全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 10期
薄荷根内生及根际细菌多样性探究
梁越 1 刘洋 1 田兆丰 2 邹媛媛 1 左山 1 刘琳1 冯雪1 张静 1 张飞云 1
( 1首都师范大学生命科学学院, 北京 100048; 2北京市农林科学院植物保护环境保护研究所,北京 100097)
摘 要: 采用传统的培养方法和基于分子生物学技术的非培养方法对我国常用中药之一的薄荷植物的根内生及根际
细菌进行研究, 从而了解其中细菌群落的多样性。对分离得到的细菌菌株进行 16S rDNA扩增和系统发育分析, 结果表明,利
用培养方法与非培养方法分离得到薄荷根内生细菌及根际细菌一些共有的细菌种类, 但前者优势种群为 g变形杆菌, 后者优
势种群为芽孢杆菌, 说明土壤细菌, 特别是根际细菌是植物内生细菌的重要来源,但植物对其内生细菌具有选择压。首次报
道了薄荷根内和根际具有丰富的微生物群落多样性,为进一步探索植物根系微生态环境中微生物群落的形成和生态功能提
供了基础信息。在今后探讨植物与微生物相互作用关系时, 有必要考虑土壤环境, 特别是根际对其的影响的同时,更加重视
植物与其相关联的细菌种类的选择作用。
关键词: 薄荷 根内生细菌 根际细菌 群落多样性
Indigenous Bacterial Community Diversity in HerbaM enthae
Haplocalycis(Mentha canadensis L. ) Root and Rhizosphere Soil
L iang Yue
1 L iu Yang1 T ian Zhaofeng2 Zou Yuanyuan1 Zuo Shan1 L iu L in1
Feng Xue
1 Zhang J ing1 Zhang Feiyun1
(
1
College of Life Sciences, Cap italN ormal University, Beijing 100048;
2
B eijing Academy of Agriculture and Forestry R esearch
Institute of P lant Protection, Environmental Protection, B eijing 100097 )
Abstrac:t The ind igenous bacte ria from H erbaM enthaeH ap loca lyc is(M entha canadensis L. ) roo t and the rh izosphere so il were i
solated and identified using the traditiona l cu lturablem ethods com bined w ith m olecu lar biotechnology to explore the bacter ial comm un ity
d iversity. Phy logene tic ana lysis based on the partia l 16S rDNA sequences indicated that the two ind igenous bacter ia comm un ities from
the root and the rhizosphe re so il share som e g roups o f bacter ia. H ow ever, the m ost dom inant g roup in roo t w as G amm ap roteobacteria
wh ile them ost dom inant g roup in rh izosphere soilw asBacillus. This discovery show s that the indigenous bacter ia in the roo tw as ma in ly
from the rhizosphe re so il but the plan t itse lf cou ld choose the comm un ity d iversity of its own indig enous bacter ia. Th is is the first report
about an abundant d iversity of bacter ia l comm un ity occurred w ith in herba m enthae haplocalycis roo t and the rh izosphere so i.l
Key words: H erbam enthae hap loca lyc is(M entha canadensis L. ) Root endophytic bacter ia Rhizobacteria l Comm un ity di
versity
收稿日期: 20100312
基金项目:国家自然科学基金 ( 30571010 ),首都师范大学生命科学学院 211重点学科科研启动经费
作者简介:梁越,女,硕士,研究方向:生物化学与分子生物学; Em ai:l 2guoyue@ 163. com
刘洋,男,并列第一作者,博士在读,研究方向:植物与微生物相互作用; Em ai:l ly81150@ 163. com
通讯作者:张飞云,副教授, Em ai:l feiyun39@ 126. com
近年来基于 PCR扩增的非培养 ( cultureinde
pendent)方法应用于环境中微生物的存在、群落结
构、功能等的研究,能比较客观地反应微生物的群落
结构及其与环境、植物的相互关系和作用机制。但
传统的培养方法也有其不可替代的优点, 通过传统
培养方法一方面可以了解一定培养条件下可培养微
生物在特定生境下的生存状况, 另一方面可以获得
具有潜在应用价值的新菌种资源 [ 1 ]。
