全 文 ：第 １２卷第 ６期
２０１４年 １１月
生　 物　 加　 工　 过　 程
Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｐｒｏｃｅｓｓ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ
Ｖｏｌ􀆰 １２ Ｎｏ􀆰 ６
Ｎｏｖ􀆰 ２０１４
ｄｏｉ：１０􀆰 ３９６９ ／ ｊ􀆰 ｉｓｓｎ􀆰 １６７２－３６７８􀆰 ２０１４􀆰 ０６􀆰 ００９
收稿日期：２０１３－０４－１７
基金项目：国家自然科学基金（３０８０００１８、３０９７００５８）；高等学校博士学科点专项科研基金（２００８０２９５１０３６）；工业生物技术教育部重点实验室主
任基金（ＫＬＩＢ ＺＲ２００８０１）；江苏省自然科学基金（ＢＫ２０１２５５４）
作者简介：刘合栋（１９８７—），男，湖北黄石人，硕士研究生，研究方向：基因工程育种、发酵工程；张震宇（联系人），教授，Ｅ⁃ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｚｙ＠
ｊｉａｎｇｎａｎ􀆰 ｅｄｕ􀆰 ｃｎ
脯氨酸 ４ 羟化酶在大肠杆菌中的密码子优化
表达及对反式 ４ 羟脯氨酸生物合成的作用
刘合栋，袁春伟，张震宇
（江南大学 生物工程学院 工业生物技术教育部重点实验室，无锡 ２１４１２２）
摘　 要：为了使脯氨酸 ４ 羟化酶基因在重组大肠杆菌中得到高表达，通过调整大肠杆菌密码子偏好性以及 ｍＲＮＡ
二级结构，使得脯氨酸 ４ 羟化酶基因得到优化。 将优化后的脯氨酸 ４ 羟化酶基因插入含有色氨酸串联启动子
的 ｐＵＣ１９质粒，构建重组质粒 ｐＵＣ１９ ｐｔｒｐ２ Ｈｙｐ，并导入大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）中。 在摇瓶水平，重组菌以 Ｌ 脯氨
酸为底物发酵 ８ ｈ，可积累（０􀆰 ４９２±０􀆰 ０３４） ｇ ／ Ｌ 的反式 ４ 羟脯氨酸。 在发酵罐水平，通过补料分批发酵来提高反
式 ４ 羟脯氨酸的产量，当补糖速率为 １８ ｇ ／ ｈ时，反式 ４ 羟脯氨酸的产量高达 ４２􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ，反式 ４ 羟脯氨酸产率
为 ０􀆰 ９６６ ｇ ／ （Ｌ·ｈ）。
关键词：重组大肠杆菌；脯氨酸 ４ 羟化酶；反式 ４ 羟脯氨酸；密码子优化；发酵；条件优化
中图分类号：Ｑ７８６　 　 　 　 文献标志码：Ａ　 　 　 　 文章编号：１６７２－３６７８（２０１４）０６－００４４－０８
Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｃｏｄｏｎ⁃ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｐｒｏｌｉｎｅ⁃４⁃ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｉｎ
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ａｎｄ ｉｔｓ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｒａｎｓ⁃４⁃ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ
ＬＩＵ Ｈｅｄｏｎｇ，ＹＵＡＮ Ｃｈｕｎｗｅｉ，ＺＨＡＮＧ Ｚｈｅｎｙｕ
（Ｋｅｙ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｏｆ Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，
Ｊｉａｎｇｎａｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｘｉ ２１４１２２，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｉｍｐｒｏｖｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｐｒｏｌｉｎｅ ４⁃ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ，ｔｈｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｅｎｃｏｄｉｎｇ
ｐｒｏｌｉｎｅ ４⁃ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｗａｓ ａｄｊｕｓｔｅｄ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｄｏｎ ｂｉａｓ ｏｆ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ａｎｄ ｔｈｅ ｍＲＮＡ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ
ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ􀆰 Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ｐｒｏｌｉｎｅ⁃４⁃ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ｗａｓ ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ｕｎｄｅｒ ａ
ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｔａｎｄｅｍ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｉｎ ｐＵＣ１９ ｖｅｃｔｏｒ􀆰 Ｉｎ ｓｈａｋｉｎｇ ｆｌａｓｋ ｃｕｌｔｕｒｅ， ｔｒａｎｓ⁃４⁃ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ ｗａｓ
ａｃｃｕｍｕｌａｔｅｄ ｔｏ （ ０􀆰 ４９２ ± ０􀆰 ０３４） ｇ ／ Ｌ ｉｎ ８ ｈ ｗｉｔｈ Ｌ⁃ｐｒｏｌｉｎｅ ａｓ ｓｕｂｓｔｒａｔｅ􀆰 Ｆｏｒ ａｎ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｔｒａｎｓ⁃４⁃
ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｂｙ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１ （ ＤＥ３）， ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｎ ｔｒａｎｓ⁃４⁃
ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｆｅｒｍｅｎｔｏｒ ｗａｓ ｓｔｕｄｉｅｄ􀆰 Ｗｉｔｈ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｆｅｅｄｉｎｇ ｒａｔｅ ａｔ １８ ｇ ／ ｈ，ａ ｍａｘｉｍｕｍ
ｔｒａｎｓ⁃４⁃ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ ｔｉｔｅｒ ｏｆ ４２􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ ｗｉｔｈ ａ ｈｉｇｈ ｔｒａｎｓ⁃４⁃ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｉｔｙ （０􀆰 ９６６ ｇ ／ （Ｌ·ｈ））
ｗａｓ ａｃｈｉｅｖｅｄ􀆰
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ： ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ； ｐｒｏｌｉｎｅ⁃４⁃ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ； ｔｒａｎｓ⁃４⁃ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ； ｃｏｄｏｎ
ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ；ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ；ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ
　 　 反式 ４ 羟脯氨酸广泛应用于医药、化工、动物
饲料和美容业等方面。 在医药方面，反式 ４ 羟脯
氨酸作为原料可用于合成消炎药、碳青霉烯类［１］。
在化工上，反式 ４ 羟脯氨酸可作为手性原料合成
多种聚合物［２］。 在动物饲料应用上，添加反式 ４
羟脯氨酸可防止因甘氨酸合成不足而导致的营养
不良现象［３］。 反式 ４ 羟脯氨酸用于高级化妆品
中，可消除氧化剂和调整细胞的氧化还原状态［４］。
目前，国内生产反式 ４ 羟脯氨酸的主要方法是生
物提取法，利用动物蛋白来源，如明胶、猪皮为原
料，经酸、碱水解后提取反式 ４ 羟脯氨酸。 该方法
纯化步骤长，成本高，且废弃物污染严重［５］；而化学
合成方法合成成本高，也不适合工业生产［６］。
随着微生物资源的开发和生物技术的发展，利用
微生物生产反式 ４ 羟脯氨酸成为可能。 １９６１ 年，
