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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
菌种 11371 16S rRNA序列分析及鉴定
陈飞 吴红艳 桓明辉 关艳丽 郭玲玲 于广峰
(辽宁省微生物科学研究院，朝阳 122000)
摘 要: 通过 PCR方法扩增菌种 11371 的 16S rRNA基因并测序，将序列提交 GenBank(登录号:DQ531606) ，并与其他
链霉菌属种进行比较，通过 DNAStar软件得到菌种 16S rRNA 基因序列进化树。同时采用插片法、显微镜观察等方法对株菌
11371 进行形态特征、培养特征、生理生化特征鉴定。结果表明，11371 的 16S rRNA 序列与其他链霉菌具有一定的同源性，结
合生理、生化指标鉴定结果，进一步确定菌种为不吸水链霉菌一株新亚种(Streptomyces ahygroscopicus subsp． wuzhouensis n． sub-
sp．) ，菌株 11371 16S rRNA序列为 GenBank中首例 Streptomyces ahygroscopicus的 16S rRNA序列。
关键词: 链霉菌 16S rRNA基因 同源性
16S rRNA Gene Sequence Analysis of Streptomyces 11371
Chen Fei Wu Hongyan Huan Minghui Guan Yanli Guo Lingling Yu Guangfeng
(Liaoning Scientific Academy of Microbiology，Chaoyang 122000)
Abstract: Streptomyces (No． 11371)isolated from the forest soils of Wuzhou town of Guangxi was identified by morphological，cul-
tural and 16S rRNA sequence analysis． Gene sequence of 16S rRNA was determined by PCR，the result of which was sent into GenBank
(No． DQ 531606) ，and compared with other strain of Streptomyces based on phylogenetic tree． 11371 showed similarity with other Strep-
tomyces，combining identification index of physiology and biochemistry，therefore，it confirms that 11371 is a new subsp of Streptomyces
ahygroscopicus，named as Streptomyces ahygroscopicus subsp． wuzhouensis n． subsp．，also，16S rRNA of 11371 is the first sequence of
Streptomyces ahygroscopicus in GenBank．
Key words: Streptomyces 16S rRNA gene Similitude
收稿日期:2010-09-27
作者简介:陈飞，副研究员，研究方向:微生物工程;E-mail:chenfei3033@ vip． sina． com
辽宁省微生物科学研究院在广西梧州地区土样
中分离得到一株菌，编号为 11371。该菌株产生对
真菌有较强抑制作用的抗生素，应用该菌种发酵液
防治苹果树腐烂病的田间试验结果表明，防治效果
可达 90%以上。本研究对 11371 16S rRNA 基因克
隆、测序和分析，结合该菌种形态特征、培养特征、生
理生化特征进一步确定该菌种与相关菌株的亲缘
关系。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 菌株 辽宁省微生物科学研究院菌种保藏
中心保藏。
1． 1． 2 试剂 PCR 试剂盒，TaKaRa 公司;PCR 产
物纯化试剂盒，Promega 公司;溶菌酶、Tris、SDS 及
培养基配制相关试剂等均为国产。
1． 2 方法
1． 2． 1 形态特征观察 采用插片法，用日本 Olym-
pus显微镜观察。
1． 2． 2 生理生化特征 参照《链霉菌鉴定手册》［1］
进行生理生化分析。
1． 2． 3 培养特征 采用链霉菌鉴定常规的［1］和国
际链霉菌计划(ISP)［2］建议的 11种培养基培养观察。
1． 2． 4 16S rRNA的扩增和聚类分析
1． 2． 4． 1 11371 基因组 DNA 的提取 将活化的
11371 菌种按照 1 ∶ 100 比例接种于 LB 培养基中，
30℃培养 24 h，提取基因组 DNA［3］。
1． 2． 4． 2 11371 16S rRNA扩增引物的制备及 PCR扩
增反应 利用大肠杆菌 16S rRNA 通用引物:P8 － 27:
2011 年第 3 期 陈飞等:菌种 11371 16S rRNA序列分析及鉴定
AGAGTTTGATCATGGCTCAG，P1492 － 1509:GGTACCTT-
GTTACGACTT进行 11371 16S rRNA基因克隆，引物
由北京赛百盛基因技术有限公司合成。
利用 PCR反应试剂盒，以基因组 DNA 模板，在
型号为 Systems 2700 PCR 仪进行 PCR 反应。PCR
反应程序:首先 95℃ 5 min 预变性，然后 94℃
2 min，55℃ 1 min，72℃ 1． 5 min，反应 30 个循环;最
后 72℃ 10 min。
1． 2． 4． 3 PCR 产物纯化及测序 按照 Promega 公
司 DNA Purificationg system 使用说明书进行 PCR产
物纯化。PCR 纯化产物由宝生物工程(大连)有限
公司测序。
1． 2． 4． 4 测序结果分析 在美国 NCBI 数据库和
