全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 8期
植物 RNA i的特点及其应用研究进展
白描　杨国顺　陈石　张美玲
(湖南农业大学园艺园林学院 国家柑橘改良中心长沙分中心 ,长沙 410128)
　　摘 　要 : 　RNA i是真核生物中普遍存在的抵抗病毒复制表达、抑制转座子转座及调控基因表达的监控机制。清楚植物
体内的 RNA i途径 ,将对认识植物基因组功能和转基因研究工作具有积极意义。就国内外与植物 RNA i有关的研究作了综述 ,
重点介绍了植物 RNA i特征和该技术在植物基因工程中的应用。
关键词 : 　RNA干扰 　转录后基因沉默 　植物 　应用
Progress of the RNA i Character istics and Its Application in Plants
Bai M iao　Yang Guoshun　Chen Shi　Zhang Meiling
( Hunan Agricultural University, College of Horticulture and Landscape, N ational Center for C itrus Im provem ent, Changsha 410128)
　　Abs trac t: 　RNA i has been p roved to be a phenomenon in a variety of organism s1 Eukaryotic RNA i is the common exp ression of re2
sistance virus rep lication, inhibition transposon transposable gene exp ression and regulation of the supervisory mechanism1 Clearly un2
derstanding the RNA i channels in the p lants would be of positive significance for functional genom ics and transgenic research1 The pur2
pose of this brief review was to highlight the p lant RNA i related research, and focused on the characteristics of p lants RNA i and the ap2
p lication in p lant genetic engineering1
Key wo rds: 　RNA interference　Post2transcrip tional gene silence　Plants　App lication
收稿日期 : 2009201224
基金项目 :本研究受长沙市科技局资助 ( K068023222)
作者简介 :白描 (19842) ,男 ,在读研究生 ,主要从事园艺植物生物技术研究 ; E2mail: baim iao1984@ yahoo1cn
通讯作者 :杨国顺 (19692) ,男 ,教授 ; E2mail: guoshunyang@ yahoo1com1cn
　　基因沉默可以分为两大类 :一类为位置效应
(position effect) ,由外源基因插入染色体位置 (如异
染色质 )所引起 ;另一类为同源依赖的基因沉默 ( ho2
mology dependent gene silencing, HDGS) ,由多拷贝
外源基因间或外源基因与内源基因间序列同源互
补 ,而诱发表观遗传失活。HDGS根据其沉默发生
时期又分为 ,转录水平的基因沉默 ( transcrip tional
gene silence, TGS)和转录后水平基因沉默 ( post2
transcrip tional gene silence, PTGS)。
1998年 Fire等 [ 1 ]首次发现并将由双链 RNA
( double stranded RNA, dsRNA )诱导的抑制序列同
源性基因表达的现象定义为 RNA干扰 (RNA inter2
ference, RNA i)。RNA i的发现科学地揭示了 PTGS
的产生机制。RNA i在许多生物中普遍存在 ,如植
物、果蝇、锥虫、涡虫以及哺乳动物等。众多试验表
明 , RNA i是真核生物中普遍存在的抵抗病毒复制表
达、抑制转座子转座及调控基因表达的监控机制。
了解植物体内的 RNA i途径 ,将对认识植物基因组
