全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 11期
利用 TAIL PCR克隆耐盐基因及其分析
张伟涛 1, 2 程国军2 周俊初2
( 1中南林业科技大学生物环境科学与技术研究所,长沙 410004; 2华中农业大学农业微生物国家重点实验室,武汉 430070 )
摘 要: 通过大量筛选得到一株高耐盐的豇豆根瘤菌 WM E7, 最高可耐 15 g /L NaC,l利用 Tn5sacB转座子对该菌株进
行随机插入突变, 从突变子中筛选获得 30个共生缺陷型突变株。利用 TA ILPCR ( therm a l asymm etric interlaced PCR )方法克隆
了突变株 Tn5sacB侧翼序列, 通过 BLAST发现有 1个突变株的插入失活基因与鼠伤寒沙门氏菌抗银的结合蛋白 SilE有 94%
同源性, 表明有关 Na+离子的抗性基因可能与 Ag+离子的抗性基因有某种关系。该基因在其它菌中也能抗其它金属离子
(铜、锌、钴、铬 )。
关键词: 筛选 耐盐根瘤菌 TAILPCR 耐盐基因
Screening of Salttolerance rhizobium Strains and
Cloning and Analysis of Salttolerance Gene
ZhangW eitao
1, 2
Cheng Guo jun
2
Zhou Junchu
2
(
1
Institute of B iological Enviomental Science﹠ T echnology, Central South University Offorestry﹠ T echno logy, Changsha 410004;
2
NationalLaboratory of AgriculturalM icrob iology, H uazhong Agricultural Univer sity, Wuhan 430070)
Abstrac:t A h igh sa ltto lerance rhizobium stra in w as screened, wh ich can grown on 15 g /L NaC l YMA m edium a t most. U s ing
Tn5sacB inse rtion mutagenesis, 30 saltto le rancedefectivemutants w ere screened by sa ltto lerance expe rim en ts. The DNA sequences of
the contiguous reg ion from theTn5 insertion site were de term ined by therm al asymm etr ic inter laced PCR ( TA ILPCR ). A new genew as
cloned and BLAST analysis of the gene showed a sequence sim ilar ity ( 94% ) to Salmonella typhimurium silver b ind ing prote in S ilE
gene, indicating there are certa in re lationship between gene of resistance to Ag+ and Na+ . BLAST ind ica ting th is gene can resist cop
per, cadm ium, zinc and cobalt et a.l
Key words: Screen ing Sa ltto lerance rh izob ium TAILPCR Saltto lerance gene
收稿日期: 20100621
基金项目:国家 973!项目 ( 001CB1089 ),国家微生物资源平台建设项目 ( 2005DKA212086 )