Ｋａｔｚ等［７］发现反式 ４ 羟脯氨酸作为前体物参与链
霉菌放线菌素的合成，即羟脯氨酸可经微生物酶代谢
合成。 １９７９年，Ｋａｔｚ 等［８］研究发现游离的反式 ４
羟脯氨酸参与绿灰菌素的代谢。 Ｓｈｉｂａｓａｋｉ 等［９］通过
筛选得到 １株脯氨酸 ４ 羟化酶酶活最高的指孢囊
菌，并命名为指孢囊菌 ＲＨ１，测序获得脯氨酸 ４ 羟
化酶基因序列。 １９９７ 年，Ｓｈｉｂａｓａｋｉ 等［１０］将指孢囊菌
ＲＨ１脯氨酸 ４ 羟化酶基因置于一个强启动子的调
控下，导入大肠杆菌中，在发酵罐中发酵 １００ ｈ 后，反
式 ４ 羟脯氨酸的积累量达到 ４１ ｇ ／ Ｌ。 Ｓｈｉｂａｓａｋｉ
等［１１］将脯氨酸代谢关键酶基因导入到反式 ４ 羟脯
氨酸生产菌中，在以葡萄糖为底物的培养基中培养
９６ ｈ后，反式 ４ 羟脯氨酸产量达到 ２５ ｇ ／ Ｌ。
为了进一步提高脯氨酸 ４ 羟化酶的表达量和
反式 ４ 羟脯氨酸产量，可利用终止强度更大的终
止密码子 ＴＡＡＴ 代替常用的终止密码子 ＴＡＡ 或者
ＴＡＧ［１２］，改变密码子偏好性［１３］，降低 ５′端 ＧＣ 百分
比［１４］，降低 ｍＲＡＮ 二级结构，优化发酵条件和补料
策略［１５］。 本文的主要目的是通过优化脯氨酸 ４
羟化酶基因的表达以及大肠杆菌发酵补料策略，促
进脯氨酸 ４ 羟化酶的表达和反式 ４ 羟脯氨酸的
积累。
１　 材料与方法
１􀆰 １　 菌株和质粒
所有的 ＤＮＡ 序列由上海旭冠公司合成。 Ｔ４
ＤＮＡ连接酶和限制性内切酶均购自 ＴａＫａＲａ 公司。
所用菌株和质粒见表 １，其中质粒 ｐＡＭＰ 由 ｐＵＣ１９
质粒构建而成。
表 １　 菌株与质粒
Ｔａｂｌｅ １　 Ｓｔｒａｉｎｓ ａｎｄ ｐｌａｓｍｉｄｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｔｈｉｓ ｓｔｕｄｙ
菌株或质粒 特征
Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） Ｆ－ｏｍｐＴ ｈｓｄＳＢ（ｒＢ－，ｍＢ－） ｇａｌ ｄｃｍ （ＤＥ３）
ｐＵＣ１９ Ａｍｐｒ
ｐＡＭＰ Ａｍｐｒ
ｐＵＣ１９ ｐｔｒｐ２ Ｈｙｐ Ａｍｐｒ，ｔｒｐ ｔａｎｄｅｍ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ｐｒｏｌｉｎｅ⁃ ４⁃ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ
ｐＡＭＰ ｐｔｒｐ２ Ｈｙｐ Ａｍｐｒ，ｔｒｐｔａｎｄｅｍ ｐｒｏｍｏｔｅｒ，ｐｒｏｌｉｎｅ⁃４⁃ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ
１􀆰 ２　 脯氨酸 ４ 羟化酶基因的优化
脯氨酸 ４ 羟化酶基因序列来源于 ＧｅｎＢａｎｋ
（登录号 ＢＡＡ２００９４􀆰 １）。 由于大肠杆菌与脯氨酸 ４
羟化酶基因的来源菌指孢囊菌［９］的密码子偏好性
差异较大，为了使脯氨酸 ４ 羟化酶在大肠杆菌中
得到高表达，首先通过同义转换调整密码子偏好
性，将脯氨酸 ４ 羟化酶基因的低使用率密码子替
换为在大肠杆菌中使用频率高的密码子，并调整脯
氨酸 ４ 羟化酶基因的 ＧＣ 百分比，使得最终的脯
氨酸 ４ 羟化酶基因 ＧＣ 百分比接近大肠杆菌 ＧＣ
百分比。 为了便于基因克隆和操作，通过同义转化
消除脯氨酸 ４ 羟化酶基因的酶切位点。 最后，利
用 ＲＮＡｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ５􀆰 ３ 软件预测脯氨酸 ４ 羟化酶基
因 ｍＲＮＡ二级结构，并计算出 ｍＲＮＡ 二级结构的自
由能 ΔＧ，并通过调整脯氨酸 ４ 羟化酶基因的
ｍＲＮＡ 二级结构，使得脯氨酸 ４ 羟化酶基因
ｍＲＮＡ的 ５′端避免形成二级结构，最终使脯氨
酸 ４ 羟化酶基因得到优化。
１􀆰 ３　 重组质粒的构建
为了高效表达脯氨酸 ４ 羟化酶基因，引入强
５４　 第 ６期　 　 刘合栋等：脯氨酸 ４ 羟化酶在大肠杆菌中的密码子优化表达及对反式 ４ 羟脯氨酸生物合成的作用
启动子 色氨酸串联启动子，色氨酸串联启动子（图
１）由色氨酸和色氨酸结构类似物调控，当发酵液中
缺少色氨酸时，色氨酸串联启动子控制脯氨酸 ４
羟化酶基因的表达。
图 １　 色氨酸串联启动子序列
Ｆｉｇ􀆰 １　 Ｔｒｙｐｔｏｐｈａｎ ｔａｎｄｅｍ ｐｒｏｍｏｔｅｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ
　 　 优化后的脯氨酸 ４ 羟化酶基因和色氨酸串联
启动子序列由上海旭冠公司合成。 为了便于基因
操作，在优化后的脯氨酸 ４ 羟化酶基因 ５′和 ３′端
分别加入 ＨｉｎｄⅢ和 ＢａｍＨⅠ酶切位点，在色氨酸串
联启动子基因 ５′和 ３′端分别加入 ＥｃｏＲⅠ和 ＨｉｎｄⅢ