植物内生细菌 ( endophyt ic bacteria)一般指能在
健康植物组织内栖居而对植物无实质性危害, 其中
2010年第 10期 梁越等 :薄荷根内生及根际细菌多样性探究
一部分还能使植物获益 [ 2, 3]并与植物建立了和谐联
合关系的微生物 [ 4]。植物细胞胞间是内生细菌良
好的栖息场所,含有丰富糖类、氨基酸和无机营养物
质的相连的胞间空间, 为胞间细菌提供了良好的生
长环境 [ 5]。目前, 有关植物内生细菌的研究已成为
国内外相关学者研究的热点之一。在植物的根系周
围存在着较高浓度的细菌, 这一区域被称为根际
( rh izosphere), 研究发现,植物根际细菌的密度和浓
度较土壤的其它区域高很多。植物根系周围由于存
在高水平的营养状况, 特别是小分子物质, 如氨基
酸、糖类及有机酸等, 这些物质从植物根系中分泌出
来,可以为细菌的生长和代谢所利用,从而为高浓度
细菌群落的出现提供良好的物质保障 [ 6]。
采用传统的微生物培养方法和基于 PCR分子
技术的非培养方法对我国常用中药之一的薄荷植物
的根内生及根际细菌进行分离培养和鉴定, 旨在进
一步揭示植物与微生物关系,开发利用植物微生物
资源, 以及为促进中药材生产提供基础信息。
1 材料与方法
1. 1 供试植物
薄荷 (M entha hap localyx )由首都师范大学植物
与微生物相互作用研究室提供。
1. 2 培养基
LB固体培养基:蛋白胨 10 g; 酵母粉 5 g; N aC l
8 g;琼脂 15 g;蒸馏水 1 000mL; pH 7. 0- 7. 2。KB
培养基:蛋白胨 20 g; K2HPO4 H 2O 1. 5 g; M gSO 4
7H2O 1. 5 g;甘油 15. 0 mL;琼脂 15 g;蒸馏水 1 000
mL; pH7. 2。R2A培养基: 酵母粉 0. 5 g;蛋白胨 0. 5
g;酸水解酪素 0. 5 g;葡萄糖 0. 5 g;可溶性淀粉 0. 5 g;
丙酮酸钠 0. 3 g; K2HPO4 H 2O 0. 3 g; MgSO4 7H2O
0. 05 g;琼脂 15 g;蒸馏水 1 000mL; pH7. 2。
1. 3 PCR扩增所用试剂
PCR反应体系购自 Fermentas公司, 引物 799f[ 7]、
1492r
[ 8]由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。
1. 4 应用培养方法对薄荷根内生及根际细菌的分
离与纯化
取薄荷根 1 g, 用无菌水冲洗, 滤纸吸收水分。
依次用 70%乙醇浸泡 3 m in, 2. 6%次氯酸钠浸泡
3 m in, 70%乙醇浸泡 30 s, 无菌水淋洗 5- 7次, 在
无菌条件下晾干。同时取最后 1次淋洗水 100 L
涂于 LB固体培养基上轻压涂抹 1次, 28 培养
72 h,检测表面灭菌效果。将表面灭菌处理后的薄
荷根置灭菌研钵中研磨成粉末,按 1!9的比例加灭
菌水,研磨成浆后再按 1!9的比例逐步稀释, 最终稀
释浓度为 105倍。
取根际土 1 g,放入装有玻璃微珠的锥形瓶中,
按 1!9的比例加入无菌水,置于摇床上 200 r/m in摇
30m in,使其充分悬浮,取出静置 20m in沉降固体颗
粒。吸取上清 1 mL, 按 1!9的比例逐步稀释, 最终
稀释浓度为 105倍。
取不同稀释浓度的匀浆液 100 L于 LB培养
基、KB培养基和 R 2A培养基, 用灭菌玻璃涂棒涂抹
均匀,不同浓度和不同的培养基各做 3个重复, 于
28 培养。记录每个平板上菌落的数量, 同时根据
菌落形态 (大小、形状、颜色、表面光泽等 )挑取有差
异的菌落在相同培养基平板进行划线纯化培养, 纯
化后的细菌接种于相应培养基斜面上, 4 保存
备用。
1. 5 16S rDNA菌落 PCR扩增
用无菌牙签挑取少许已纯化的菌体重悬于 20
L灭菌 ddH2O中, 100 煮沸 10 m in后,迅速冰浴
2m in, 4 12 000 r /m in离心 5 m in备用。为保证
PCR效果,每次用前均离心 1次。取 3 L上清液用
于 50 L PCR反应体系。
采用本研究室新近建立的方法 [ 9]合成初步扩
增细菌 16S rDNA的引物 ( 799,f 1492r)序列分别为
正向引物 799 f( 5∀AACAGGATTAGATACCCTG3∀),
反向引物 1492r( 5∀GGTTACCTTGTTACGACTT3∀),
扩增片段长度约为 730 bp。 PCR 扩增体系 ( 50
L) : 3 L基因组 DNA, 2. 5 mmo l/L dNTP混合物,
10 pmol /L正、反向引物, 1. 25 U Taq DNA聚合酶
( Ferm entas), 5 L反应缓冲液 ( 10 # buffer)。 PCR
反应程序: 94 4 m in; 94 3 s, 52 30 s, 72 30
s, 30个循环; 72 10 m in。反应结束后, 取 3 L
PCR产物在 1%的琼脂糖凝胶上进行电泳检测。
1. 6 细菌 16S rDNA序列测定与同源性比对
PCR产物由公司采用型 DNA测序仪测序,将测
序得到的结果在 NCB I进行 blastn比对,寻找具有较
高同源关系的 16S rDNA序列。用 CLU STAL X [ 10]
做多序列比对, MEGA ( version 4. 0)软件做系统发育
105
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
及分子进化分析 [ 11]。
1. 7 应用非培养方法建立薄荷根内生及根际细菌
的克隆文库
薄荷根按照上述的方法进行同样的表面灭菌处
理,根际土不经过表面灭菌。DNA提取采用传统的
CTAB法提取。提取出的基因组 DNA在 1%的琼脂
糖凝胶上进行电泳鉴定, 取 3 L基因组 DNA作为
50 L PCR反应体系的模板。 PCR扩增的引物为上
