全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 1期
流感病毒 H3N2血凝素基因和神经氨酸酶
基因在大肠杆菌中的表达
张烨 1 于在江1 黄捷勤2 唐启慧 2 陈禹保 3 辛丽 1 陈永坤 1 舒跃龙 1
( 1中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所,北京 100052; 2北京标凯科技有限公司,
北京 100094; 3北京中亚国瑞生物经济研究所,北京 102206)
摘 要: 克隆、表达和鉴定流感病毒 H 3N2 HA, NA基因序列, 为制备抗体和基因工程疫苗打下基础。在成功克隆流感
病毒 H 3N2全长 HA、NA基因并测序的基础上, 将部分基因序列克隆到表达载体 pET32a( + )上, 全基因序列克隆到表达载体
pGEX4T1上,构建了重组表达质粒 pET32a ( + ) /HA (截短 ), pET32a ( + ) /NA (截短 ), pGEX4T1 /HA, 转化大肠杆菌 BL21 /
Rosetta, IPTG诱导表达,利用 N i2 +亲和层析柱和 GSTrap 4B亲和层析柱对重组蛋白进行纯化, 并用 W estern b lo tting和 ELISA
方法检测其抗原性。结果显示, 重组蛋白在大肠杆菌中可以高效表达, SDSPAGE显示其相对分子质量与预计大小一致。
ELISA和W estern blotting试验证实,重组蛋白具有良好的抗原性。成功克隆和表达了流感病毒 H 3N2HA、NA基因序列, 可为
流感病毒 H 3N2诊断试剂和疫苗的开发等进一步的研究提供参考。
关键词: 流感病毒 H3N2 血凝素 神经氨酸酶 克隆表达
Expression of theHemagglutinin and Neuram idinase Gene of
Influenza A V irusH3N2 inE . coli
Zhang Ye
1 Yu Zaijiang1 Huang Jieqin2 TangQ ihui2 Chen Yubao3
X in L i
1 Chen Yongkun1 Shu Yuelong1
(
1
Institute of ViralD isease Control and Prevention, Chinese Center forD isease Control and P revention,
Beijing 100052;
2
B eijing Biokit Inc. , B eijing 100094;
3
SinoGreen Institute forB ioEconomy, Beijing 102206)
Abstrac:t It was to c lone, express and character ize theHA and NA pro tein of influenza v irus H 3N2. On the bas is of successfu l
clon ing the full leng th HA and NA gene and sequence ana lysis o f influenza v irus H 3N2, pa rt o f the genes w ere ligated into pET32a
( + ), and fu ll leng th gene into pGEX4T1. An expression vector pET32a ( + ) /HA ( cut), pET32a ( + ) /NA ( cut), pGEX4T1 /HA
w ere constructed and expressed inE. coliBL21 /Rosetta induced by IPTG. Recomb inant pro te in w as purified through affin ity chrom atog
raphy co lum n. W este rn b lo tting and EL ISA w ere used to determ ine the antigenic of the recomb inant pro tein. Results show ed that the re
comb inant capsid gene w as expressed in E. coli. SDSPAGE show ed that the gene expression product was as same as expected. EL ISA
andW estern blotting show ed that the recom binant pro te in has satisfactory antigen ic. The HA and NA prote in of influenza v irus H3N2
has been successfu l cloned and expressed, wh ich cou ld be usefu l for deve loping d iagnose reagents o r vacc ine of H3N2.