作者简介:张伟涛,男,硕士,讲师,研究方向:微生物; Em a i:l zhw eitao999@ 126. com
目前全球大约仍有一半的灌溉土地不同程度地
遭受盐渍化的危害, 在我国, 盐碱化趋势严重, 盐碱
化土壤面积约 2 668万 hm2, 耕地约为 667万 hm2。
土地盐渍化已成为影响生物生长发育及发挥作用的
一个重要因素。由于人口膨胀、资源浪费、环境污染
等诸多人类活动的影响,土壤盐碱化越来越严重,许
多生态系统正面临退化的危机 [ 1]。因此, 筛选耐盐
菌株和耐盐基因的克隆及构建耐盐工程菌和植物的
研究受到越来越多地重视。豆科植物根组织中低分
子量的有机物质的渗出以及一些盐分的排出, 都使
得根际的渗透压可能比土壤中的渗透压高; 根瘤菌
与豆科植物根竞争附近水分子, 也使得根瘤菌要有
更完善的渗透调节机制以适应外界环境中渗透胁迫
的影响;此外, 高浓度的盐压对根瘤菌的生长和共生
固氮具有强烈的抑制毒害作用 [ 2]。因此,筛选耐盐
的根瘤菌以及研究根瘤菌的耐盐机制、分离和鉴定
其耐盐基因,对构建耐盐的根瘤菌甚至耐盐植物,改
造农作物,开发利用盐碱地, 增加粮食产量等方面均
有广阔的应用前景,在农业生产上具有重要的理论
意义和应用价值。
本研究在含有 NaC l的平板上筛选到耐 15%
NaC l的豇豆根瘤菌,利用 Tn5sacB转座子进行随机
2010年第 11期 张伟涛等 :利用 TA ILPCR克隆耐盐基因及其分析
插入突变, 拟通过 TALLPCR的方法克隆出 Tn5
sacB插入的失活基因, 并检测基因属于抗金属离子
的特性。
1 材料与方法
11 样品
采自黑龙江德都和宝清县、河北邢台、邯郸和石家
庄、江苏省连云港、湖北红安和广西武鸣等地的土壤。
12 培养基
( 1) YMA培养基:甘露醇 10 g,酵母粉 10 g, K2
HPO 4 05 g, M gSO4 7H 2O 02 g, N aC l 01 g, C aC l2
6H2O 01 g, RH 微量元素液: 4 mL, dH 2O 1 000
mL, pH 68- 70。 ( 2) TY培养基:胰蛋白胨 50 g,
C aC l2 6H 2O 13 g, 酵母粉 30 g。dH 2O至 1 000
mL, pH70- 72。 ( 3) SM培养基: 蔗糖 (或甘露醇 )
100g, K 2HPO4 05 g, N aC l 01 g, M gSO4 7H2O 02
g, C aC l2 6H 2O 01 g, Rh微量元素液 40 mL混合
维生素液 10mL, dH2O至 1 000 mL, pH68- 70。
( 4)筛选培养基: YMA培养基中加入 5 g /L N aC l、8
g /L N aC l、10 g /L NaC l和 15 g /L N aC l。
13 菌株和质粒 (见表 1)
表 1 菌株和质粒
菌株 /质粒 相关特性 来源 /参考
rh izobium WME7 W ild strain Th isw ork
E. col i DH 5 lacZM 15, recA 1, gyrA96, h sdR 17( rK- mK+ ) , F- , supE 44, relA 1 [ 10 ]
S171 R ecA, pro, RP42, T c: : M u, Km: : Tn7 [ 4]
E. col iMM294 Contain pRK2073 [ 6]
pMD18T S equencing vector, Am pr T aKaRa Company
pMH 1701 C arriesTn5sacB, KmrT cr [ 3]
pRK2073 H elper p lasm id, Spe r [ 5]
14 根瘤菌的分离
并以野大豆 (G lycine soja )和豇豆品种早丰一号
和鄂豇一号和为捕获植物, 以土样悬液接种无菌砂
培的豇豆植株, 于温室中生长约 30 d后采集根瘤,
经 3%的 N aC lO2表面消毒后,用平板划线法分离、纯