述的 799 f和 1492r。 PCR反应体系和扩增条件与上
述 16S rDNA菌落 PCR相同。将全部 PCR产物在
2% 的琼脂糖凝胶上进行电泳, 用胶回收试剂盒
( T iangen公司 )回收目的条带, 回收产物用快速连
接转化试剂盒 ( T ransgen公司 )进行连接转化,挑取
150个阳性克隆由公司采用 DNA测序仪测序。将
测序结果在 NCB I上进行 blastn比对,寻找具有较高
同源关系的 16S rDNA序列。用 CLUSTAL X做多序
列比对, MEGA ( version 4. 0)软件做系统发育及分子
进化分析。
2 结果与分析
2. 1 薄荷根内生细菌培养方法分离结果
将表面灭菌的根进行内生细菌的分离, 通过对
平板上的细菌进行菌落计数,得到不同培养基上菌
落分布情况 (表 1), 其中在 R2A培养基上分离得到
的细菌数量最多,为 8. 4 # 106 CFU /g鲜重, 在 LB培
养基上分离得到的细菌数量最少, 为 7. 9 # 105
CFU /g鲜重。
表 1 薄荷根内生细菌分布情况
培养基 细菌菌落数 ( CFU /g鲜重 )
LB 7. 9# 105
KB 1. 8# 106
R2A 8. 4# 106
2. 2 薄荷根际细菌培养分离结果
将根际土进行细菌分离, 通过对平板上的细
菌进行菌落计数, 得到不同培养基上菌落分布情
况 (表 2) , 其中在 R2A培养基上分离得到的细菌
数量最多, 为 7. 5 # 105 CFU /g鲜重,在 LB培养基
上分离得到的细菌数量最少, 为 1. 7 # 105 CFU /g
鲜重。
表 2 薄荷根际细菌分布情况
培养基 细菌菌落数 ( CFU /g鲜重 )
LB 1. 7# 105
KB 6. 3# 106
R 2A 7. 5# 106
2. 3 细菌 16S rDNA PCR扩增
通过培养方法在薄荷根中共分离纯化到 42
株细菌, 在根际土中共分离纯化得到 50株细菌 ,
将它们用 799 f1492r这对引物进行 16S rDNA片
段扩增, 得到长度约为 730 bp的扩增片段, 该片
段不仅作为细菌分类鉴定的分类标准之一, 还可
成功地避开植物细胞器小亚单位核糖体 DNA的
干扰 [ 12 ]。
2. 4 基因组 16S rDNA PCR扩增
用 799 f1492 r这对引物对薄荷根际及根内生
细菌基因组 DNA进行 16S rDNA片段扩增, 得到
长度约为 730 bp的细菌 16S rDNA片段 (图 1)的
同时还扩增出 1 000 bp左右的薄荷线粒体 18S
rRNA基因片段。
1. m arker; 2- 4.根际; 5- 8根内生
图 1 根际及根内生细菌基因组 16S rDNA PCR电泳图谱
2. 5 薄荷根内生细菌多样性分析
2. 5. 1 培养方法分离的薄荷根内生细菌多样性分
析 通过对薄荷根中分离出来的菌株进行测序和同
源性比较以及系统发育分析, 得到了薄荷根细菌群
落多样性的初步信息,得到 A lphap roteobacteria、Gam
map roteobacteria、Actinobacteria、Sphingobacteria、F la
vobacteria、Bacilli六大类群细菌, 其中优势种类为
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2010年第 10期 梁越等 :薄荷根内生及根际细菌多样性探究
Gammapro teobacteria ( 42% ), 表 3和图 2分别为培养
方法分离的薄荷根内生细菌 16S rDNA序列相似性
分析及系统发育树。
表 3 培养方法分离薄荷根内生细菌 16S rDNA序列相似性分析
类群 属 代表菌株 菌株数 最相近菌种 (登录号 ) 序列相似性 (% )
GenBank
登录号
Alphaproteobac teria S inorh izobium GL4 6 En sifer sp. MHS020( DQ993332 ) 100 GU391612
GR6 1 S inorh izobium m orelen se strain LMG 21331(AM 181737) 98 GU391617
GR10 2 Sphing om onas sp. A113( AY512602) 99 GU391619
GR12 1 Sphing opyx is sp. G eo48( EU816422 ) 99 GU391621
Gammaproteoba c
teria
P seudomona s GK3 2 P seud om onas sp. VTT E052911( DQ465010 ) 99 GU391602
GK15 2 P seud om onas sp. VET8 ( EU781734 ) 99 GU391606
GL3 2 P seud om onas sp. CL1805( DQ857753) 99 GU391611
GR16 1 P seud om onas sp. R25209( AM 084037 ) 99 GU391623
GR23 2 P seud om onas pu tida stra in AVO 102 ( EF153392 ) 99 GU391625
En teroba cter GK1 1 En terobacter sp. 2B1E ( EU 693570) 99 GU391601
A erom ona s GK5 1 Aeromona s punc ta ta strain 694c( FJ168772) 99 GU391604
S tenotroph
omona s
GK20 2 S ten otrophom ona sm altoph ilia isolate BRL026B (DQ339642) 99 GU391610
A cinetoba cter GR1 1 Acinetobacter jun ii isolate SCH0409( AY881242 ) 98 GU391615
