全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
增强 UVB辐射对小麦幼苗基因组 DNA的影响及
RAPD分析体系的建立
李苗 高丽美 李永锋 韩榕
(山西师范大学生命科学学院,临汾 041004 )
摘 要: 采用改进的 CTAB法提取小麦总基因组 DNA, 并以之为模板对 RAPD反应体系中的一些重要参数进行梯度试
验, 建立了一套适合本研究的最佳反应体系。即 25 L反应体系: 模板 DNA 20 ng、引物浓度 0 5 mo l/L、dNTPs浓度 200
mo l/L、Taq酶 0750 U。反应程序: 94 预变性 2 m in, 94 变性 30 s, 38 退火 30 s, 72 延伸 30 s, 30个循环, 72 延伸 10
m in, 4 保存。此外, 利用扩增结果稳定的引物对正常光照组及增强 UVB辐射处理组的小麦 DNA进行 RAPD分析。结果表
明, 增强 UVB辐射处理组的 DNA,经引物 S22、S40扩增后分别出现了分子量为 2 144 bp和 2 082 bp的差异条带,这能否从一
定程度上揭示 UVB对植物造成损伤的分子生物学机制,还有待进一步的研究。
关键词: 小麦 UVB辐射 CTAB法 RAPD分析 差异条带
Effect of Enhanced UVB Radiation on Genom ic DNA inWheat
Seedling and Establishment of RAPD Analysis System
L iM iao Gao L mi e i L iYongfeng H an Rong
(College of Life Sciences, Shanx iN ormal University, L infen 041004)
Abstrac:t The genom icDNA extracted by advanced CTAB me thod from the fresh leaves o f whea t seedling s, wh ich cou ld be used
for RAPD ana lysis as temp la te. During the research, them ain param eters in po lym erase cha in reac tion w ere studied by se tting g rad ient
in o rder to obta in an optim a l system fo r RAPD analysis. The proposal im proved w as as fo llow s, 25 L reaction system con ta ining
20 ng tem plate, 0 5 m o l/L prim ers, 200 m o l/L dNTPs, 0 75 U Taq po lym erase. The optim a l am p lification program w as as fo l
low s, 2 m in a t 94 , fo llowed by 30 cyc les of 30 s at 94 , 30 s at 38 , 30 s at 72 , and then a final ex tension at 72 for 10 m in.
Fo r furthe r study, the PCR products can be sto red in 4 fo r a long tim e. B esides, the dam aged whea t seedling s induced by enhanced
u ltrav io letB( 10 08 kJ m- 2 d- 1 ) radiation and the contro l ones w erem ade fo rRAPD ana ly sis using the sc reened random pr im ers
w hich can obta in reproduc ib le resu lts. The result show s that tw o spec ific bands o f 2, 144bp and 2, 082bp separa tedly occurred in the
UVB treatm ents am p lified w ith S22 and S40. The prob lem abou t the m o lecular m echan ism of the dam age induced by UVB still
needs further study.