Key words: Influenza v irus H 3N2 H em agg lutinin Neuram idinase C lone and express
收稿日期: 20100908
基金项目:国家科技支撑计划资助项目 ( 2006BAD06A15)
作者简介:张烨,研究方向:流感分子病毒学; Em ai:l n lxdrong@ 126 com
通讯作者:舒跃龙, Em ai:l yshu@ vip. sin a. com
流行性感冒简称流感,是由流行性感冒病毒引
起的严重危害人类健康的呼吸道传染病。临床上通
常表现为发热、头痛、周身酸痛及乏力等明显的全身
中毒症状及干咳、鼻炎等呼吸道症状 [ 1]。引起人类
流感流行的主要是甲型流感病毒, 流感是一种常见
病、多发病,经常引起地方性流行, 有时引起世界性
大流行。 1918年西班牙流感 (H lN l型 )大流行曾经
夺去了 2 000万人的性命 [ 2]。 1918年至今人类又遭
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
受了 3次流感大流行 ( 1957年 H2N2型, 1968年
H3N2型, 1977年 H IN l型 ) , 许多人丧失了生命,而
且每年的小流行也夺去了许多小孩和老人的生命,
造成了严重的社会问题。除了感染人以外, 流感病
毒也在动物中广泛存在,能引起猪、鸡、马等动物流感
流行和导致动物大量死亡,造成巨大经济损失 [ 3- 6 ]。
我国流感的血清学和病原学调查结果都表明,
在我国横跨南北的多个省市都有严重的流感流行,
其主要亚型是 H1N 1和 H3N2。因此,有关流感病毒
H3N2生物学特性, 致病机理, 诊断和预防的研究日
益受到卫生防疫人员的重视。
血凝素 ( hemagg lulinin, HA)蛋白是病毒表面的
主要糖蛋白之一,属于主要的保护性抗原, 它不仅可
以诱导特异性中和抗体产生,而且还可以刺激机体产
生细胞毒性淋巴细胞 ( CTL)反应。另外, HA在病毒
吸附、穿膜以及决定病毒的宿主特异性和致病力方面
均起着关键作用 [ 7]。NA基因编码的神经氨酸酶
( neuram idinase, NA)蛋白是体液免疫的靶抗原,可诱
导机体产生特异性抗体,抗体具有免疫保护作用 [ 8]。
本研究利用大肠杆菌表达系统表达 H 3N2病毒
HA, NA蛋白, 对重组蛋白抗原性进行初步评价,为
血清流行病学调查及诊断试剂的开发提供参考。
1 材料和方法
11 材料
流感病毒 H 3N2由中国疾病预防控制中心病毒
病所国家流感中心分离培养、大肠杆菌 ( E. coli )
DH5、E. coli BL21、E. coli Rosetta、DNA m arker为北
京标凯科技有限公司产品; pET32a( + )和 pGEX4T-
1载体为 Novagen公司产品、pMD20T载体、蛋白
marker为 TaKaRa公司产品; 限制性内切酶、T4 DNA
连接酶为 NEB公司产品; DNA Ploym erase、Reverse
Transcr iptase为 TaKaR a公司产品; DNA凝胶回收试
剂盒、质粒 DNA小量抽提试剂盒、RNA抽提试剂盒
为北京标凯科技有限公司产品; N iNTAgrose为 Q ia
gen公司产品; GSTrap 4B亲和层析柱为 GE公司产
品;其他试剂为分析纯产品。
12 流感病毒 H3N2全基因组提取以及 HA、NA基
因的克隆
病毒基因组的提取按病毒 RNA提取试剂盒说
明书进行操作。根据 GenB ank中流感病毒 H3N2基
因序列, 设计出针对 H3N2 HA和 NA大片段的引
物。以提取的病毒 RNA为模板,在逆转录酶的作用
下逆转录 HA和 NA基因。操作步骤: 模板与引物
70 保温 10 m in后迅速在冰上急冷 3m in, 瞬离再
加入已混合好的 buffer、dNTT M ix ture、RNase Inhibi