P seudoxan
thom onas
GR3 5 P seud oxan thom ona s sp. R24339 (AM231052) 99 GU391616
Ce llv ibrio GR14 2 C ellvibrio vulg aris strain NC IMB 8633 (NR_025209) 99 GU391622
Ac tinobacteria M icrobacterium GK4 2 M icrobacterium pa ludicola type strain US15T (A J853909) 99 GU391603
GL7 5 M icrobacterium sp. M I2b ( EU889242) 99 GU391613
M icrococcu s GL10 1 K ocu ria ma rina strain Inje LM M 070128( FJ789660 ) 99 GU391614
S trep tomyces GR20 5 S treptomyces v irg iniae( DQ102715) 100 GU391624
Ba cilli Baci llu s GK16 2 Ba cillu s sp. S21032( D84570 ) 99 GU391607
F lavobac teria Chryseobac terium GK6 2 Chry seoba cterium taeanense strain PHA34( AY883416) 98 GU391605
GK17 1 Chry seoba cterium oranim en se s train H8 ( EF204451) 99 GU391608
Sphing oba cteria Sphing obacterium GK18 1 Sphing oba cterium sp. p11E (A J496037) 98 GU391609
2. 5. 2 非培养方法分离的薄荷根内生细菌多样性
分析 通过构建克隆文库, 得到了更多薄荷根细菌
群落多样性的信息, 得到 A lphap roteobacteria、B etap
ro teobacteria、Gammaproteobacteria、D eltaproteobacte
ria、A ctinobacteria、Bacteroidia、Sphingobacteria、C los
trid ia、Uncultured bacterium九大类群细菌, 其中优势
种类为 Gammaproteobacteria ( 26% ), 表 4和图 3分
别为非培养方法分离的薄荷根内生细菌基因组 16S
rDNA序列相似性分析及系统发育树。
2. 6 薄荷根际细菌多样性分析
2. 6. 1 培养方法分离的薄荷根际细菌多样性分
析 通过对薄荷根际土中分离出来的菌株进行
测序和同源性比较以及系统发育分析, 得到了薄
荷根际细菌群落多样性的初步信息, 得到 A lpha
proteobacteria、Gammap ro teobacteria、Bacilli、F la
vobacteria, 其中优势种类为 Bacilli( 31% ),表 5和图
4为培养方法分离的薄荷根际细菌 16S rDNA序列相
似性分析及系统发育树。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
图 2 培养方法分离得到的薄荷根内生细菌 16S rDNA部分序列系统发育分析
表 4 非培养方法分离薄荷根内生细菌 16S rDNA序列相似性分析
类群 属 代表菌株 菌株数 最相近菌种 (登录号 ) 序列相似性 (% )
GenBank
登录号
Alphaproteoba cteria BG75 2 Alpha proteobac terium Sh in shuth1( AB121772) 97 GU391676
Ag robacterium BG54 3 Ag robacterium radiobacter part ial strain LMG 140(AM181758) 99 GU391666
Brevund im onas BG50 1 B revund im ona s kwangchunensis strainKSL110( AY971369 ) 95 GU391664
P seudolabry s BG39 2 P seud olabrys taiwan en sis stra in CCBB4 (DQ062742) 95 GU391663
Rh izob ium BG4 4 Rh izobium sp. ORS 1439( AY500257 ) 98 GU391646
BG104 3 Rh izobium sp. RZ6( EF437254 ) 95 GU391687
S inorh izobium BG8 4 S inorh izobium sp. 9702M 4( AF357225 ) 98 GU391648
Sph ing om onas BG9 3 Sphing om onas sp. PW1 (AB255386 ) 98 GU391649
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2010年第 10期 梁越等 :薄荷根内生及根际细菌多样性探究
续表
类群 属 代表菌株 菌株数 最相近菌种 (登录号 ) 序列相似性 (% )
GenBank
登录号
BG80 1 Sphing om onas sp. P55 (AB288313 ) 99 GU391678
BG99 2 Sphing om onas sp. SBK16( AB366357) 98 GU391685
B etaproteoba cteria BG128 3 B eta proteobac terium ASRB1 (AY612302) 99 GU391695