Key words: W hea t U ltrav ioletB radiation CTAB m ethod RAPD analysis D iffe rent bands
收稿日期: 20091220
基金项目:国家自然科学基金 ( 30671061 ),山西省自然科学基金 ( 20080110591, 20041101)
作者简介:李苗,女,在读硕士研究生,研究方向:植物分子学; Em ai:l l im iao850829@ 163. com
通讯作者:韩榕,男,教授,博士,研究方向:环境植物学; Em ai:l hhw rs@l yahoo. com. cn
大气臭氧层的不断损耗使太阳光中到达地面的
紫外线 B (UVB, 280- 320 nm )辐射增强。由此,将
威胁到地球上生物的生活和生存 [ 1]。据报道, 增强
的 UVB辐射会引起动、植物在形态结构、生理代
谢、遗传特性和生长周期等方面发生一系列变化,而
产生这些变化的根本原因在于动植物基因组 DNA
结构序列或基因表达水平的改变。目前,对基因组
DNA的研究主要集中在哺乳动物和微生物细胞
上 [ 2] , 而对植物的研究较少。因此, 从分子水平上
进一步揭示 UVB对植物的损伤机理就显得尤为
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
重要。
随机扩增多态性 DNA ( random amplified po ly
morph ic DNA, RAPD )是以一系列不同随机寡核苷
酸序列 ( 10 bp)为引物, 对整个基因组 DNA进行
PCR扩增的一项 DNA分子标记技术,目的是检测扩
增片段的多态性 [ 3]。相对于其它分子标记技术如
RFLP、AFLP等,由于它具有方法简单、经济、技术要
求不高及可对未知基因进行分析等优点, 该技术已
被用于基因组庞大的小麦的育种研究中。RAPD技
术在小麦品种鉴定、遗传多样性分析及基因定位等
方面有着广泛的应用 [ 4]。
本研究以小麦幼苗基因组 DNA为模板,通过优
化设置 RAPD反应体系中各参数, 分析比较各因素
对扩增结果的影响,以提高 RAPD重复性,增加引物
检测位点数,找出适宜的反应体系。同时,采用此优
化的反应体系,进一步研究增强 UVB辐射处理后
小麦基因组 DNA的变化, 找出其特征谱带, 进而为
阐明增强 UVB辐射对植物造成损伤的分子生物学
机制奠定基础。
1 材料与方法
11 材料
111 供试材料 材料为冬小麦 (Triticum aesti
vum, cv )晋麦 8号, 由山西省农科院小麦研究所
提供。
112 材料培养 选取籽粒饱满,大小均一的小麦
种子, 培养于盛有两层纱布的培养皿内, 30粒 /盘,
每组 3次重复, 25 培养,种子露白时待处理。
113 处理设置 共设对照 ( CK ), UVB处理 ( B)
两组。紫外 B发生用紫外 B灯 (秦牌, 宝鸡制造, 30
W, 297 nm ) ,辐照处理参照 Feng等 [ 5]方法进行。剂
量采用 1008 kJ /m2 d, 相当于臭氧 ( q)下降 20%
即 UVB增强 40%的强度 ( RAF= 20) [ 6]。光合有
效辐射 ( PAR )为 220 mo l/m 2 d ( C I301PS, C ID,
USA )
[ 5]。每天处理 8 h,然后转入暗处培养,共处理
4 d。
12 方法
121 DNA的提取 采用 CTAB法提取小麦基因
组 DNA。参照韩榕等 [ 7]方法并加以改进。
122 DNA浓度测定 将各 DNA样本稀释 200倍,
用紫外分光光度计 (U2900E )测定样品的 A260 /A280。
由此可判断 DNA纯度,比值在 160- 190之间即可
用于 PCR扩增。DNA浓度 (g /L) = OD260 !N (样
品稀释倍数 ) ! 50/1 000。
123 小麦 RAPD体系的优化 4种 dNTPs、Taq
酶、10 !R eaction Bu ffer(M g2 + plus)均购自大连宝生
物工程有限公司。 10碱基随机引物购自上海生物
