全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
应激诱导对体外培养早期胚胎细胞凋亡的影响
刘涛 李向臣 赵倩君 关伟军 马月辉
(中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，北京 100193)
摘 要: 细胞凋亡是早期胚胎清除由于自身或外界环境影响产生的不良细胞的主要途径之一。体外培养的早期胚胎
易受一些环境及外源刺激，如氧化剂、机械刺激、重金属和生物类的毒素等产生一系列的刺激性反应，包括细胞转导路径，基
因的表达和蛋白的合成，细胞的分裂增殖及凋亡，甚至是坏死;维生素 E，维生素 C，金属硫蛋白对细胞的凋亡起抑制作用。从
凋亡的分子机制进行深入研究，利于从根本上改变胚胎质量，提高囊胚率和附植率。
关键词: 应激诱导 早期胚胎 凋亡
Stress-induced Impacts on Early Embryonic Cells in Vitro
Liu Tao Li Xiangchen Zhao Qianjun Guan Weijun Ma Yuehui
(Institute of Animal Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193)
Abstract: Cell apoptosis is one of the main ways for early embryonic cells to remove bad cells which produced by its adverse or
external environment． Early embryos in vitro is easily affected by some of the environmental and exogenous stimuli，such as oxidants，me-
chanical stimulation，heavy metals，biological toxins，which produce a series of irritation，including cell transduction path，gene expres-
sion and protein synthesis，cell division and proliferation，cell apoptosis，or even necrosis． Vitamin E，vitamin C，metallothionein inhibit
cell apoptosis． We study cell apoptosis on its molecular mechanism，which will help to fundamentally change the embryo quality for im-
proving blastocyst rate and implantation rate．
Key words: Sterss-induced Early embryos Apoptosis
收稿日期:2010-09-27
基金项目:基本科研业务项目(2010jc-10) ，国家科技支撑项目(2008BADB2B05) ，转基因生物新品种培育科技重大专项(2008ZX08009-003)
作者简介:刘涛，女，硕士，研究方向:动物遗传育种与繁殖;E-mail:polly149@ 163． com
通讯作者:关伟军，E-mail:weijunguan301@ gmail． com;马月辉，E-mail:yuehui_ma@ hotmail． com
在哺乳动物中，大约有 30% － 70%的胚胎在发
育过程中夭折，其中绝大部分发生在胚胎发育的早
期。早期胚胎死亡的原因很多，与遗传及环境因素关
系密切。在哺乳动物早期胚胎发育的过程中，胚胎发
育的任何一个阶段都能够发现包含凋亡细胞的胚胎。
体外培养的早期胚胎细胞接触外源应激原，如
氧化剂、机械刺激、重金属和生物类的毒素等产生一