Georgfuchsia BG29 1 G eorgfuchsia toluolica stra in G5G6( EF219370) 97 GU391659
Hyd rog en ophaga BG111 1 Hydrogenophaga interm ed ia s train S1( NR_024856 ) 99 GU391688
BG67 1 Hydrogenophaga sp. AH24 (AB300163) 97 GU391675
M ethylovorus BG114 3 M ethy lov oru sm ays strain C ( AY486132 ) 99 GU391689
M ethylotenera BG3 1 M ethy loten eram obi lis strain JLW 8( DQ287786 ) 99 GU391645
Gammaproteoba c
teria
BG14 4 Ba cterium E ll in339 (AF498721) 96 GU391651
A ren inm onas BG34 2 Aren im ona sm al thae strain CCJY1( DQ239766 ) 96 GU391662
Ce llv ibrio BG21 3 C ellvibrio vulg aris strain NC IMB 8633 (NR_025209) 98 GU391656
Dyel la BG121 1 Dye lla sp. SB I25 (AB366319 ) 95 GU391691
P seudomona s BG23 13 Gamma proteobac terium Y134( AB096215) 94 GU391657
BG93 7 Sym bion t LP 3 of Lyrodus ped icella tu s( AY150578) 95 GU391683
P seudoxan
thomona s
BG123 6 P seud oxan thom ona s sp. R24339 (AM231052) 99 GU391692
Rhodanobacter BG84 2 Rhodanobac ter sp. LAA2009i12 ( FN298498) 96 GU391679
S teroidobacter BG15 1 S teroid obac ter d en itrif icans strain FS( EF605262 ) 98 GU391652
Deltaproteobacteria Bac teriovorax BG1 3 Ba cteriovorax sp. EPC3 (AY294222) 95 GU391644
BG120 1 Ba cteriovorax sp. PNEc1 (AY249222) 98 GU391690
Ac tinobacteria L eif son ia BG16 2 L eif sonia g in seng istrain w ged11 (DQ473536) 97 GU391653
Ba cteroid ia P a ludiba cter BG102 3 Pa lud ibacter propion ic igenes( AB078842) 94 GU391686
C lostrid ia P eptoniph ilu s BG90 3 P epton iph ilus harei stra in DSM 10020( NR_026358) 99 GU391681
Sphing oba cteria N iaste lla BG20 5 N iastella koreen sis strain GR2010 (DQ244077) 97 GU391655
BG64 2 N iastella yeongju en sis stra in GR2013( DQ244076 ) 99 GU391673
Uncu ltured bacte
rium
BG6 4 Uncultured bacterium clone p27 c17 ok( FJ479173 ) 99 GU391647
BG17 2 Uncultured bacterium clone FCPT518( EF516395) 97 GU391654
BG24 3 Uncultured bacterium clone GL_DU13( FJ203903 ) 96 GU391658
BG30 4 Uncultured bacterium clone M40C27( EU 331399) 94 GU391660
BG53 9 Uncultured bacterium clone p7k12ok ( FJ478537) 98 GU391665
BG57 5 Uncultured bacterium clone LC34 ( FJ715997) 94 GU391667
BG59 10 Uncultured bacterium clone p26 e23 ok( FJ478778 ) 98 GU391668
BG60 2 Uncultured bacterium clone 202( DQ158102 ) 94 GU391669
BG61 2 Uncultured bacterium clone SS78( AY945881) 97 GU391670
BG88 6 Uncultured bacterium clone p26k17ok ( FJ479496) 99 GU391680
BG98 5 Uncultured bacterium cloneNB05( AB117709) 96 GU391684
BG125 5 Uncultured bacterium clone p9 i23 ok( FJ479170 ) 97 GU391693
109
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