工程技术服务公司。以对照组小麦的基因组 DNA
为模板,根据有关文献报道和试验要求对 RAPD体
系中的一些重要参数进行梯度设置, 遵循单一变量
的原则,严格控制其它参数, 并在保证试验条件一致
的情况下,采取 3次重复,确保试验的准确性和可比
性。本研究所用引物为 S33。
RAPD的反应体系为 25 L, 在德国 W hatman
B iom etra公司生产的温度梯度 PCR仪 ( Tg radient)上
进行: 94 预变性 2m in, 94 变性 30 s, 38 退火 30
s, 72 延伸 30 s, 30个循环, 72 延伸 10 m in, 最后
4 保存备用。
124 电泳检测 RAPD扩增产物在 12%的琼
脂糖凝胶中电泳分离。电泳缓冲液为 1 ! TBE, 稳
压 80 V,室温下电泳 45 m in。最后采用美国 SYN
GENE公司生产的 Gboxhrem 型凝胶成像系统
成像。
125 UVB辐射对小麦基因组 DNA RAPD分
析结果的影响 从 50条随机引物中筛选出稳定
性高、重复性好的引物, 分别以对照组和 UVB处
理组小麦基因组 DNA为模板进行 PCR扩增, 比较
分析二者在相同引物下的 RAPD扩增谱带, 按条
带的有无及条带亮度来判断是否有差异条带产
生。对出现差异条带的引物, 要进行 3次重复试
验。采用 G eneToo ls进行凝胶分析, 以确定 RAPD
扩增条带的分子量。
2 结果与分析
21 小麦基因组 DNA的提取
图 1为提取的对照组与 UVB处理组小麦基因
组 DNA的凝胶电泳谱图。从图 1中可以看出各组
均有一条明显的 DNA条带,迁移率基本相同。在带
型、带宽及条带亮度上均未表现出明显差别。且
OD260 /OD280比值在 18附近, 说明两组 DNA分子结
构完整,且纯度较高,可用于 PCR扩增。
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MK. H ind ∀ d igestM arkers; CK.对照组; B. UVB处理组
图 1 小麦基因组 DNA的凝胶电泳图
22 小麦 RAPD优化体系的建立
221 模板浓度 RAPD对模板 DNA的浓度要求
不是很高 [ 8] , 但其浓度超过一定范围则会影响扩增
条带。根据相关文献 [ 9- 12] , 在建议的扩增条件
下, 每 25 L反应体系中,模板 DNA加入量宜为 15-
100 ng。本试验设置了 10、20、30、40 ng 4个 DNA浓
度梯度 (图 2)。结果表明, 模板浓度大于 20 ng时,
特异性扩增产物的强度减弱,且小分子量的 RAPD
产物带型分不清楚。说明 DNA过量时引物会过早
被耗尽,使扩增产物与模板 DNA之间发生退火或在
扩增产物之间发生退火, 导致出现弥散状背景。当
模板用量为 20 ng时条带清晰、稳定、分辨率高。模
板浓度为 10 ng时扩增产物少, 且条带强度较弱。
说明 DNA用量过少会影响模板与引物的有效配对,
降低扩增效率。因此, 本试验确定 20 ng为最适宜
的模板浓度。
MK. DL 2000M arker; 140 ng; 230 ng; 320 ng; 410 ng
图 2 模板浓度对 RAPD的影响
222 引物浓度 引物量的多少对 RAPD指纹图
谱的影响很大。本试验设置了 04、05、06、07、
08 mo l/L 5个引物浓度梯度 (图 3)。结果表明,
引物浓度大于 05 mol/L时,特异性扩增产物的条
带亮度减弱,说明引物过量会产生引物二聚体,引物
二聚体可与模板 DNA竞争 Taq酶和 dNTPs,从而使
模板 DNA的扩增产量降低。引物浓度为 05 mo l/L
时,主带清晰可辨, 扩增效果较好。引物浓度小于
05 mo l/L时, 主带的条带亮度也减弱, 且小分子
量的 RAPD条带较为弥散, 说明引物量过少不足以
与模板 DNA有效结合,降低了扩增效率。因此确定
合适的引物浓度为 05 mo l/L。
MK. DL 2000 Marker, 108 m ol /L; 207m ol /L