系列的刺激性反应，包括细胞转导路径，基因的表达
和蛋白的合成，细胞的分裂增殖及凋亡，甚至是坏
死。早期的胚胎细胞对外界环境的刺激敏感。
1 胚胎细胞凋亡的意义
细胞凋亡是生物体在发育过程中为了维持自身
正常的生长发育需要对发育异常的细胞及多余细胞
的清除过程之一。在许多组织当中都检测到了细胞
凋亡的发生，在着床前早期胚胎的发育过程当中也
能够检测到。通过对核酸的染色可以发现在这些胚
胎当中染色体的凝集，通过 Annexin V 染色的方法
能检测到胚胎细胞膜表面磷酯酰丝氨酸的明显变
化，这些现象都是细胞发生凋亡时的明显特征。
细胞凋亡发生于胚胎形成期，受进化上保守基
因调控。妊娠过程中时空调控的细胞凋亡在绒毛发
育［1］、母体对胎儿的免疫耐受中起作用［2］。早期胚
胎细胞凋亡可能与胚胎的质量相关。内细胞群
(ICM)细胞增殖分化形成胚外滋养层(TE)［3］。如
早期人囊胚通过凋亡维持一定的 ICM 细胞数，防止
TE不恰当的异位表达。这是胚胎种植后正常发育
所必需的。但过度凋亡也可能导致妊娠率低、自然
2011 年第 3 期 刘涛等:应激诱导对体外培养早期胚胎细胞凋亡的影响
流产和胎儿富内发育迟缓等主要原因。
2 影响体外培养早期胚胎细胞凋亡的因素
诱导胚胎细胞凋亡的因素有很多，包括精、卵细
胞的衰老、营养缺乏、化学试剂、微生物感染和炎症
因子刺激等许多理化因素。其中，体外培养微环境
的欠缺对于 IVF-ET过程中的胚胎细胞凋亡是最主
要的诱导因素。
活性氧(reactive oxygen species，ROS)是氧的某
些代谢产物及一些反应的含氧产物。卵子受精完成
后即开始进行有丝分裂，4 － 8 细胞期胚胎分裂增殖
所需的蛋白及 mRNA 主要由受精前卵母细胞所储
存，能量代谢以利用丙酮酸为主;8 细胞期后能量代
谢则以利用葡萄糖为主。在胚胎的代谢中均会产生
一定量的 ROS。在进行体外培养时 ROS 明显增高，
增高的 ROS可能来源于胚胎本身或外部的环境［4］。
胚胎发育过程中产生的代谢产物和培养液成分的自
氧化产物 ROS可以对胚胎发育产生不良影响。ROS
产生的两个高峰是受精时及 2 细胞胚胎期。2 细胞
胚胎阶段若 ROS 含量过高则会引起胚胎停育凋亡，
而 9 －16细胞胚胎比受精卵及囊胚更能抵制外源性
H2O2的影响
［5］。方南洙等［6］用活性氧(ROS)对小鼠
早期胚胎胚细胞分裂的影响表明，小鼠早期胚胎在体
外培养时期 2-细胞期胚胎(0 － 12 h 处理组)对外源
性 H2O2(2． 1 μmol /L)最敏感。自发发育阻滞的高发
生率往往出现在胚胎基因组激活的这段时间范围内，
同时意味着在这段时间内胚胎对于外界损害性干扰
的敏感性增高。
镉是一种具有潜在毒性的重金属，因其在工业
上应用广泛，已成为环境中主要的污染物之一。目
前大量体内体外试验表明，镉能诱导许多组织和细
胞的凋亡，凋亡对机体的生长发育和维持内环境的
稳态有很重要的作用，凋亡的失控会诱导多种疾病，
如癌症和自身免疫系统紊乱。对体外培养的早期胚
胎细胞来说，可以使其发育停滞、畸变和凋亡甚至是
死亡。
环十二烷(HBCD)广泛用作溴化阻燃剂，并已
在水生环境、野生动物和人类中检测到。Deng 等［7］
用斑马鱼的胚胎为研究对象，评估化学毒性对胚胎
发育的影响。将受精 4 h后斑马鱼胚胎置于不同浓
度的 HBCD中(0、0. 05、0. 1、0. 5 和 1. 0 mg /L) ，96 h
后畸形率显着增加。吖啶橙(AO)染色显示细胞凋
亡的结果。运用实时 PCR 技术对相关凋亡的基因
检测结果显示，促凋亡基因 p53、Apaf-1、caspase-9
和 caspase-3 的表达上调，双抗凋亡基因 Mdm2 的
(p53 的拮抗剂)和 Bcl-2(Bax 的抑制剂)的表达分
别下调以及 capspase-9 和 caspase-3 活性显着增加。
总的结果表明，水性 HBCD 能诱导产生氧化应激，
通过在斑马鱼胚胎半胱氨酸蛋白酶参与细胞凋亡。
研究结果还表明，斑马鱼的胚胎可以作为一种通用