酶切位点，将合成好的脯氨酸 ４ 羟化酶基因连接
到 ｐＡＭＰ 质粒上，构建重组质粒 ＰＡＭＰ Ｈｙｐ；然后
将合成后的色氨酸串联启动子基因经 ＥｃｏＲⅠ和
ＨｉｎｄⅢ双酶切后，连接到经同样酶双酶切后的
ｐＡＭＰ Ｈｙｐ 质粒上，构建重组质粒 ｐＡＭＰ ｐｔｒｐ２
Ｈｙｐ。 将重组质粒 ｐＡＭＰ ｐｔｒｐ２ Ｈｙｐ 经 ＥｃｏＲⅠ和
ＢａｍＨⅠ双酶切后，获得含有优化后的脯氨酸 ４ 羟
化酶基因和色氨酸串联启动子基因片段，将该片段
连接到 ｐＵＣ１９ 质粒上，构建重组质粒。 重组质粒
ｐＵＣ１９ ｐｔｒｐ２ Ｈｙｐ的构建过程如图 ２所示。
图 ２　 ｐＵＣ１９ ｐｔｒｐ２ Ｈｙｐ重组质粒的构建
Ｆｉｇ􀆰 ２　 Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ ｐＵＣ１９⁃ｐｔｒｐ２⁃Ｈｙｐ
１􀆰 ４　 重组大肠杆菌的构建
将构建好的重组质粒 ｐＵＣ１９ ｐｔｒｐ２ Ｈｙｐ转化
至感受态大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）中，并涂布在相应的
抗性平板上，于 ３７ ℃培养箱中培养 １０ ｈ，待长出单
６４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
菌落后，挑取单菌落，提取质粒，酶切验证。
重组大肠杆菌，在脯氨酸 ４ 羟化酶基因强启
动子的控制下表达，在细胞内将 Ｌ 脯氨酸和 ２ 酮
戊二酸分别转化为反式 ４ 羟脯氨酸和琥珀酸，其
中，２ 酮戊二酸由葡萄糖经糖酵解途径和三羧酸循
环（ＴＣＡ）途径代谢获得。
１􀆰 ５　 摇瓶发酵生产反式 ４ 羟脯氨酸
重组大肠杆菌经稀释后涂布于含 ５０ μｇ ／ ｍＬ 氨
苄青霉素 ＬＢ平板中，于 ３７ ℃培养 ２４ ｈ 后，挑取单
菌落，接种到 ３０ ｍＬ（２５０ ｍＬ 摇瓶） ＬＢ 培养基中，
２２０ ｒ ／ ｍｉｎ、３７ ℃培养 ８ ｈ后，按 ６％的接种量接种到
３０ ｍＬ（２５０ ｍＬ 摇瓶）发酵培养基中，２２０ ｒ ／ ｍｉｎ、３５
℃培养 ８ ｈ。 发酵培养基为葡萄糖 １０ ｇ ／ Ｌ，甘油 ５
ｇ ／ Ｌ，胰蛋白胨 ８ ｇ ／ Ｌ，（ＮＨ４） ２ ＳＯ４ ５ ｇ ／ Ｌ，Ｋ２ＨＰＯ４ １
ｇ ／ Ｌ，ＮａＣｌ ２ ｇ ／ Ｌ，ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ，ＦｅＳＯ４ ３ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，
ＣａＣｌ２ ０􀆰 ０１５ ｇ ／ Ｌ，脯氨酸 ２００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ。
１􀆰 ６　 脯氨酸 ４ 羟化酶全细胞活性测定［９］
发酵液离心后，称取湿菌体质量，然后用酶反
应缓冲液将细胞冲洗悬浮后，在 ３５ ℃摇床中 ２００
ｒ ／ ｍｉｎ培养 １０ ｍｉｎ，然后在沸水中加热 ２ ｍｉｎ，灭活菌
体，终止酶反应，测定反式 ４ 羟脯氨酸浓度，反式
４ 羟脯氨酸测定采用氯胺 Ｔ法［１６］。
１􀆰 ７　 补料分批发酵生产反式 ４ 羟脯氨酸
将保藏于 － ８０ ℃ 冰箱的菌种涂布于含 ５０
μｇ ／ ｍＬ氨苄青霉素的 ＬＢ平板上，３７ ℃培养 ２４ ｈ后，
从平板上挑取单菌落，接种至装有 ３０ ｍＬ ＬＢ培养基
的 ２５０ ｍＬ 三角摇瓶中，３７ ℃、２２０ ｒ ／ ｍｉｎ 摇床培养
８～８􀆰 ５ ｈ 后，将种子按 ６％的接种量接种于的 ７ Ｌ
ＢｉｏＦｌｏ ４１５发酵罐中，装液量 ４ Ｌ，发酵温度 ３５ ℃，
用质量分数为 ３０％的氨水控制 ｐＨ 为 ６􀆰 ５ 以上，通
气量为 １ ～ ３ ｖｖｍ（１ 个 ｖｖｍ 表示每分钟通气量与罐
体实际料液体积的比值），搅拌转速为 ４００ ～ ９００
ｒ ／ ｍｉｎ。 在发酵过程中，通过调节通气量和搅拌转
速，使得发酵罐溶氧水平维持在 ４０％以上，以残糖
的耗尽为标志开始补加质量分数 ４０％葡萄糖，此时
开始采用不同的流加速率开始补料。 发酵培养基
为葡萄糖 １０ ｇ ／ Ｌ，甘油 ５ ｇ ／ Ｌ，胰蛋白胨 ８ ｇ ／ Ｌ，
（ＮＨ４ ） ２ ＳＯ４ ５ ｇ ／ Ｌ， Ｋ２ ＨＰＯ４ １ ｇ ／ Ｌ， ＮａＣｌ ２ ｇ ／ Ｌ，
ＭｇＳＯ４ ０􀆰 ２ ｇ ／ Ｌ，ＦｅＳＯ４ ３ ｍｍｏｌ ／ Ｌ，ＣａＣｌ２ ０􀆰 ０１５ ｇ ／ Ｌ，
Ｌ 脯氨酸 ４００ ｍｍｏｌ ／ Ｌ。
１􀆰 ８　 菌体浓度和葡萄糖、反式 ４ 羟脯氨酸的测定
分光光度计测定发酵液 Ａ６００值，根据实验数据
拟合细胞干质量 ＤＣＷ（ｇ ／ Ｌ）和菌液 Ａ６００值的回归方
程为 ＤＣＷ＝ ０􀆰 ５４Ａ６００。 发酵液葡萄糖采用 ＳＢＡ ４０
Ｃ型生物传感分析仪测定（山东省科学院生物研究
所），反式 ４ 羟脯氨酸的测定方法采用氯胺
Ｔ法［１６］。