图 3 非培养方法分离得到的薄荷根内生细菌 16S rDNA部分序列系统发育分析
110
2010年第 10期 梁越等 :薄荷根内生及根际细菌多样性探究
表 5 培养方法分离薄荷根际细菌 16S rDNA序列相似性分析
类群 属 代表菌株 菌株数 最相近菌种 (登录号 ) 序列相似性 (% )
GenBank
登录号
Alphaproteobac teria Sph ing om onas KT11 2 Sphing om onas sp. XLDN25( EF062503) 99 GU391626
N ovosph ingobium KT36 1 N ovosph ingobium subarct icum ( AY151394) 99 GU391633
Gammaproteoba c
teria
P seudomona s KT12 3 P seud om onas sp. PD 16 ( DQ377757) 99 GU391627
KT22 9 P seud om onas sp. B IH B 811 ( DQ 885950) 99 GU391629
LT7 1 P seud om onas sp. SMCC D0715 (AF336311) 99 GU391639
Ba cilli Baci llu s KT13 9 Ba cillu s sim plex strainWN579( DQ275178 ) 99 GU391628
KT27 2 Ba cillu s sp. S23440( D84630 ) 99 GU391631
KT34 4 Ba cillu s sp. L244 (AM913937) 97 GU391632
KT37 6 Ba cillu s sp. S21032( D84570 ) 99 GU391634
T erribaci llu s LT1 2 Terriba cillu s saccharoph ilu s s train RB589 (AB243847) 99 GU391635
P lanom icrobium LT5 1 P lanom icrobium koreense strain JG07 (NR_025011) 98 GU391637
F lavobac teria F lavobacterium RT1 1 F lavobac terium frig oris strain R9014( NR_025597) 98 GU391640
RT3 1 F lavobac terium d ef luvii strain EM B117 (DQ372986) 98 GU391641
图 4 培养方法分离得到的薄荷根际细菌的 16S rDNA部分序列系统发育分析
111
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
2. 6. 2 非培养方法分离的薄荷根际细菌多样性分析
通过构建克隆文库,得到了更多薄荷根际土细菌群
落多样性的信息, 得到 A lphaproteobacteria、B etapro
teobacteria、Gammaproteobacteria、Deltaproteobacteria、Acti
nobacteria、Bacilli、Bacteridia、Sphingobacteria、Uncul
tured bacterium九大类群细菌,其中优势种类为 Bacilli
( 28% ),表 6和图 5为非培养方法分离的薄荷根际细
菌基因组的 16S rDNA序列相似性分析及系统发育树。
表 6 非培养方法分离薄荷根际细菌 16S rDNA序列相似性分析
类群 属 代表菌株 菌株数 最相近菌种 (登录号 ) 序列相似性 (% )
GenBank
登录号
Alphaproteobac teria H 71 3 Antarctic bacterium R10753( A J440974 ) 98 GU391731
H 72 2 Alpha proteobac terium Sh in shuth1( AB121772) 96 GU391732
Amaricoccus H 55 1 Ama ricoccus kap licensis strain Ben101( NR _029201) 94 GU391725
Am inobacter H 136 1 Am in obac ter am inovorans strain DSM7048( NR _025301) 95 GU391759
A sticcacauli s H 10 1 Asticca cau lis excentricu s strain DSM 4724 (T ) (A J247194 ) 95 GU391703
A zospirillum H 21 1
Cand ida tus Azosp iri llum massilien sis s train URAM1
( EF394925 )
98 GU391706
Chela tivorans H 42 2 Ch ela tiv oran sm ul titroph icu s strain DSM 9103 ( EF457243) 97 GU391718
D evosia H 52 1 Devosia ribof lavina strain DSM 7230(A J549086) 98 GU391723
Hyphom ona s H 18 2 Hyph om onas polym orpha strain DSM ( NR _025325) 99 GU391704
Hyphom icrobium H 63 2 Hyphom icrobium holland icum strain IFAM KB677(NR_026428) 96 GU391726
K a istoba cter H 101 1 K a istobacter terrae (AB258386) 97 GU391743