tor、R everse Transcr iptase、RN ase free水, 42 保温 1
h。再设计引物, 以逆转录出的 1stStand为模板
PCR扩增 DNA,反应条件: 95 预变性 5 m in, 93
变性 30 s, 55 退火 30 s, 72 延伸 2 m in, 30个循
环, 72 延伸 10 m in。 PCR结束后, 经 1%琼脂糖凝
胶电泳鉴定阳性的片段用 1%琼脂糖凝胶电泳分
离, 用胶回收试剂盒回收纯化后克隆至 pMD20T载
体, 转化大肠杆菌感受态细胞 DH5, PCR鉴定, 阳
性质粒送北京标凯科技有限公司进行序列测定。引
物序列: H3up: 5AAACTTCCTGAAAATG3; H3
down: 5TCAAATGCAAATGTTGCACC5。 TN3up:
5GAATTCAACTCCCCCCCAAAC3; N3down: 5
TTATATAGGCATGAGATTGATGT3。
13 HA、NA蛋白抗原片段表达质粒的构建
131 重组表达质粒 pET32a ( + ) /HA (截短 ),
pET32a( + ) /NA(截短 )的构建 根据 HA、NA蛋白基
因阳性重组质粒的测序结果,设计引物。 pETH3up:
5GAGAGAGCTCAAACTTCCTGAAAATG3, pETH3
down: 5GAGACTCGAGCTGGAACCGGTTGTTTAAT3;
pETN3up: 5GAGAGAGCTCGAATTCAACTCCCCCC
CAAAC3, pETN3down: 5GAGA CTCGAGCCGATT
GATGCAGCTTTTG3。
以流感病毒 H3N 2蛋白基因阳性重组质粒
( pMD20THA /NA )为模板进行 PCR, 反应条件为
95 预变性 5 m in, 93 变性 30 s, 55 退火 30 s,
72 延伸 2 m in, 30个循环, 72 延伸 10 m in。PCR
扩增出尾部截短 150 bp两端带有酶切位点和保护
碱基的 HA和 NA基因序列。经 1%琼脂糖凝胶电
泳分离,胶回收纯化后双酶切,与用同两种酶双酶切
的 pET32a( + )载体连接、转化大肠杆菌感受态细胞
DH5、挑单克隆扩大培养, PCR鉴定出阳性克隆。
重组质粒 pET32a ( + ) /HA (截短 ) , pET32a ( + ) /
NA(截短 ) PCR阳性克隆送北京标凯科技有限公司
测序。
132 重组表达质粒 pGEX4T1 /HA的构建 根
214
2011年第 1期 张烨等:流感病毒 H3N2血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达
据 HA蛋白基因阳性重组质粒的测序结果,设计引
物 ( GXTH3up: 5GAGAGTCGACGGAAACTTCCTG
AAAATG3; GXTH3down: 5GAGACTCGAGTCAA
ATGCAAATGTTGCACCT3) ,以流感病毒 H3N 2蛋
白基因阳性重组质粒 ( pMD20THA )为模板进行
PCR, 反应条件为 95 预变性 5 m in, 93 变性 30 s,
55 退火 30 s, 72 延伸 2m in, 30个循环, 72 延伸
10 m in。PCR扩增出全长 HA基因序列。经 1%琼
脂糖凝胶电泳分离,胶回收纯化后双酶切,与用同两
种酶双酶切的 pGEX4T1载体连接、转化大肠杆菌
感受态细胞 DH5、挑单克隆扩大培养, PCR鉴定出
阳性克隆。重组质粒 pGEX4T1 /HA PCR阳性克隆
送北京标凯科技有限公司测序。
14 HA、NA蛋白抗原片段的表达
阳性 pET32a ( + ) /HA (截短 ) , pET32a ( + ) /
NA (截短 )质粒转化 E coli BL21 Star,阳性 pGEX4T
1 /HA质粒转化 Eco li Rosetta, 挑单克隆,接种入 5