２　 结果与讨论
２􀆰 １　 脯氨酸 ４ 羟化酶基因的优化设计和合成
脯氨酸 ４ 羟化酶基因序列的密码子使用频率
分析由数据库完成 （ ｈｔｔｐ： ／ ／ ｗｗｗ􀆰 ｋａｚｕｓａ􀆰 ｏｒ􀆰 ｊｐ ／
ｃｏｄｏｎ），分析结果显示：来源于指孢囊菌的初始脯氨
酸 ４ 羟化酶基因部分密码子在大肠杆菌中的使用
频率很低，如 ＣＡＣ（Ｈｉｓ）、ＣＵＣ（Ｌｅｕ）、ＣＧＧ（Ａｒｇ）、
ＵＣＧ（Ｓｅｒ）、ＧＵＣ（Ｖａｌ），这些密码子的使用频率均低
于 １５％，而且，这些低频密码子以集群形式分布在
脯氨酸 ４ 羟化酶 ｍＲＮＡ 上，会进一步影响大肠杆
菌蛋白的表达［１７］。 同时，初始脯氨酸 ４ 羟化酶基
因的 ＧＣ百分比高达 ７３􀆰 ６２％，远高于大肠杆菌基因
ＧＣ百分比。
具体的优化过程如表 ２ 所述。 第一步，根据大
肠杆菌的密码子偏好性，利用密码子优化软件
ＪＣＡＴ［１８］，通过同义转换，将来源于指孢囊菌的脯氨
酸 ４ 羟化酶基因中的低频密码子替换为大肠杆菌
高表达基因密码子，同时，调整脯氨酸 ４ 羟化酶基
因的 ＧＣ百分比，使得 ４ 羟化酶基因的 ＧＣ 百分比
接近大肠杆菌，该步骤改变了 １４１ 个核苷酸，同时
ＧＣ百分比也从 ７３􀆰 ６２％降到了 ５９􀆰 ４６％，更接近大
肠杆菌高表达基因的 ＧＣ 百分比。 第二步，为了便
于基因工程操作，通过同义转化消除脯氨酸 ４ 羟
化酶基因的 ＥｃｏＲⅠ酶切位点。 第三步，利用 ＲＮＡ
折叠分析软件 ５􀆰 ３ 预测脯氨酸 ４ 羟化酶基因的
ｍＲＮＡ二级结构，ｍＲＮＡ折叠自由能，通过改变同义
密码子调整 ｍＲＮＡ的 ５′端结构，使得脯氨酸 ４ 羟
化酶基因的 ｍＲＮＡ的 ５′端避免形成二级结构，如图
３所示，优化之前的 ｍＲＮＡ 折叠能 ΔＧ 为－１ ２８１􀆰 ６
ｋＪ ／ ｍｏｌ，优化后的 ｍＲＮＡ 折叠能 ΔＧ 为 － １ ２０２􀆰 ５
ｋＪ ／ ｍｏｌ，优化后的脯氨酸 ４ 羟化酶基因的 ｍＲＮＡ
保证 ＡＵＧ起始密码子后及其后的几个碱基组成的
密码子翻译口袋呈打开状态，降低核糖体结合到
ｍＲＮＡ上的能势，使得核糖体能够顺利地沿着起始
密码子向后翻译，最终脯氨酸 ４ 羟化酶基因序列
得到优化。 由于在优化过程中后一优化步骤对前
一优化步骤的调整，最终的密码子数 ／核苷酸数改
变并不是前面三步优化的累加。
７４　 第 ６期　 　 刘合栋等：脯氨酸 ４ 羟化酶在大肠杆菌中的密码子优化表达及对反式 ４ 羟脯氨酸生物合成的作用
与野生型脯氨酸 ４ 羟化酶基因序列比较，优
化后的脯氨酸 ４ 羟化酶基因共改变了 １３７ 个密
码子和 １３９ 个核苷酸，同时，ＧＣ 百分比从 ７３􀆰 ６２％
降低到 ５９􀆰 ２７％，更接近大肠杆菌高表达基因的
ＧＣ 百分比含量，优化后的脯氨酸 ４ 羟化酶基因
如图 ４ 所示。
表 ２　 密码子优化过程
Ｔａｂｌｅ ２　 Ｃｏｄｏｎ ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ ｐｒｏｃｅｓｓ
优化方法
脯氨酸 ４ 羟化酶基因
密码子
改变数
核苷酸
改变数
ＧＣ百分比 ／
％
优化密码子 １３８ １４１ ５９􀆰 ４６
消除酶切位点 １ １ ５９􀆰 ３４
调整 ｍＲＮＡ二级结构 ８ ８ ５９􀆰 ２７
最终结果 １３７ １３９ ５９􀆰 ２７
Ａ—调整之前的序列；Ｂ—调整之后的序列
图 ３　 脯氨酸 ４ 羟化酶 ｍＲＮＡ二级结构预测结果
Ｆｉｇ􀆰 ３　 Ｎａｔｉｖｅ ｇｅｎｅ ｍＲＮＡ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ
ａｄｊｕｓｔｅｄ ｇｅｎｅ ｍＲＮＡ ｓｅｃｏｎｄａｒｙ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｗａｓ
ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｂｙ ｓｏｆｔｗａｒｅ
图 ４　 野生型脯氨酸 ４ 羟化酶基因（上）与优化后的脯氨酸 ４ 羟化酶基因（下）的序列比对
Ｆｉｇ􀆰 ４　 Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ ｏｆ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｂｅｔｗｅｅｎ ｗｉｌｄ⁃ｔｙｐｅ ｇｅｎｅ（ｕｐｐｅｒ） ａｎｄ
ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ （ ｌｏｗｅｒ）， ｃｈａｎｇｅｄ ｂａｓｅ ａｒｅ ｉｎｄｉｃａｔｅｄ
８４ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
２􀆰 ２　 脯氨酸 ４ 羟化酶在大肠杆菌中的表达
将重组质粒 ｐＡＭＰ ｐｔｒｐ２ Ｈｙｐ 经 ＥｃｏＲⅠ和
