，加入不同质量浓度（初浓度为 500
μg/mL，倍比稀释）的茶黄素衍生物 200 μL，培养
3 d。用血凝法测上清滴度。阳性对照孔加入利巴韦
林药物和病毒的混合液，阴性对照孔不加药物只加
病毒，空白对照孔加入不含病毒与药物的细胞上清
液，其他操作同茶黄素衍生物给药组。
2.5 MTT 法检测茶黄素衍生物细胞毒性
取处于指数生长期的 MDCK 细胞铺在 96 孔板
上，细胞密度为 1×104/孔，待其生长至单层，加入
倍比稀释的茶黄素衍生物 DMEM 培养液（终质量
浓度 2 000 μg/mL）100 μL/孔，孵箱培养 48 h 后加
MTT 溶液[10]（5 mg/mL）10 μL/孔，孵育 4 h，吸去
上清，每孔加 100 μL 二甲基亚砜（DMSO），低速
振荡 10 min，570 nm 波长处测定各孔吸光度（A）
值，采用 Reed-Muench 法 [11]计算半数有毒浓度
（CC50）。每一药物质量浓度均重复 3 孔，同时设对
照孔，实验重复 3 次。
2.6 统计学处理
数据以 ±x s 表示，统计方法为 t 检验，采用
SPSS 13.0 软件进行统计学分析，采用 Reed-muench
法计算流感病毒 FM_1 在 MDCK 细胞中的 TCID50。
3 结果
3.1 对 H5N1 禽流感假病毒感染力的影响
由于 pNL4-3R-E-Luc 带有荧光素酶报告基因，
当高致病性禽流感H5N1假病毒成功感染MDCK细
胞后，荧光素酶在细胞内表达。表征荧光素酶活性
的化学发光值与假病毒的感染能力成正比。病毒原
液 2 倍稀释后，细胞裂解液化学发光值达到 1.6×
107，表明 H5N1 假病毒具有很强的感染能力。结果
见图 1。茶黄素衍生物对 H5N1 假病毒有明显的抑
制作用，IC50 为（151.88±18.95）μg/mL。由于茶
黄素衍生物对 VSVG 假病毒无抑制活性，表明其靶
点为 H5N1 流感病毒包膜上的 HA 或 NA。阳性对
照药 CL-385319 能够明显抑制 H5N1 假病毒的活
性，但对 VSVG 假病毒无抑制活性，结果见图 2。


图 1 H5N1 禽流感假病毒对 MDCK 细胞感染力的影响
Fig. 1 Effect of pesudoviruses H5N1 on infectivite activity
of MDCK cells
3.2 对血凝素的影响
茶黄素衍生物即便在高浓度，也不能阻止血凝
素引起的血凝抑制现象，而作为阳性对照物的
H5N1血凝素抗血清在 1∶32倍稀释时即可阻止HA
引起的血凝抑制作用，结果见图 3。
3.3 对神经氨酸酶活性的影响
茶黄素衍生物对神经氨酸酶的活性具有明显的
抑制作用，IC50 为（129.09±1.33）μg/mL，见图 4。


图 2 茶黄素衍生物对禽流感 H5N1 假病毒感染力的影响
Fig. 2 Effect of theaflavin derivatives on infectivite activity of pseudoviruses H5N1

18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
2.0 4.0 8.0 16.0 32.0 64.0 空白
稀释倍数
化
学
发
光
值
/
(×
10
6 )


120
100
80
60
40
20
0
−20
−40
1 000 500 250 125 62.5 31.25 15.625
抑
制
率
/
%

茶黄素衍生物 / (μg·mL−1) CL-385319 / (μg·mL−1)
H5N1 假病毒
VSVG 假病毒
120
100
80
60
40
20
0
8.8528 2.213 2 0.553 3 0.138 3 0.034 6 8.465 3×10−3
抑
制
率
/
%

H5N1 假病毒
VSVG 假病毒
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A-茶黄素衍生物（初始质量浓度 10 mg/mL，从左至右依次倍比稀释）；B-阳性对照（从左至右抗体倍比稀释） C-阴性对照 D-空白对照
A-theaflavin derivatives (intial concentration was 10 mg/mL, dilution from left to right); B-positive control (antibody dilution from left to right)
C-negative control D-blank control
图 3 茶黄素衍生物对血凝素血凝抑制的影响
Fig. 3 Effect of theaflavin derivatives on hemagglutination inhibition induced by HA