化根瘤菌, 挑取单菌落, 转接并保存于 YMA斜面。
于无菌双层砂钵中进行根瘤菌的宿主回接试验。
15 耐盐根瘤菌的筛选
将分离到的根瘤菌选取单菌落点接于选择性培
养基 (N aC l平板 ) ,培养 3- 7 d后观察。
16 三亲本杂交及缺陷突变体库的构建
以 pMH1701[ 3 ]含 Tn5sacB, Kmr, Tcr待转移质
粒的大肠杆菌为供体菌 S171[ 4] , 筛选出来的高耐
盐菌WME7为受体菌,含质粒 pRK2073[ 5]的大肠杆
菌 MM294[ 6]为辅助菌进行三亲本杂交。根瘤菌在
TY培养基上培养 2 d,供体菌和辅助菌分别在含相
应抗生素的 LB培养基上振荡培养过夜, 以 2∀2∀1
的比例分别收集菌体,混合均匀, 用 TY洗涤 2次,
然后将细胞悬浮在约 50- 70 L的 TY液体中, 滴
加于 SM平板上的灭菌微孔滤膜上, 28# 培养 3 d
后, 用 2mL无菌水将滤膜上的菌体制成菌悬液, 取
10
- 4和 10- 5涂布平板, 28# 培养 4 - 5 d, 待平板上
长出单菌落后, 于含 Km 的 SM平板再划线分离纯
化一次后编号保存。挑取接合子, 分别用牙签点种
于 Tc+ Km的 SM平板, 7%蔗糖 + Km的 SM平板以
及只含有 Km的 SM平板,选择 Tc和蔗糖都敏感的
突变株构建突变体库。
17 TA ILPCR ( thermal asymmetric interlaced PCR)
及突变体 Tn5sacB插入失活基因的克隆
采用 TA ILPCR的方法扩增根瘤菌基因组中
与 Tn5sacB相邻的寡核酸片段。根据 Tn5序列
设计了 3个嵌套引物 PF1 5∃AGAGAACACAGATT
TAGCCCAGTCGG3∃、PF2 5∃CCGCACGATGAAGAG
CAGAAGTTAT3∃和 PF3 5∃GATCCTGGAAAACGG
GAAAGGTTC3∃作为长引物, 短引物为随机简并引
物 AD( AD1 5∃( A /T ) GTGNAG ( A /T ) ANCANAGA
3∃或 AD2 5∃GTNCGA ( C /G ) ( A /T ) CANA ( A /T )
GTT3∃)。以 PF和 AD为引物对,菌体总 DNA为模
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
板进行 3轮 PCR反应。 PCR在 9600 PCR仪上进
行,具体反应条件和反应步骤如下 [ 7]。
循环数 反应条件
1 95# ( 1 m in)
5 94# ( 15 s) , 65# ( 1 m in) , 72#
( 2 m in)
1 94# ( 15 s) , 30# ( 3 m in), 72#
( 5 m in)
10 94# ( 5 s) , 45# ( 1 m in) , 72#
( 2 m in)
12
94# ( 5 s) , 65# ( lm in) , 72#
( 2m in)
94# ( 5 s) , 65# ( 1 m in) , 72#
( 2 m in)
94# ( 5 s) , 45# ( 1 m in) , 72#
( 2 m in)
1 72# ( 7 m in)
第一轮反应结束后,用去离子水将产物稀释 50
倍,取 1 L作为第二轮反应模板, 引物为 PF2和
AD,反应步骤如下:
循环数 反应条件
1 95# ( 1 m in)
25
94# ( 5 s), 65# ( 1 m in) ,
72# ( 2 m in)
94# ( 5 s), 65# ( 1 m in) ,
72# ( 2 m in)
94# ( 5 s), 45# ( 1 m in) ,
72# ( 2m in)
1 72# ( 7 m in)
第二轮反应结束后,用去离子水将产物稀释 50
倍,取 1 L作为第三轮反应模板, 引物为 PF3和
AD,反应步骤如下:
循环数 反应条件
1 95# ( 1 m in)