ＢａｍＨⅠ双酶切后，其中较小的条带为色氨酸串联
启动子和脯氨酸 ４ 羟化酶基因序列，双酶切后最
终形成 １ ８５０和 １ ０６３ ｂｐ ２条条带，如图 ５所示。 经
ＤＮＡ测序，序列完全正确。
１—ｐＡＭＰ ｐｔｒｐ２ Ｈｙｐ双酶切；２—１ ｋｂ ｌａｄｄｅｒ ｍａｒｋｅｒ Ｍ１１８１
图 ５　 ｐＡＭＰ ｐｔｒｐ２ Ｈｙｐ双酶切
Ｆｉｇ􀆰 ５　 Ｄｏｕｂｌｅ ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ ｏｆ ｐＡＭＰ⁃ｐｔｒｐ２⁃Ｈｙｐ
由于 ｐＡＭＰ 质粒上酶切位点少，不便于外源基
因的引入，因此最终选择实验室常用的质粒 ｐＵＣ１９
作为脯氨酸 ４ 羟化酶的表达质粒，将优化后的脯
氨酸 ４ 羟化酶基因和色氨酸串联启动子序列经
双酶
切后，连接到 ｐＵＣ１９质粒上，构建重组质粒 ｐＵＣ１９
ｐｔｒｐ２ Ｈｙｐ，然后将重组质粒 ｐＵＣ１９ ｐｔｒｐ２ Ｈｙｐ
转化到大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）中，构建重组菌，经摇
瓶发酵，重组菌 ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＵＣ１９ ｐｔｒｐ２ Ｈｙｐ的
反式 ４ 羟脯氨酸产量和全细胞酶活如表 ３ 所示，
重组菌 ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＵＣ１９ ｐｔｒｐ２ Ｈｙｐ 的反式
４ 羟脯氨酸产量高达（０􀆰 ４９２±０􀆰 ０３４） ｇ ／ Ｌ，同时，全
细胞活性达到（０􀆰 ７５±０􀆰 ０８） Ｕ ／ ｇ。
２􀆰 ３　 重组大肠杆菌发酵罐补料分批发酵生产反式
４ 羟脯氨酸
　 　 摇瓶培养过程中无法控制 ｐＨ 和溶氧值，而且
摇瓶发酵容易导致供氧不足，很难达到高密度发
酵。 提高反式 ４ 羟脯氨酸的产量和 Ｌ 脯氨酸的
转化率，必须通过重组大肠杆菌的高密度发酵来实
现，因此，研究重组大肠杆菌在发酵罐补料分批发
酵中的生长特性和产酸情况是必经之路。 反式 ４
羟脯氨酸发酵中，残余的 Ｃ 源过多会导致大肠杆菌
代谢副产物增多，乙酸过量积累，最终使得发酵提
前结束；而当 Ｃ 源不足时，细胞生长速度过慢，同样
会导致 ４ 反式 ４ 羟脯氨酸产量下降。 因此，选择
合适的补料策略至关重要。 匀速流加补料策略广
泛应用于各种表达系统，与其他补料策略相比，匀
速流加补料策略操作方便简单，易于控制。 匀速流
加发酵对降低底物抑制、提高细胞生物量和目的产
物产量等具有重要的作用。
表 ３　 重组菌 ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＵＣ１９ ｐｔｒｐ２ Ｈｙｐ的反式 ４ 羟脯氨酸产量和全细胞脯氨酸 ４ 羟化酶活性
Ｔａｂｌｅ ３　 Ｔｒａｎｓ⁃４⁃ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｗｈｏｌｅ⁃ｃｅｌｌ ｐｒｏｌｉｎｅ⁃４⁃ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｂｙ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＵＣ１９⁃ｐｔｒｐ２⁃Ｈｙｐ
重组大肠杆菌 Ａ６００
ρ（反式 ４ 羟脯氨酸） ／
（ｇ·Ｌ－１）
全细胞脯氨酸 ４ 羟化酶活性 ／
（Ｕ·ｇ－１） ａ
ＢＬ２１（ＤＥ３） ／ ｐＵＣ１９ ｐｔｒｐ２ Ｈｙｐ ４􀆰 ９５±０􀆰 ２５ ０􀆰 ４９２±０􀆰 ０３４ ０􀆰 ７５±０􀆰 ０８
　 　 　 　 注：ａ—将 １个单位酶活定义为 １ ｍｉｎ将 １ ｎｍｏｌ脯氨酸完全转化为反式 ４ 羟脯氨酸的酶量，单位为 Ｕ；脯氨酸 ４ 羟化酶全细胞
活性是单位体积发酵液 １ ｇ干细胞的酶活，单位为 Ｕ ／ ｇ。
　 　 按照 １􀆰 ７的方法进行补料分批发酵，采用连续
补料流加，并考察不同的葡萄糖流加速度对反
式 ４ 羟脯氨酸产量的影响，３ 个不同的连续流加
速率分别为 １２、１８和 ２４ ｇ ／ ｈ，发酵结果如图 ６所示。
由图 ６可知：当葡萄糖以 ２４ ｇ ／ ｈ 的速率匀速流
加时，残糖在 １６ ｈ 后开始过量积累，２０ ｈ 时残糖质
量浓度达到 １ ｇ ／ Ｌ，在培养 ４８ ｈ后发酵结束，残糖质
量浓度高达 ５􀆰 ０８ ｇ ／ Ｌ。 由于残糖过量积累，可能导
致代谢抑制物和乙酸的积累，从而影响反式 ４ 羟
脯氨酸的积累，最终的菌体 Ａ６００和反式 ４ 羟脯氨
酸的产量分别为 ３８􀆰 ２ 和 ２７􀆰 ０ ｇ ／ Ｌ。 当以 １２ ｇ ／ ｈ 的
速率匀速流加葡萄糖时，发酵液中残糖浓度一直维
持在 ０～０􀆰 １ ｇ ／ Ｌ之间，直至发酵结束，然而，与以 ２４
ｇ ／ ｈ的速率匀速流加葡萄糖液相比，补糖速率为 １２