Ocean icola H 6 2 Ocean icola marinu s strain AZOC (DQ822569) 97 GU391700
Rhodobac ter H 2 2 Rhod oba cter chang lensis strain JA139T (AM399030) 98 GU391697
S inorh izobium H 109 2 S inorh izobium sp. R25078( AM 084032 ) 99 GU391747
Sph ing om onas H 43 1 Sphing om onas sp. MG49( AJ746106) 98 GU391719
Tha la ssospira H 24 1 Thalassosp ira sp. DBT2( DQ659435 ) 98 GU391708
B etaproteoba cteria H 22 2 Ba cterium E ll in6067 (AY234719) 96 GU391707
H 25 4 B eta proteobac terium EC4( AY337598) 95 GU391709
Georgfuchsia H 84 1 G eorgfuchsia toluolica stra in G5G6( EF219370) 98 GU391737
M ethyloversa tillis H 34 1 M ethy lov ersa tilis universali s(AY436796) 99 GU391714
Variovorax H 50 1 Variovorax sp. WDL1 (AF538929) 97 GU391722
Gammaproteoba c
teria
H 31 2 Gamma proteobac terium HTB143( AB010845) 98 GU391713
A lcan ivorax H 77 1 Alcanivorax venu stensis strain ISO4( NR_025145) 99 GU391733
A ren inm onas H 146 1 Aren im ona sm al thae strain CCJY1( DQ239766 ) 98 GU391763
Ce llv ibrio H 147 2 C ellvibrio g andavensis strain R4069( NR_025419 ) 98 GU391764
D okdon ella H 68 1 Dokd onella fug itiva s train A3T (A J969432) 95 GU391729
Ha lom onas H 92 1 H alom onas sp. G27( EF554887) 98 GU391740
L eg ion ella H 150 1 Am oeba proteu s sym biot ic bacterium ( AY598719 ) 96 GU391765
Lysobacter H 41 1 Lysobac ter daejeonensis strain GH 19 (DQ191178) 97 GU391717
112
2010年第 10期 梁越等 :薄荷根内生及根际细菌多样性探究
续表
类群 属 代表菌株 菌株数 最相近菌种 (登录号 ) 序列相似性 (% )
GenBank
登录号
M ethylophaga H 80 1 M ethy lophaga sp. DM S043 ( DQ660928) 99 GU391735
P an toea H 1 1 Pan toea sp. LY1( DQ869046 ) 99 GU391696
P seudomona s H 4 7 P seud om onas arg en tin en sis stra in CH 01 (AY691188) 99 GU391699
H 85 4 Gamma proteobac terium Y134( AB096215) 94 GU391738
H 96 3 P seud om onas sp. VI71( FN377741 ) 99 GU391741
H 125 1 P seud om onas pseud oalcal igenes stra in 14( AB276371) 98 GU391755
P seud id iomarina H 120 2 P seud id iom arina d onghaiensis s train 908033( EU600204) 96 GU391751
P seudoxan
thomona s
H 88 2 P seud oxan thom ona s sp. R24339 (AM231052) 99 GU391739
Rheinheim era H 29 1 Rh einhe im era sp. BDd46( EF575565) 99 GU391711
H 36 1 Gamma proteobac terium HTB019( AB010860) 99 GU391715
H 37 1 Curaca obac ter bal tica OS 140( AJ002006) 97 GU391716
H 53 2 Rh einhe im era aqu im aris s train SW369( EF076758) 96 GU391724
X an thom onas H 65 4 X an thom onadaceae bacterium E llin7015( AY673181 ) 95 GU391728
Deltaproteoba cteria P ered ibacter H 7 3 P ered ibac ter starri i stra inA3. 12 (NR _024943) 98 GU391701