25 94# ( 10 s), 45# ( 1 m in), 72# ( 2 m in)
1 72# ( 7 m in)
第三轮反应产物经琼脂糖电泳分离纯化后,将
TA ILPCR第三轮产物经琼脂糖凝胶回收后,将扩增
产物克隆在 pMD18T载体 ( T aK aRa公司 )上, 转化
大肠杆菌 DH 5, 并测定其全序列。将测序结果输
入 NCB I中用 B last程序交送 GenBank库与数据库
已有序列进行比较分析。
2 结果与分析
21 筛选结果
从 7个不同地区分离到 44株大豆根瘤菌 [ 8]和
52株豇豆根瘤菌 [ 9] ,有 3株根瘤菌可以在 10 g /L盐
平板生长, 其中来自广西武鸣地的鄂豇一号 WME7
是高抗盐菌株,可在 15 g /L YMA培养基上生长。
22 WME7菌株 Tn5sacB插入缺陷突变体库
的构建
挑取三亲本杂交后的接合子,分别用牙签点种于
Tc+ Km的 SM平板, 7%蔗糖 + Km的 SM平板以及
只含有 Km的 SM平板,选择 Tc和蔗糖都敏感的突变
株构建突变体库。结果显示用于筛选的突变体都对
Tc和蔗糖敏感, 表明突变体库中所有菌株均为 Tn5
sacB插入突变体, 并且突变体中都不含 pMH1701质
粒,命名为 SF1、SF2、SF3%% %SF3200。
23 Tn5sacB插入突变体的耐盐功能鉴定
从突变体库中随机挑选 800株 Tn5sacB插入
突变体进行耐盐功能的鉴定。接种到 10 g /L NaC l
的 SM平板上, 3 d后观察突变株的耐盐表型。筛选
出 30个可能为耐盐缺陷表型的突变株, 如图 1所
示, 对获得的耐盐突变株进行重复试验时,也得到同
样的结果,表明这 30个突变株均为耐盐缺陷型, 可
用于下一步的基因克隆研究。
在 10 g/L N aC l+ Km平板上不长的为盐敏感突变体
图 1 10 g /L NaC l + Km 对照
24 突变体 Tn5sacB插入失活基因的克隆
这样经过 3轮 TA ILPCRPCR反应可以获得与
Tn5sacB相邻的染色体 DNA片段 (图 2)。将 TA IL
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2010年第 11期 张伟涛等 :利用 TA ILPCR克隆耐盐基因及其分析
PCR第 3轮产物经琼脂糖凝胶回收后, 将扩增产物
克隆在 pMD18T载体 ( TaKaR a公司 )上, 转化大肠
杆菌 DH5[ 6] , 并测定其全序列。将测序结果输入
NCB I中用 B last程序交送 GenBank库与数据库已有
序列进行比较分析。
M . M arker V; 1. SF307; 4. SF552; 8. SF670
图 2 TA ILPCR产物凝胶电泳图
25 突变体 Tn5sacB插入失活基因的序列分析
测序反应获得的序列如下, 通过 B lastn软件作
同源性比较分析,确定缺陷突变体 Tn5sacB插入位
点的同源基因。结果表明, SF552序列 (图 3)与鼠
伤寒沙门氏菌 ( Salmonella typhimurium )抗银基因簇
相似性最高, 与该抗银基因簇中的 silE 序列 [ 10]
( gbAF067954)有 94% 的相似性, 该抗银基因簇有
silE、silS、silR、silC、silB、silA、silP 和 silL, 大小有
14 211 bp,表达银结合蛋白、膜应激蛋白、转录激活
子、膜融合蛋白、银离子共运体和与转运有关的 ATP
酶。核酸 BLAST表明该基因除了能抗银还能抗铜、
锌、镉和钴等金属离子, 蛋白质 BLAST 在绿脓杆
菌 [ 11]、大肠杆菌的 R质粒 [ 12]、肺炎克氏杆菌的质
粒 [ 13]、腐败希瓦氏菌和阪崎肠杆菌 (文章未发表 )
等菌中也发现。
图 3 突变体 SF552插入失活基因的序列
3 讨论
按我国土壤盐渍化程度分级, 非 !级土壤含
盐量一般小于 01% , 轻 !级土壤含盐量在 02%
- 04%之间, 中!级含盐量为 04% - 06% 间,