的 HBCD发育毒性可靠的模型。
3 早期胚胎凋亡的相关分子
3. 1 Bcl-2 家族
Bcl-2 家族可分为两类［8］:一类是抗凋亡的，主
要有 Bcl-2、Bcl-Xl、Bcl-W、Mcl-1 和 Ced-9 等;另一
类是促进细胞凋亡的，主要有 Bax、Bak、Bcl-Xs、
Bad、Bik和 Bid等。李威等［9］研究小鼠早期胚胎发
育过程中凋亡基因表达的情况。结果表明，在早期
胚胎发育过程中，随着胚胎发育的进程，Bcl-2 家族
基因表达呈现不同的表达规律。Bax 基因在从 2-细
胞期到囊胚期都有表达，且表达量很高，无明显的变
化;Bcl-2 基因在从 2-细胞期到 8-细胞期表达量较
少，而在桑葚胚和囊胚期表达量较高;Bak 基因在从
2-细胞期到桑葚胚期都有表达，且表达量逐渐下降，
在囊胚期不表达;Bcl-xl 基因在从 2-细胞期到 8-细
胞期都有表达，而在桑葚胚期和囊胚期不表达。
3. 2 Caspase家族
Caspases是一组存在于胞质溶胶中的结构上相
关的半胱氨酸蛋白酶。这些 caspases 中，caspase-1
和 caspase-11，以及 caspase-4 被认为不直接参与凋
亡信号的转导，它们主要参与白介素前体的活化;而
caspase-2、caspase-8、caspase-9 和 caspase-10 参与细
胞凋亡的起始;参与细胞凋亡执行的则是 caspase-3、
caspase-6和 caspase-7。Jurisicova 等［10］在人类早期
胚胎发育过程中凋亡基因表达的研究中发现，在 4-细
胞和 8-细胞胚胎中 caspase-3 的转录呈现上升趋势，
在碎片的胚胎中 caspase-3的 mRNA的表达呈现上升
趋势。Brad等［11］在研究抑制牛 2-细胞胚胎凋亡的过
程中发现热应激失效后，caspase-2、caspase-3 和
caspase-7的活性没有被激活;但是 cccp 处理过的 2-
细胞胚胎、caspase-9、caspase-2、caspase-3和 caspase-7
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
在线粒体去极化后被激活。由于抑制了 caspase-2、
caspase-3和 caspase-7激活的 DNA酶，TUNEL检测没
有明显的凋亡现象。
3. 3 p53
p53 是肿瘤抑制基因，其产物主要在细胞核
内。在依赖于 p53 蛋白的细胞凋亡中，p53 基因通
过调节 Bcl-2 和 Bax基因的表达来影响细胞凋亡。
李艳红等［12］在研究了凋亡调节基因 bcl-2 及 p53
在早期胚胎中的表达，结果表明了 p53 在着床前
小鼠胚胎中的表达及其对着床前胚胎发育的作
用。在小鼠 2-细胞、4-细胞和 8-细胞和桑葚胚中，
均检测到 bcl-2 和 p53 蛋白，说明 bcl-2 和 p53 凋
亡调控基因在小鼠着床前胚胎的表达可能与细胞
碎片形成有关，对于维护胚胎正常发育，促进发育
异常的胚胎细胞发生凋亡，从而提高胚胎质量有
重要意义。体内增殖与凋亡处于一个动态平衡，
共同调节胚胎发育。
3. 4 细胞色素 C
具有调控能量代谢和凋亡的双重功能。通过调
节细胞能量代谢，细胞色素 C 可调控细胞死亡的方
式，通过对凋亡信号和放大作用引起活性氧的产生
增加，细胞色素 C 可直接介导细胞的凋亡。同时，
还可在凋亡的过程中从线粒体内膜释放到胞浆中，
并可与 Apaf-1 结合招募 procaspase-9 聚集，激活
procaspase-9，在 dATP 存在时，caspase-9 可直接活
化 procaspase-3，介导细胞凋亡。细胞色素 C 的释放
是凋亡发生的特征之一。王连卿［13］在研究双酚 A
对小鼠早期胚胎发育中发现，高浓度的 BPA能够诱
导早期胚胎的细胞色素 C 的释放增加，从而导致细
胞凋亡的发生。
3. 5 Smac /DIABLO
是一种新近发现的线粒体膜间蛋白，与细胞
色素 C 一样，也是 caspase 的线粒体激活因子。在