Ac tinobacteria L eif son ia H 70 4 L eif sonia g in seng i strain wged11( DQ473536 ) 97 GU391730
M icrobacterium H 137 5 M icrobacterium kera tan olyticum strain OU01( DQ118082) 99 GU391760
Ba cteridia P revotel la H 127 2 P revotella tim on ensis stra in 4401737 ( DQ518919) 95 GU391756
Ba cilli Baci llu s H 79 15 Ba cillu s sp. MB7( AF326364 ) 99 GU391734
H 110 6 Ba cillu s asah ii stra inMA001 (NR_024817) 98 GU391748
H 141 2 Ba cillu s sp. JL31( AY745869 ) 99 GU391761
P lanococcu s H 30 11 P lanococcus rif ie toen sis( EF622537 ) 99 GU391712
H 46 9 P lanococcus sp. T ibetIX21( DQ177487 ) 99 GU391720
Sphing oba cteria Echinicola H 82 1 E ch in icola v ietnam ensis strain LMG 23754T( AM 406795 ) 98 GU391736
N iabel la H 123 3 N iabe lla g inseng isoli strain GR101 ( EU616816 ) 97 GU391754
Uncu ltured bacte
rium
H 3 4 UnculturedN ovosph ingob ium sp. clone B29( EU 360289) 94 GU391698
H 9 2 Uncultured bacterium clone 10185 ( EF157177) 96 GU391702
H 20 3 Uncultured bacterium clone Lc2 z_ML_271 ( FJ355328) 95 GU391705
H 28 2 Uncultured bacterium clone 3C002567 ( EU801307 ) 94 GU391710
H 107 1
UnculturedA cidobacteria bacterium clone
NC117 /KF101( EF141953 )
99 GU391746
H 113 2 Uncultured bacterium clone TX5A_101( FJ152809) 98 GU391749
H 121 1 Uncultured bacterium clone Lc2_M L_023( FJ354548 ) 97 GU391752
H 122 2 M arine bac terium SCR IPPS_94( AF359545) 98 GU391753
H 135 2 Uncultured bacterium clone nbw 431e06c1 (GQ 094601) 95 GU391758
113
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 10期
图 5 非培养方法分离得到的薄荷根际细菌的 16S rDNA部分序列系统发育分析
114
2010年第 10期 梁越等 :薄荷根内生及根际细菌多样性探究
3 讨论
通过对薄荷研究发现,其根内及根际具有丰富
的微生物资源。利用培养方法与非培养方法分离得
到薄荷根内生细菌及根际细菌一些共有的细菌种
类,但前者优势种群为 g变形杆菌, 后者优势种群为
芽孢杆菌,说明土壤细菌, 特别是根际细菌是植物内
生细菌的重要来源, 但植物对其内生细菌具有选择
压。所以在今后探讨植物与微生物相互作用关系
时,要考虑土壤环境, 特别是根际对其影响的同时,
更加重视植物与其相关联的细菌种类的选择作用。
在研究过程中我们发现可培养的内生细菌在不同培
养基上的组成有所不同。分离细菌的系统发育分析
表明, 分离培养过程中使用不同的培养基有助于得
到较多不同属的细菌。同一样品在不同培养基上生
长的菌落数和种群量有所不同,该结论与本研究室
之前对杂交水稻固有细菌多样性研究中的结果一
致 [ 1]。所以, 研究更加适合与植物相联合的细菌分
离和生长的培养基对用培养方法研究植物相联合的
细菌显得十分重要。
采用非培养方法, 直接在分子水平上对分离得
到的微生物多样性进行分析。非培养方法通过分子
水平上的研究,直接探讨植物内生和根际细菌的种
群结构及其与环境的关系, 在一定程度上克服了传
统培养方法的缺欠, 使我们可更全面地了解植物微
生态系统中微生物多样性及其物种组成。但非培养
方法也存在着自身的缺陷, 例如样品的制备及引物
设计等方面,本研究室也做过相应的报道 [ 13]。
本研究分离得到大量的植物有益细菌, 可以应
用于开发新型微生物肥料、研制高效微生物农药、作
为细菌接种剂促进农作物生长,通过微生物降解来
治理环境,改善农业生态环境。在分离的培养物中,
发现了分类地位不同,功能各异的类群。
本研究首次对我国常用中药之一的薄荷植物的
根内生及根际细菌进行了初步探究, 获得了根内生
和根际细菌群落结构的重要信息, 可以深入了解菌
株与薄荷植物根和与其相联合的细菌群落的相互作
用, 进一步探索它们随植物的生长发育过程中细菌
群落的变化情况, 从而为进一步了解植物的根系为
生态环境中的微生物群落的形成、结构及功能的动
态变化提供第一手资料, 对植物微生态领域开展研
究具有重要的参考价值,同时也为更好地发展、保护
祖国传统医药植物提供新的思路和途径。
参 考 文 献
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