mL含相应抗生素的 LB培养基中, 37 250 r /m in
振摇过夜。次日将 5mL培养液转接入 500mL含相
应抗生素的 LB培养基中, 37 振荡培养至吸光度
A 600 = 06时, 加入 IPTG至终浓度 1mmo l/L, 诱导 3
h, 离心收集菌体, 并用 PBS洗 1次, - 40 冻融两
次, 用 1 /10体积的 PBST ( PBS, 05% T ritonX100,
pH74)悬浮菌体, 加 PMSF至终浓度为 1 mmo l/L,
180H z超声破碎细菌, 4 12 000 r/m in离心 30
m in,分别收集沉淀和上清, SDSPAGE显示蛋白位
于沉淀中 (即包涵体表达 )。
15 表达产物的纯化
151 pET32a( + ) /HA (截短 )、pET32a( + ) /NA
(截短 )重组质粒表达产物的纯化 用 N iNTA agar
ose按 QAGEN 手册方法纯化包涵体, PBS透析
复性。
152 pGEX4T1 /HA重组质粒表达产物的纯化
超声破碎后的沉淀溶于尿素中,用 PBS梯度稀释使
其复性,上 GSTrap 4B亲和层析柱,按 GE手册方法
纯化蛋白。
16 纯化产物免疫学活性的鉴定
161 ELISA检测 以梯度稀释的表达重组蛋白
抗原铺板,梯度稀释的兔抗禽流感病毒 H5N1血清
作为一抗, HRP标记的羊抗兔 IgG为二抗, 进行
ELISA检测,并设空白对照和免疫前小鼠血清为阴
性对照,待测样本 OD值大于阴性对照 OD值 2倍以
上为阳性。
162 W estern blotting印迹检测 以重组蛋白为
抗原,兔抗流感病毒 H 5N1血清作为一抗, HRP标记
的羊抗兔 IgG为二抗, 进行 W estern blott ing印迹检
测, 并设未诱导的 BL21 /Rosetta为阴性对照。
2 结果
21 H3N2病毒全基因组提取以及 HA、NA基因的
克隆
病毒 RNA模板经逆转录及 PCR扩增后, 琼脂
糖电泳显示得到一条 1 700 bp和一条 1 400 bp左右
的条带 (图 1) ,此条带与 T载体连接转化后得到多
个阳性克隆, 测序结果分析, 此两条基因序列是
H 3N2病毒的血凝素和神经氨酸酶基因。
M. DNAM aker; 1. HA基因 PCR结果; 2. NA基因 PCR结果
图 1 HA和 NA基因的 PCR扩增图
22 HA、NA蛋白抗原片段表达质粒的构建
PCR产物经 1%琼脂糖凝胶电泳分离, 胶回收
纯化后,上、下游酶切位点双酶切, 同时也用同样的
酶处理 pET32a ( + )载体和 pGEX4T1载体, 连接,
转化大肠杆菌 E coli DH 5, 小量抽提质粒后进行双
酶切和 PCR鉴定, 电泳都显示出正确大小的条带
(图 2, 图 3), 测序结果也正确,表明目的基因已经
成功亚克隆到 pET32a ( + )载体和 pGEX4T1载体
载体上。
23 HA、NA蛋白抗原片段的表达
质粒转化表达菌 Ecoli BL21 /Rosetta, 经 1
mmo l/L IPTG诱导 3 h后, SDSPAGE,可见特异性表
达带,分子量与预期大小相同。可溶性分析显示此
215
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
蛋白为包涵体形式表达。
1. pET32a( + ) ; 2. pET32a ( + ) Sac I单酶切; 3. pET32a
( + ) /HA(截短 ) ; 4. pET32 a( + ) /HA(截短 ) Sac I单酶切;
5. pET32 a( + ) / HA (截短 ) Sac I/X h o I双酶切; 6. HA (截
短 )片段 PCR产物; 7. pET32a( + ) /NA (截短 ); 8. pET32a
( + ) /NA(截短 )Sac I单酶切; 9. pET32a( + ) /NA (截短 )