图 4 茶黄素衍生物对神经氨酸酶的影响
Fig. 4 Effect of theaflavin derivatives against NA
3.4 对甲型流感病毒 FM_1 活病毒的影响
茶黄素衍生物对甲型流感病毒 FM_1 株活病毒
有明显的抑制作用，并呈明显的量效关系，当其质
量浓度为 250 μg/mL 时，即能明显抑制甲型流感病
毒 FM_1 的活性。结果见图 5。
3.5 对 MDCK 细胞的毒性
茶黄素衍生物对 MDCK 细胞表现出较低毒性，
CC50 为（879.89±4.54）μg/mL，表明其在实验条件
下是安全的。结果见图 6。


A-茶黄素衍生物（初始质量浓度为 1 000 μg/mL，从左至右依次倍比稀释）；B-从左至右依次为阳性对照和阴性对照 C-空白对照
A-theaflavin derivatives (intial concentration was 10 mg/mL, dilution from left to right); B-positive control and negative control (from left to right)
C-blank control
图 5 茶黄素衍生物对甲型流感病毒 H1N1 FM_1 的影响
Fig. 5 Effect of theaflavin derivatives on influenza A virus H1N1 FM_1

图 6 茶黄素衍生物对 MDCK 细胞的毒性
Fig. 6 Cytotoxicity of theaflavin derivatives on MDCK cells
4 讨论
高致病性禽流感（H5N1）是一种人禽共患的正
粘病毒科流感病毒属病毒引起的急性接触性传染
病，病毒的毒性很强，死亡率高。假病毒丧失了病
毒的自我复制能力，只具有单轮感染性，生物安全
性高，可以在生物安全 2 级实验室完成。H5N1 假
病毒检测体系适用于高通量筛选流感病毒的抑制
剂，具有高效、稳定、安全的特点[9]。流感病毒的
包膜蛋白包括 HA 和 NA。病毒进入靶细胞是由病
毒包膜上的 HA 介导的。HA 由 HA1 和 HA2 两个
亚基组成，其中 HA1 亚基与靶细胞膜上的唾液酸受

120
100
80
60
40
20
0
1 000 500 250 125 62.5 31.25
抑
制
率
/
%

茶黄素衍生物 / (μg·mL−1)
120
100
80
60
40
20
0
抑
制
率
/
%

2 000 1 600 1 280 1 024 819.2 655.36 524.29 419.43 335.54
茶黄素衍生物 / (μg·mL−1)
C D
A
B

A
B C
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体结合，然后病毒提供胞吞作用进入细胞质，并被
包裹在胞内体中；HA2 则为跨膜亚基，在病毒进入
过程中，介导病毒膜与胞内体膜的融合[12]。因此，
阻断流感病毒进入靶细胞的任一环节，就有可能抑
制流感病毒的复制。某些天然产物即通过抑制 HIV
进入靶细胞而产生预防和治疗的作用[13]。
本实验采用 H5N1 假病毒体系检测茶黄素衍生
物对病毒进入靶细胞的抑制作用，结果发现茶黄素
衍生物对 H5N1 泰国株的假病毒有明显抑制作用，
但对 VSVG 假病毒无抑制活性。由于两种假病毒仅
是包膜蛋白不同，表明茶黄素衍生物特异性作用于
H5N1 流感病毒的包膜蛋白，即 HA 或 NA。但本实
验发现，茶黄素衍生物不能阻止血凝素 HA1 亚基的
血凝抑制作用，因此其抑制流感病毒的作用位点可
能是血凝素 HA2。今后将对茶黄素衍生物对血凝素
HA2 及其与靶穴的结合模式进行深入研究。此外茶
黄素衍生物也能抑制 NA 的活性，表明对神经氨酸
酶的抑制可能也是其抗流感病毒机制之一。
根据 HA 的同源性分型，H1、H5 亚型流感属
于同一组别。为此，本实验还以流感病毒 FM_1 株
感染 MDCK 细胞为模型，评价茶黄素衍生物体外
抗 H1N1 作用，结果发现茶黄素衍生物具有明显的
抗 H1N1 的活性，其作用机制可能是其对血凝素和
神经氨酸酶的抑制。茶黄素衍生物对 MDCK 细胞
的毒性较小，表明茶黄素衍生物作为抗流感病毒药
物是安全的。
茶多酚具有包括抑制流感病毒在内的多种药理
活性[14]。表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）为
绿茶中的活性成分，占茶多酚制品的 40%～50%。
茶黄素是红茶中的活性成分，与 EGCG 结构相似。
本研究结果显示茶黄素衍生物可能通过与血凝素
HA2 亚基结合而抑制禽流感病毒进入靶细胞，同时
能够在一定程度上抑制病毒的神经氨酸酶活性，表
明茶黄素衍生物是通过多靶点作用而发挥抗 H5N1
亚型禽流感病毒的作用，这为茶黄素衍生物进一步
研究和深入开发提供了实验依据和参考。
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