德国 DMSZ数据库查询链霉菌属标准菌株 27 株的
16S rRNA序列，未发现数据库中有 Streptomyces ahy-
groscopicus亚种的 16S rRNA序列，因此序列分析只
在链霉菌属标准菌株间进行。利用 DNAStar进行进
化分析，得到 11371 16S rRNA基因序列进化树。
2 结果
2． 1 形态特征
孢子丝分枝，形成圈数不等的螺旋，螺旋多松敞
(图 1) ;孢子卵形或椭圆形，在电子显微镜下观察，
孢子表面有长刺(图 2)。
2． 2 生理生化特性
明胶液化快;牛奶不凝固，胨化快;水解淀粉;纤
维素上不生长;不产生硫化氢。利用葡萄糖、阿拉伯
糖、果糖、蔗糖、肌醇、甘露醇和半乳糖;不利用鼠李
糖、乳糖、菊糖;木糖和棉子糖利用可疑。
2． 3 培养特征
在 11 种培养基上的培养特征见表 1。11371 在
链霉菌鉴定常规［1］和国际链霉菌计划(ISP)［2］建议
的 11 种培养基上均无吸水现象。
图 1 11371 菌丝体(2 000 ×) 图 2 11371 孢子(10 000 ×)
表 1 11371 的培养特征
培养基 气生菌丝体 基内菌丝体 可溶性色素
高氏培养基一号琼脂 近灰色到褐色，有次生白班，绒状，丰茂 沙石黄，下部有丁香棕，淡咖啡色 淡驼色
察氏蔗糖琼脂 淡褐色，生长极薄 无色至米色，极薄 无
葡萄糖天门冬素琼脂 中灰驼至深褐色，有次生白班，绒状 土黄 炒米黄、沙石黄
克氏合成一号琼脂 淡铁灰、深褐色，绒状，丰茂 炒米黄，沙石黄、风帆黄 豆汁黄、甘草黄
酵母膏琼脂 淡铁灰到灰色，有次生白班，绒状厚 槟榔棕、局部可可棕 浅风帆黄到山鸡褐
马铃薯块 中灰驼至暗褐色，有次生白班，绒状，丰茂 桂皮淡棕，薯块灰黑 浅桂皮色、淡棕色
燕麦粉琼脂 浅犀角灰、厚绒状，少数白斑 浅驼色 玳瑁黄
甘油天门冬素琼脂 白色到深褐色，有次生白班，绒状厚 浅槟榔棕、灿棕 浅沙石黄
无机盐沉淀琼脂 淡铁灰、褐灰、绒状薄 无色到浅驼色 无，象牙黄
甘油苹果酸钙琼脂 蚌肉白 风帆黄 浅软木黄
酪氨酸琼脂 淡银灰，下部海鸥灰深褐灰斑 豆汁黄、象牙黄 无
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
2． 4 11371 基因组 DNA电泳结果
取 11371 基因组 DNA 2 μL，进行 1%琼脂糖凝
胶电泳，结果见图 3。
2． 5 PCR产物电泳结果
4 取 PCR 产物 4 μL 进行 1%琼脂糖凝胶电
泳，结果见图 4。
2． 6 PCR产物纯化电泳结果
利用 Promega 公司纯化试剂盒进行 PCR 产物
纯化，结果如图 5 所示。
1．基因组 DNA;2． DGL2000 marker
图 3 基因组 DNA
1． DGL2000 marker;2． PCR产物;3．对照组
图 4 PCR产物电泳图谱
1．经纯化的 16S rRNA;2． DGL2000 marker
图 5 PCR产物纯化后电泳图谱
2． 7 PCR纯化产物测序结果
宝生物工程(大连)有限公司利用纯化的 PCR
产物直接测序，GenBank登录号为 DQ531606，序列如
图 6 所示。
图 6 11371 16S rRNA基因测序结果
2． 8 11371 16S rRNA基因序列进化树图谱及相似
性比较
利用 DNAStar分析软件，进行进化树分析和相
似性比较，结果如图 7 所示。
3 讨论
被称为细菌“活化石”的 rRNA基因，具有高度
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2011 年第 3 期 陈飞等:菌种 11371 16S rRNA序列分析及鉴定
图 7 11371 16S rRNA基因进化树
保守性，其进化速度十分缓慢，推算 1%的 16S rRNA
基因的取代，需要经过 50 × 108年的漫长岁月。在生
物进化过程中，原核生物保留了 rRNA基因结构和功
能的同源性，同时，该基因经过不同程度地变异而具
株、属、种的特征。rRNA 基因存在于细菌染色体上，
包括 23S、16S及 5S 3个基因，由于 16S rRNA基因长
度合适，细菌进化亲缘关系越近，其 16S rRNA基因序
列相似程度越高，是目前最常被用作细菌的分类的核
酸序列，故有细菌分类“金指标”之称。
本研究在美国 NCBI 数据库和德国 DMSZ 数据
库查询链霉菌属标准菌株 27 株的 16S rRNA 序列，
未发现数据库中有 Streptomyces ahygroscopicus 亚种
的 16S rRNA序列，因此序列分析只在链霉菌属标
准菌株间进行。结果表明，其与链霉菌 Streptomyces
mycarofaciens和 Streptomyces albofaciens 的同源性达
98． 64%和 98． 50%。
11371 与不吸水链霉菌(S． ahygroscopicus)及井
冈山变种进行比较，结果显示，11371 在 11 种培养
基上均未见吸水，孢子丝分枝成螺旋，孢子表面带刺
及在 11 中培养基上的培养特征与不吸水链霉菌相
近，而区别于其他种。11371 与不吸水链霉菌及其
井冈山变种又有一定区别，即 11371 菌株在多种培
养基上呈现灰、褐灰，而井冈山变种成苏木紫灰、中
红灰和烟红灰［4］。
16S rRNA序列分析结合生理、生化鉴定结果，更
进一步确定了11371为不吸水链霉菌一新亚种，命名为
Streptomyces ahygroscopicus subsp． wuzhouensis n． subsp．。
参 考 文 献
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北京:科学出版社，1975．
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(责任编辑 李楠
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(责任编辑 狄艳红
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(责任编辑 李楠)
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