ｇ ／ ｈ时的最大细胞浓度 Ａ６００只能达到 ３１􀆰 ８３，而且反
式 ４ 羟脯氨酸的产量也明显降低。 由此可知，当
发酵液中的残留葡萄糖一直维持在很低的水平时
（＜０􀆰 １ ｇ ／ Ｌ），虽然并未抑制细菌的生长，但是葡萄
９４　 第 ６期　 　 刘合栋等：脯氨酸 ４ 羟化酶在大肠杆菌中的密码子优化表达及对反式 ４ 羟脯氨酸生物合成的作用
图 ６　 重组大肠杆菌在不同的匀速补糖速率下的菌体浓度、
残糖和反式 ４ 羟脯氨酸产量的变化
Ｆｉｇ􀆰 ６　 Ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｇｌｕｃｏｓｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ａｎｄ
ｔｒａｎｓ⁃４⁃ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ
ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅ􀆰 ｃｏｌｉ ｉｎ ｆｅｄ⁃ｂａｔｃｈ ｃｕｌｔｕｒｅｓ
ｂｙ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒａｔｅ ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｔｒａｔｅｇｙ
糖是重组大肠杆菌生产必须的 Ｃ 源和能源物质，葡
萄糖的供给不足，导致细胞代谢生长受限，使得反
式 ４ 羟脯氨酸的产量急剧下降，最终反式 ４ 羟
脯氨酸积累量不足 １８ ｇ ／ Ｌ。
当以 １８ ｇ ／ Ｌ的恒定补糖速率培养时，发酵液中
的葡萄糖质量浓度维持在 ０􀆰 １ ～ ０􀆰 ３ ｇ ／ Ｌ 之间，与前
２组比较，该组的细胞浓度和反式 ４ 羟脯氨酸产
量均达到最大值，反式 ４ 羟脯氨酸产量高达 ４２􀆰 ５
ｇ ／ Ｌ，产酸速率达到 ０􀆰 ９６６ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），比目前国际最
高水平高 １２５％［９］。 同时，Ｌ 脯氨酸的转化率达到
８１􀆰 １％，最终的产酸量比目前的最高水平高 １􀆰 ５
ｇ ／ Ｌ［１０］。 当以 １８ ｇ ／ Ｌ的恒定补糖速率培养时，残糖
未过量积累，代谢副产物可得到有效控制。
然而，在发酵过程中，发酵后期的溶氧一直维
持在 １０％以下，使得重组菌生长缓慢，脯氨酸 ４ 羟
化酶的表达量下降，最终影响产酸，因此，通过提高
发酵液中的溶解氧，是提高产率最直接的方法。 在
大规模生产中，提高搅拌转速、维持较高的罐压和
提高通气量均可获得较高的溶氧，然而这些改进均
需要消耗大量的能源和电力，不利于生产成本的控
制。 有研究报道通过在菌种中引入血红蛋白基因，
可有效解决供氧不足的问题，在提高菌体比生长速
率的同时，产物产量也得到提高［１９－２０］，后期的研究
中，可考虑在分子水平上引入透明颤菌血红蛋白基
因，提高氧气利用率并促进脯氨酸 ４ 羟化酶的
表达。
３　 结　 论
利用色氨酸串联启动子控制脯氨酸 ４ 羟化酶
基因的表达，在以葡萄糖为 Ｃ 源，Ｌ 脯氨酸为底物
的发酵培养基中，采用匀速补糖策略，最终的反式
４ 羟脯氨酸产量达到 ４２􀆰 ５ ｇ ／ Ｌ，反式 ４ 羟脯氨酸
产酸速率高达 ０􀆰 ９６６ ｇ ／ （Ｌ·ｈ），产酸速率比目前国
际最高水平高 １２５％。
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［１１］ 　 Ｓｈｉｂａｓａｋｉ Ｔ，Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｓ，Ｍｏｒｉ Ｈ，ｅｔ ａｌ． Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ
０５ 生　 物　 加　 工　 过　 程　 　 第 １２卷　
ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｌｉｎｅ⁃ｐｒｏｄｕｃｉｎｇ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｂｙ
ｉｎｔｒｏｄｕｃｉｎｇ ａ ｐｒｏｌｉｎｅ ４⁃ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ ｇｅｎｅ ［ Ｊ］ ． Ｊ Ｂｉｏｓｃｉ Ｂｉｏｅｎｇ，
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［１２］ 　 Ｐｏｏｌｅ Ｅ Ｓ， Ｂｒｏｗｎ Ｃ Ｍ， Ｔａｔｅ Ｗ Ｐ． Ｔｈｅ ｉｄｅｎｔｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂａｓｅ
ｆｏｌｌｏｗｉｎｇ ｔｈｅ ｓｔｏｐ ｃｏｄｏｎ ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｓ ｔｈｅ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ｏｆ ｉｎ ｖｉｖｏ
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ｈｅｔｅｒｏｌｏｇｏｕｓ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ａｒｃｈａｅａｌ ｇｅｎｅ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ［ Ｊ］ ．
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｐｕｒｉｆ，２００６，５０（１）：４９⁃５７．
［１８］ 　 Ｇｒｏｔｅ Ａ，Ｈｉｌｌｅｒ Ｋ， Ｓｃｈｅｅｒ Ｍ， ｅｔ ａｌ． ＪＣａｔ： ａ ｎｏｖｅｌ ｔｏｏｌ ｔｏ ａｄａｐｔ
ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｏｆ ａ ｔａｒｇｅｔ ｇｅｎｅ ｔｏ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｈｏｓｔ［ Ｊ］ ．
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒ，２００５，３３（Ｓ２）：Ｗ５２６⁃Ｗ５３１．
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ｏｆ ２⁃ｃｈｌｏｒｏｂｅｎｚｏａｔｅ ｂｙ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ Ｂｕｒｋｈｏｌｄｅｒｉａ ｃｅｐａｃｉａ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｕｎｄｅｒ ｖａｒｉａｂｌｅ ｌｅｖｅｌｓ ｏｆ ｏｘｙｇｅｎ
ａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ［Ｊ］ ．Ｂｉｏｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，２００３，１４（５）：３５７⁃３６５．
［２０］ 　 Ｓａｎｎｙ Ｔ，Ａｒｎａｌｄｏｓ Ｍ，Ｋｕｎｋｅｌ Ｓ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｅｔｈａｎｏｌｉｃ
Ｅ． ｃｏｌｉ ｗｉｔｈ ｔｈｅ Ｖｉｔｒｅｏｓｃｉｌｌａ ｈｅｍｏｇｌｏｂｉｎ ｇｅｎｅ ｅｎｈａｎｃｅｓ ｅｔｈａｎｏｌ
ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｆｒｏｍ ｂｏｔｈ ｇｌｕｃｏｓｅ ａｎｄ ｘｙｌｏｓｅ ［ Ｊ ］ ． Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，２０１０，８８（５）：１１０３⁃１１１２．
（责任编辑　 管　 珺）
􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌􀤌
（上接第 ２６页）
［１２］　 Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ Ｒ Ｄ， Ｊｏｎｅｓ Ａ， Ｐｉｃｋａｒｄ Ｍ Ａ． Ｓｅｍｉｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓ ａｎｄ
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ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ ｂｙ ｍｏｕｌｄｓ． （ Ｂ ） ｃａｌｄａｒｉｏｍｙｃｉｎ， Ｃ５Ｈ８Ｏ２Ｃｌ２， ａ
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［１９］ 　 Ｈａｌｌｅｎｂｅｒｇ Ｐ Ｆ，Ｈａｇｅｒ Ｌ Ｐ．Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｃｈｌｏｒｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ ｆｒｏｍ
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（责任编辑　 管　 珺）
１５　 第 ６期　 　 刘合栋等：脯氨酸 ４ 羟化酶在大肠杆菌中的密码子优化表达及对反式 ４ 羟脯氨酸生物合成的作用