306 m ol /L; 405 m ol /L; 504 m ol /L
图 3 引物浓度对 RAPD的影响
223 Taq酶浓度 Taq酶的浓度和质量对扩增结
果至关重要。目前各种报道中 Taq酶的用量各不相
同, 这与反应体积、酶活性、酶的耐热性及植物材料
等因素有关。因此应尽量使用同厂家同批次的 Taq
酶。本试验设置了 0625、0750、0875、10 U 4个
Taq酶浓度梯度 (图 4)。结果表明, Taq酶用量大于
0750 U时,虽主带的带型和强度都较好, 但非特异
性扩增产物增多,导致假阳性。Taq酶用量为 0625
U时,主带的亮度减弱,合成的产物量减少。Taq酶
用量为 0750 U时, 扩增效果较为理想, 且经济节
省。因此, 本试验确定合适的 Taq 酶用量为
0750 U。
224 dNTPs浓度 dNTPs是 RAPD扩增反应的
底物,它的用量直接影响扩增产物的多少、扩增特异
性的高低及合成的忠实性。 dNTPs通过竞争性的与
Mg
2+结合从而间接影响 Taq酶的活性。本试验设
置了 100、150、200、250、300、350 mo l/L 6个浓度梯
度 (图 5)。结果表明, dNTPs浓度在 250、300和 350
mo l/L时看不到扩增条带或扩增带弱且不稳定。
dNTPs浓度为 200 mo l/L时,条带带型及亮度都较
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好。 dNTPs浓度在 100和 150 mol/L时, 主带亮度
减弱, 小分子量的 RAPD条带较为弥散。因此, 200
mo l/L为 dNTPs的最适宜浓度。
MK. DL 2 000 Marker; 110 U, 20875 U; 30750U; 40625U
图 4 Taq酶浓度对 RAPD的影响
MK. DL 2 000M arker; 1350 m ol /L; 2300 m ol /L
3250 m ol /L; 4200 m ol/L; 5150 mo l/L;
6100 m ol /L
图 5 dNTPs浓度对 RAPD的影响
225 退火温度 大多数引物的最适复性温度为
35- 38 [ 13] ,但也有一些引物只有在较高的复性温
度下, 才能提高扩增特异性,产生清晰的带型。本试
验设置了 34 、36 、38 、40 、42 5个温度梯
度,结果发现不同引物的最适退火温度不同,可能是
由于其碱基组成不同所致, 它决定于引物的解链温
度 Tm值。如引物 S33的退火温度在 36 和 38
时,主带的带型清晰, 亮度较好。而在 34 、40 和
42 时,主带的条带亮度减弱,且小分子量的 RAPD
条带较为弥散, 非特异性产物增多 (图 6)。有的引
物如 S196在 34 时产生非特异性扩增, 42 时无
扩增产物。根据大多数引物的结果, 一般将退火温
度设为 38 。
MK: DL 2 000M arker; 1- 5温度分别为 42 , 40 , 38 , 36 , 34
图 6 不同退火温度对 RAPD的影响
23 UV B辐射对小麦基因组 DNA RAPD扩增结
果的影响
本研究分别以对照组与 UVB处理组小麦叶片
基因组 DNA为模板, 采用高多态性的引物进行
RAPD分析。结果显示, 处理组与对照相比, 引物
S22在分子量为 2 144 bp处出现了一条特异性条
带, 且分子量为 1 470 bp的条带亮度增强,其它带型
基本一致 (图 7a) ; 引物 S40则扩增出一条分子量
为 2 082 bp的条带 (图 7b)。经过 3次重复, 这两
条差异片段重复出现。说明 UVB辐射确实在 DNA
水平上引起了变异。
MK. DL2 000M arker, CK.对照组; B. UVB处理组
图 7 不同处理组小麦的 RAPD图谱
3 讨论
31 小麦基因组 DNA的提取
本研究采用 CTAB法提取基因组 DNA, 该方法
简单、快速、成本低廉,已被广泛应用于育种实践操