重 !级在 06% - 10%之间 [ 14]。大多数作物在
我国盐渍化程度 轻 !级土壤中生长会受到影响,
致使产量降低。在 中 !级或 重 !级土壤中不能
生长。因此, 筛选耐盐的菌株、克隆耐盐基因、研
究耐盐机制及构建耐盐工程菌和植物越来越多地
受到关注。然而生物体耐盐机制复杂, 参与耐盐
调控的基因众多, 许多深层次的调控机制目前还
处于探索阶段。目前, 已相继分离和鉴定了与渗
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
透调节保护物合成途径有关的结构基因, 如 pro
ABC和 bet基因以及转录、表达受到渗透压调控的
一些操纵子, 如 kdp操纵子、Pro和 Opu系统还有
作为全细胞调节因素的 OmpR系统 [ 2]。然而, 对
于有重要经济价值的根瘤菌, 研究的比较少, 目前
的研究工作基本上集中在根瘤菌对渗透胁迫的生
理学反应和相关渗透调节保护物的鉴定方面。最
近发现和鉴定了苜蓿中华根瘤菌 ( S. m eliloti)中调
控甘氨酸甜菜碱合成的操纵子 betC IBA [ 15 ]。其
中, betC基因编码硫酸胆碱酶, 催化硫酸胆碱、磷
酸胆碱生成胆碱, betI基因编码调节蛋白; be tB基
因编码甜菜碱脱氢酶, betA基因编码胆碱脱氢酶,
它们共同催化胆碱生成甜菜醛, 并由甜菜醛生成
甘氨酸甜菜碱。同时还克隆了苜蓿中华根瘤菌的
壁膜间隙葡聚糖合成基因 ndvB和 ndvA。NdvB是
一个大的细胞膜蛋白, 分子量是 319 kD, N dvB能
够使 UDP葡萄搪形成环状的 !1, 2多聚葡萄糖, N
未端的 60%是葡聚糖合成所必需的。N dvA是一
个 67 kD的胞质蛋白, 与依赖蛋白质的转运系统具
有氨基酸序列的同源性, 所以认为 NdvA的功能是
转运环状的葡聚糖分子到壁膜间隙, 最终到外界
环境 [ 16]。本研究克隆一个与耐盐有关的基因, 该
基因在其它菌能抗银、铜、镉等离子。
转座子随机插入突变方法是广泛应用于基因
定位及其功能研究的一种常用方法, 特别在对微
生物抗逆相关基因及其调控基因的研究方面应用
广泛。Tn5是常用的一种转座子, 具有转座频率
高、转座后比较稳定、插入位点随机和带有抗性标
记易于选择等特点。 pMH 1701为携带 Tn5转座子
的自杀性质粒,在根瘤菌中不能复制,转座子只有
插入基因组中才能在根瘤菌中存在。本研究利用
pMH 1701对筛选出高耐盐的豇豆根瘤菌 WME7
进行 Tn5sacB插入诱变, 构建了突变体库; 然后对
突变体库的 3 200株突变体进行耐盐试验, 筛选到
30株耐盐缺陷突变体,使用 TA ILPCR方法克隆了
突变株 Tn5sacB侧翼序列, 结果发现有 1个突变
株的插入失活基因与鼠伤寒沙门氏菌抗银的结合
蛋白 Silc有 94%同源性。同时该基因能抗银、铜、
锌、镉、钴等, 在绿脓杆菌、大肠杆菌的 R质粒、肺
炎克氏杆菌的质粒、腐败希瓦氏菌和阪崎肠杆菌
等菌也发现该基因。推测该基因能在不同的抗金
属离子细菌中存在, 能抗多种金属, 因此是研究各
种抗性基因很好的材料。同时本研究获得了一批
耐盐缺失菌株和 Tn5插入突变菌株菌株, 为继续
研究根瘤菌的耐盐功能和其它生物学功能打下了
良好的研究基础, 也为研究根瘤菌的其它功能基
因建立了切实可行的方法。由于与其同源的抗银
基因片段有 1万多个碱基, 通过 PCR方法克隆基
因,再转于突变体中做功能互补比较困难, 可以考
虑采用做文库的方法, 通过酶切酶联克隆到质粒
中,再转于突变体中做功能互补。
参 考 文 献
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(下转第 176页 )
170
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 11期
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