细胞凋亡中，Smac /DIABLO 通过解除凋亡抑制蛋
白(IAPs)对 caspase-3、-7 和-9 的抑制作用而发挥
促凋亡作用。Honda等［14］研究小鼠植入前胚胎的
Smac /DIABLO的表达及其与凋亡和碎片的相关性
的研究中发现，应用 RT-PCR 检测到 Smac /DIAB-
LO mRNA在卵母细胞和植入前胚胎的表达;免疫
组化研究结果显示，在碎片胚胎和星状孢子素诱
导凋亡的胚胎中 Smac /DIABLO 蛋白从线粒体释
放到胞质中。
3. 6 Fas /FasL
Fas(48 kD)是一个不可分割的细胞膜糖蛋白，
类似于肿瘤坏死因子 α 受体(TNFα-R)。Fas 的配
体(FasL)是Ⅱ型细胞膜蛋白，类似于 TNF-α。当
Fas与 FasL 结合后，可以诱导细胞凋亡。受体与配
体的相互作用可以激活与 Fas 相关的死亡区域
(FADD) ，从而形成自动催化激活 procaspase-8 的位
点［15］。在小鼠卵母细胞及受精的胚胎(从原核到囊
胚期)都可以检测到 Fas和 FasL基因及其所编码的
蛋白的表达，利用 TUNEL 法检测到早期胚胎的凋
亡［16］。Kawamura 等［17］研究了在小鼠和人类植入
前胚胎中 Fas /FasL mRNA 的表达，利用 RT-PCR 和
巢式 PCR 的方法研究发现，在小鼠胚胎中 Fas mR-
NA只在 2-细胞阶段表达，FasL mRNA 在卵母细胞、
原核和 2-细胞阶段都有表达;在人类胚胎中，Fas
mRNA只在 4-细胞阶段表达，FasL mRNA 在 2-细胞
和 4-细胞阶段都有表达。在人类的碎片胚胎中 Fas
和 FasL mRNA 都有表达。由于 Fas 和 FasL mRNA
同时在小鼠胚胎 2-细胞和人类胚胎 4-细胞表达，
Fas-FasL系统可能是涉及早期胚胎凋亡的信号通
路。Kelkar等［18］研究发现，Fas 和 FasL 不在 0 d 的
卵母细胞、1 d和 2 d的胚胎中表达，而在 3 d 和 4 d
的胚胎中表达。1 d和 4 d的胚胎的 DNA碎片可以
用 TUNEL法检测出来，这个结果显示凋亡存在于正
在发育的胚胎中。
3. 7 Apaf-1
在线粒体参与的凋亡途径中具有重要的作用。
Apaf-1 具有激活 caspase-3 的作用，此过程需要细胞
色素 C和 caspase-9 的参与。当 Apaf-1 /细胞色素 C
复合体与 ATP /dATP 结合后，Apaf-1 就可以通过其
CARD结构域与 caspase-9 结合，形成凋亡体，激活
caspase-3，启动 caspase级联反应。
3. 8 c-myc
原癌基因家族 c-myc具有促进细胞增殖与凋亡
的双重作用。c-myc蛋白不仅能激活控制细胞增殖
的基因，也可以激活促进细胞凋亡的基因具有双向
调节作用。在 c-myc 基因表达后，如果没有足够的
生长因子持续作用，细胞就发生凋亡;反之，当细胞
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2011 年第 3 期 刘涛等:应激诱导对体外培养早期胚胎细胞凋亡的影响
因子存在，Bcl-2 基因表达时，则促进细胞增殖。李
艳红等［19］采用原位杂交及免疫组织化学 ABC 法，
分别检测小鼠着床前胚胎细胞中 c-myc mRNA及 c-
myc蛋白。结果显示，在小鼠 2-细胞、4-细胞、6-细
胞、8-细胞和囊胚期胚细胞中均检测到原癌基因 c-
myc转录产物的表达，c-myc mRNA分布于胚细胞的
胞质和胞核。免疫组织化学方法发现，2-细胞至囊
胚期胚胎细胞的 c-myc 蛋白均呈免疫反应阳性，阳
性物质分布于胞质和胞核中，胚胎透明带则呈阴性
反应，说明小鼠早期胚胎有 c-myc 基因表达，c-myc
基因对小鼠着床前胚胎发育可能起重要调节作用。
Naz等［20］检测 c-myc 基因在小鼠卵子、2-细胞、4-细
胞、桑葚胚及囊胚等不同发育阶段着床前胚胎的表