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作中。为保证提取的 DNA能够满足 RAPD扩增试
验的要求,应注意以下问题: 以幼嫩叶片为材料,用
液氮研磨后, 应迅速加入预热的提取液, 及时钝化
DN ase酶活性,防止 DNA褐化。保证各提取缓冲液
组分配比合理及 pH 值适宜, 使除垢剂在随后的分
离步骤中逐步分离出去。用氯仿 /异戊醇抽提蛋白
质杂质时,应重复 2到 3次, 以提高 DNA纯度。研
究表明 [ 14, 15] , RNA污染对扩增结果并无影响, 所以
本研究在 DNA提取过程中不添加 RN ase酶以去
除 RNA。
32 小麦 RAPD优化体系的建立
由于小麦基因组较大, RAPD分析在小麦上的
多态性水平较低,而且, RAPD分析对反应条件很敏
感 [ 16] ,因此, 对 RAPD反应体系进行优化很重要。
影响 RAPD反应的因素有很多, 如 Mg2+浓度、dNTPs
浓度、模板质量、Taq酶用量及退火温度等。前人研
究表明, M g2+是 Taq酶活性不可缺少的辅助因子,
它对反应特异性及扩增效率有重大影响。由于
dNTPs会与 Taq酶竞争性的与 Mg2 +结合,所以体系
中 M g2 +浓度要比 dNTPs浓度高一些 [ 17 ]。本研究分
别对 dNTPs和 Taq酶浓度进行了梯度设定, 且进行
了 3次重复,得到的结果较为一致,保证了试验的准
确性和可靠性。模板质量是影响 RAPD扩增的又一
关键因素。根据相关文献报道 [ 14] , DNA模板中残
留的微量氯仿、异丙醇、酒精等小分子物质会使 Taq
酶失活,因此使用时可适当稀释 DNA样品以降低抑
制物的浓度,并相应增加 Taq酶和 Mg2+用量,使反
应正常进行。此外, 退火温度是反应过程中最敏感
的条件之一,同一引物同一酶量不同温度扩增的带
型会有差异。因此应对不同引物的最适退火温度进
行梯度测试,使其在最适温度下与模板 DNA形成稳
定的杂交链,从而使扩增结果在一定多态性的基础
上保证稳定性。
为提高 RAPD反应的重复性和稳定性,除对各
反应参数进行优化外,还应注意以下几点:严格控制
实验条件,包括仪器的一致性, 药品的一致性, 反应
加样的严格控制等。试剂的保存: 所有试剂都要配
制成 10倍浓度的储备液并分装成小包装 - 20 保
存。这样可避免因反复冻融而引起生物大分子的破
坏 [ 18]。在筛选引物的过程中, 如果出现差异性条
带, 要立即进行重复性验证, 否则可能会因为时间过
长而影响结果; 用 4%的聚丙烯酰胺凝胶电泳代替
琼脂糖凝胶电泳可提高 RAPD的稳定性 [ 19]。
33 UV B辐射处理后小麦的 RAPD图谱分析
RAPD标记属于显性标记, 由于其引物的随机
性, 所获得的扩增片段在整个基因组上亦随机分布,
且 RAPD谱带呈现典型的孟德尔 ( M endel)遗传模
式, 这种扩增谱带可被认为是分子图谱的位点 [ 20]。
因此本研究结果为进一步揭示 UVB对植物造成影
响的分子学机制奠定基础。
UVB可以诱导高等植物 DNA形成环丁烷嘧啶
二聚体 ( CPD )和 64光产物 ( 64PP), 同时也能导
致碱基不稳定位点的形成和 DNA单链的断裂 [ 21]。
本研究结果显示, B组小麦出现了分子量为 2 144 bp
和 2 082 bp的扩增片段。其产生的原因可能有以下
方面: UVB辐射处理诱导 DNA产生了 CPD或 6
4PP,结构破坏,从而使随机引物与其结合的位点发
生改变。UV B辐射处理引起小麦基因组 DNA某部
位发生了碱基突变,但该突变并不能决定新的表现
型, 仅引起引物与 DNA的结合位点发生位移。UV
B辐射处理引起的基因突变刚好位于小麦基因组的
结构基因中,而且该基因可以通过转录翻译成的蛋
白质表现出新性状。UVB辐射对植物基因组的影
响虽然具有不稳定性,但本试验扩增出的两条差异
片段在不同批次的小麦试材中重复出现,这能否从
一定程度上揭示 UVB对植物造成损伤的分子生物
学机制,还有待进一步的研究。
参 考 文 献
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