Sac I/X ho I双酶切, 10. NA (截短 )片段 PCR产物, M . DNA
M aker
图 2 重组表达质粒 pET32a( + ) /HA(截短 )、
pET32a( + ) /NA(截短 )的酶切及 PCR鉴定
1. pGEX4T1; 2. pGEX4T1 Sa l I单酶切; 3. pGEX4T1 /
HA; 4. pGEX4T1 /HA Sa l I单酶切; 5. pGEX4T1 /HA Sal I/
X ho I双酶切; 6. NA片段 PCR产物; M. DNA M ak er
图 3 重组表达质粒 pGEX4T1 /HA的酶切及 PCR鉴定
24 表达产物的纯化
241 pET32a ( + ) /HA (截短 )、pET32a ( + ) /NA
(截短 )重组质粒表达产物的纯化 用 N iNTA agar
ose亲和层析柱纯化包涵体,在 8mol /L尿素 ( pH45)
洗脱时 Bradford试剂有强烈的颜色变化, 经 SDS
PAGE检测 (图 4,图 5) ,表明目的蛋白得到纯化, 其
中表达蛋白纯度占总蛋白的 90%以上, 浓度为约 3
mg /mL。纯化后的蛋白经 PBS透析复性后保存。
242 pGEX4T1 /HA重组质粒表达产物的纯化
超声破碎后的沉淀溶于尿素中,用 PBS梯度稀释使
其复性,上 GST rap 4B亲和层析柱, 在 10 mmo l/L还
原型谷胱甘肽洗脱时 B radford试剂有强烈的颜色变
化,经 SDSPAGE检测 (图 6), 表明目的蛋白得到纯
化, 其中表达蛋白纯度占总蛋白的 90%以上, 浓度
为约 3 mg /mL。
M.蛋白质 M ark er; 1.未经 IPTG诱导的 BL21; 2. IPTG诱导
后的 BL21; 3.超声破菌后上清; 4. IPTG诱导后的不可溶蛋
白; 5.纯化后的蛋白
图 4 HA重组蛋白的表达和纯化
M.蛋白质 M ark er; 1.未经 IPTG诱导的 BL21; 2. IPTG诱导
后的 BL21; 3.超声破菌后上清; 4. IPTG诱导后的不可溶蛋
白; 5.纯化后的蛋白
图 5 NA重组蛋白的表达和纯化
M.蛋白质 M ark er; 1.未经 IPTG诱导的 rosetta; 2. IPTG诱导
后的 Rosetta; 3.超声破菌后上清; 4. IPTG诱导后的不可溶
蛋白; 5.纯化后的蛋白
图 6 HA重组蛋白的表达和纯化
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2011年第 1期 张烨等:流感病毒 H3N2血凝素基因和神经氨酸酶基因在大肠杆菌中的表达
25 纯化产物免疫学活性的鉴定
ELISA检测结果 (数值略 )显示, 重组蛋白与兔
抗流感病毒 H3N2血清有阳性反应, 提示表达的重
组蛋白与病毒自身蛋白有相似的免疫原性。West
ern b lo tting结果 (图 7,图 8)显示重组蛋白与兔抗流
感病毒 H3N2血清反应有特异性条带产生,分子量
大小与预计一致。
1. BL21阴性对照; 2. NA重组蛋白; 3. HA重组蛋白; M .预
染蛋白 M arker;
图 7 重组蛋白与兔抗流感病毒 H3N2(截短 )血清的
W estern b lotting分析
1. Rosetta阴性对照; 2, 3. HA重组蛋白; M.预染蛋白 M arker
图 8 重组蛋白与兔抗流感病毒 H3N2(全长 )血清的
W estern b lotting分析
3 讨论
流感病毒 ( influenza v irus, IV )属于正黏病毒科
流感病毒属,病毒基因组为分节段单股负链 RNA病
毒,基因组大约为 13. 6 kb,由大小不等的 8个基因
片段组成。编码 PB2、PB1、PB3聚合酶、血凝素
(HA )、神经氨酸酶 ( NA )、核蛋白 ( NP)、基质蛋白
M 1和离子通道蛋白 M2、非结构蛋白 NS1、NS2共 10