达，发现在卵子及桑葚胚中的表达水平较其他阶段
低。向胞质内注入反义 c-myc寡核苷酸探针可抑制
囊胚形成，且最大抑制作用发生在合子到 2-细胞的
第一次卵裂过程。
4 早期胚胎凋亡的信号转导通路
4. 1 线粒体的凋亡信号通路
线粒体不仅是细胞呼吸链和氧化磷酸化的中
心，而且是细胞凋亡的调控中心。细胞的应激反应
或凋亡信号能引起线粒体细胞色素 C 的释放，而细
胞色素 C是通过线粒体 PT 孔或 Bcl-2 家族成员形
成的线粒体跨膜通道释放到胞质中。细胞色素 C
能与 Apaf-1、caspase-9、ATP /dATP 形成凋亡体，被
激活的 caspase-9 可以激活 caspase-3、caspase-7 等，
引发 caspase 级联反应，从而导致细胞凋亡;在
caspase不参与细胞凋亡的的线粒体途径时，随细胞
色素 C释放的蛋白还有 smac、AIF和 EndoG，可引起
细胞凋亡的发生。
4. 2 Fas介导的细胞凋亡
三聚化 Fas 与其配体 FasL 结合后，使胞内的
DD区构象改变，使 3 个 Fas分子的死亡结构域相聚
成簇，与细胞质中另一种带有相同 DD 区的接头蛋
白 FADD的 DD区结合后，FADD 的 N 端 DED 区与
caspase-8 前体蛋白结合，引起 caspase-8，caspase-10
通过自身激活而启动 Caspase 级联反应，Caspase 可
降解胞内结构蛋白和功能蛋白，最终导致细胞凋亡。
5 抑制胚胎凋亡的方式
维生素 E(Vitamin E，VE)又称生育酚，是一组
具有生物活性的化学结构相似的酚类化合物，有重
要的生理功能，起着调节免疫力和控制代谢的作用，
具有抗氧化、抗自由基、抗凋亡和抗衰老等多方面的
功能。维生素 C(Vitamin C，VC) (抗坏血酸)是一种
重要的水溶性抗氧化物质，是细胞外液的主要抗氧
化剂。在某种条件下，Vitamin C 能通过使生育酚与
氧自由基相互作用的产物转为更多的生育酚的方式
而与 VE 协同作用
［21］，提高 VE 的抗氧化能力。Vc
和 VE与生殖系统的作用相对更加明显和直接。体
外培养卵母细胞和胚胎时，发现在培养体系中加入
VE，会对卵母细胞和胚胎的发育产生影响。由于 VE
是脂溶性的，体外培养时用 95%的乙醇配制成 100
倍的浓贮液，培养前用稀释 100 倍，培养基中乙醇的
浓度为 0. 05%，不会对卵母细胞或胚胎产生影响。
Tsujii等［22］在体外培养小鼠胚胎时加入 VE，能够增
加胚胎对葡萄糖的利用，提高囊胚发育率。还有人
发现，VE对 CEOs(卵丘包被的卵母细胞)的卵丘扩
展和减数分裂成熟没有明显影响，但能延缓卵丘细
胞的凋亡;对于 DOs(猪裸卵) ，VE能促进生发泡破
裂，并促进 DOs由 MI期发育到 MII 期，作用的最佳
浓度为 10 μmol /L［23］。
李瑞文等［24］在体外培养的牛孤雌激活胚胎中
添加 VE，VC，研究结果表明，单独添加 VE能够提高
牛孤雌胚的体外发育率和胚泡细胞总数，促进孤雌
胚胎的体外发育力。
金属硫蛋白(MT)是一种低分子量、高巯基含
量，能大量结合重金属离子。过量自由基的产生常
常导致许多疾病，而 MT 是体内清除自由基能力最
强的一种蛋白质，其清除羟自由基的能力约为 SOD
的 10 000 倍，而清除氧自由基的能力约是谷胱甘肽
(CSH)的 25 倍，并且具有很强的抗氧化活性，在体
内可以作为补体抗氧化剂。可见，MT 在各种疾病
的发生及拮抗中发挥着重要的作用。MT 清除自由
基的功能使其在抗衰老、抗氧化压力及细胞凋亡等
过程中发挥着重要作用。
尽管以上几种因素可以对早期胚胎的凋亡起到
一定的抑制作用，但是其机理有待于进一步的研究。
抑制早期胚胎的凋亡可以有助于提高囊胚率，从根
本上改善胚胎的质量。
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(责任编辑 狄艳红)
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