种不同的基因产物 [ 9, 10]。 SIV的 RNA片段 4和片段
6分别编码血凝素 HA和神经氨酸酶 NA, 它们是流
感病毒亚型分类的依据。目前己发现的流感病毒
HA亚型 16个, NA亚型有 9个。尽管不同的亚型
之间可以组成很多种流感病毒血清型。但目前造成
世界性大规模的流行 IV血清型只有 H1N1、H1N2
和 H 3N2。
血凝素 ( hemagg lu tin in, HA )基因属于主要的保
护性抗原,它不仅可以诱导特异性中和抗体产生,而
且还可以刺激机体产生细胞毒性淋巴细胞 ( CTL)反
应。另外, HA在病毒吸附、穿膜以及决定病毒的宿
主特异性和致病力方面均起着关键作用。因此, HA
基因的变异程度将直接影响对该病毒的防治 [ 11, 12]。
NA基因编码的神经氨酸酶 ( neuram idinase, NA )蛋
白也是 A IV 的主要表面抗原之一, 属于 n型糖蛋
白, 即氨基酸端在囊膜内, 而竣基端在囊膜外, 是病
毒粒子表面的另一种抗原, NA是一种唾液酸酶, 它
能在病毒感染靶细胞时, 识别细胞表面流感病毒受
体末端的唾液酸残基, 使病毒能够进入细胞。NA
的另一个功能就是从细胞表面糖苷键上除去唾液
酸, 避免病毒粒子的聚集,为要出芽的病毒粒子清理
通道,有利于病毒粒子的成熟和释放。还有研究表
明, NA通过连接和隔离纤维蛋白酶原,提高这种泛
在性蛋白酶前体的局部浓度, 从而提高 HA的裂解
性。NA基因可以通过点突变、序列的插入或缺失
改变酶活性, 影响病毒的复制, 使病毒适应新的宿
主, 在流感病毒的种间传播中起重要作用。NA是
流感病毒的重要免疫原之一, 可以刺激机体产生特
异性抗体,虽没有中和病毒的活性,但是可以抑制病
毒的复制,在一定程度上可以加快病毒在机体内的
清除 [ 13, 14 ]。
H3N2流感病毒的流行范围遍及全球且目前尚
无有效地预防措施 [ 15] ,因此, H3N2病毒基因工程疫
苗和快速诊断试剂的研制有着广阔的前景。在临床
进行 H3N2病毒感染的快速诊断时常需要获得特异
性强的高效价病毒抗体。而传统的纯化病毒方法制
备病毒抗体费时、费力, 且往往难以得到特异性较高
的抗体。
本研究应用原核表达系统具有成本低,操作简
单, 生产周期短,适于大规模生产,并且表达的蛋白
易于纯化等优点 [ 16]。利用基因工程手段将 HA、NA基
因的信号肽缺失掉,采用两种原核表达载体: pET32a
( + )载体和 pGEX4T1载体表达缺失信号肽的 HA和
NA基因。结果表明,不同表达系统中蛋白表达水平
相差大, pET32a ( + ) / B l21中没有得到表达,
217
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 1期
pGEX4T1 /Rosetta中获得较高表达, 说明所选择的
载体系统会影响蛋白基因的表达。 pET32a ( + ) /
BL21体系不表达,推测可能是因为其尾部序列与头
部序列会形成复杂的二级结构,阻碍蛋白翻译的起
始,故决定分别切去头部和尾部约 150 bp序列试表
达。因此基因为结构蛋白,一般 7个氨基酸即可形
成一个抗原决定簇, 切去头部或尾部小段片段不会
影响免疫活性,结果截短头部还是未表达,截短尾部
获得了高效表达,说明主要还是尾部序列影响表达。
采用 pGEX4T1载体表达缺失信号肽的 HA和 NA
基因, 结果 NA未表达, HA获得了高效表达。
免疫学鉴定确定所有表达成功的蛋白都具有较
好的免疫反应性,后续的试验将利用此重组蛋白进行
单克隆抗体和免疫学快速检测试剂的研制, 本工作为
研制开发相关的诊断试剂和基因工程疫苗提供参考。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠 )
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