功能和转基因研究工作具有积极意义。
1　植物 RNA i的机制
在大量的生化和遗传学研究的基础上 ,植物学家
逐步总结出了植物的 RNAi作用机制模型。典型的
RNAi途径分为起始、效应和信号扩增 3个阶段 ,其核
心机制包括 :由 D icer样 (D ICER2like,DCL)酶将 dsRNA
处理为 21 ～25 nt大小的 siRNA ( small2interference
RNA)。这些 siRNA s的一条链与 RNA沉默复合物结
合 (RNA2induced silencing complex, R ISC)并指导靶
mRNA的降解。信号扩增需要 RDR酶 (RNA2depend2
ent RNA polymerase)以 RNA为模板 ,合成 dsRNA,并被
DCL切割为次级 siRNA,进入新一轮 RNA i效应。
2　植物 RNA i的特点
研究表明 ,各种生物中 RNA i途径有共同的作
2009年第 8期 白描等 :植物 RNA i的特点及其应用研究进展
用机理 ,而对于植物来说 ,其 RNA i机制有其独特之
处 ,主要表现在以下方面。
211　多种途径介导基因沉默
21111　siRNA介导的基因沉默 　该沉默效应主要
发生在细胞质 ,推测是植物自身用来抵御病毒感染
的一种保守机制 ,因为 dsRNA是 RNA病毒的复制
中间体或单链 RNA 的二级结构的特征 ; 而对于
DNA病毒 ,可通过重叠的互补转录物的退火来形成
dsRNA。在许多转基因研究工作中 ,大部分转基因
沉默都表现为 siRNA 沉默。试验证明植物不同长
度的 siRNA指导不同形式的基因沉默 ,一般 21～22
nt siRNA参与 mRNA的降解 , 24～26 nt siRNA指导
系统性基因沉默和同源 DNA的甲基化 [ 2 ]。
21112　m iRNA介导的内源性 mRNA沉默 　与 siR2
NA不同 , m iRNA (m icroRNA )是一类长为 19～25 nt
的单链 RNA。由内源性发夹结构转录产物经 D icer
样酶切 ,先以双链的形式存在 ,最后释放互补链形成
成熟的 m iRNA。成熟的 m iRNA通过结合 R ISC行
使类似 siRNA的沉默功能。m iRNA被认为是生物
体中最重要的一类调节因子。其主要功能是调节生
物体内在的与机体生长、发育、疾病发生过程有关的
基因的表达。植物中 m iRNA多与靶 mRNA完全互
补 ,直接导致同源 mRNA的降解。而在动物中 m iR2
NA与靶 mRNA之间的互补性较差 ,多为部分配对 ,
导致靶基因的抑制而非降解。
21113　指导细胞核内 RNA i途径 　植物中 dsRNA
介导的细胞核内 RNA i途径主要体现在 : RNA介导
的 DNA甲基化 (RNA2directed DNA methylation, Rd2
DM )和 RNA i介导的异染色质的形成 ,分别导致了
DNA胞嘧啶甲基化和组蛋白 Lys29甲基化 ,甲基化
使对应的基因转录活性受抑制。
212　植物 RNA i的放大效应与系统性
植物中 RNA i具有高效性 ,即只需要少量 siRNA
或 dsRNA就可以达到理想的沉默效果 ,主要是通过
RdRP指导降解性 PCR来实现。降解性 PCR所需
的关键性酶 RdRP首先是在番茄中分离并鉴定出
来 [ 3 ] ,后又分离鉴定出了拟南芥中的 RdRP同源物
sgs2 / sde1[ 4 ] ,而在果蝇和人细胞中还未发现 RdRP。
在植物 RNA i途径中一个 dsRNA可以被切割为多个
siRNA ,并且 siRNA及 R ISC的重复使用 ,都为 RNA i
的高效性提供了物质保障。
另外 ,沉默效应能通过植物分子运输系统进行
系统扩散。如植物沉默信号可以通过胞间连丝进行
的细胞间运输 ,也可以通过韧皮部转运系统进行的
长距离运输 [ 5 ] ,而且基因转录后沉默信号可以通过
嫁接面在植物内双向传递 [ 6 ]。B rosnan等 [ 7 ]分析了
蛋白及酶系统等在植物系统性沉默 ( systematic si2
lencing)途径中分担不同角色 ,并确定了沉默信号按
Pol IVa2RDR22DCL32AGO4通路传输的设想。植物
系统性沉默的主要功能体现在整个植物体转移病毒
抗性 ,阻断病毒进一步感染上。
213　植物 RNA i的 RNA靶区的扩散
RNA i的 RNA靶区的扩散即 RNA沉默效应可
以从起始 siRNA 同源区向临近的 5′和 3′端扩散。
线虫和植物中均发现了这种过渡性 RNA i ( transitive
RNA i)现象 ,但线虫中这种效应似乎表现为只能向
5′端延伸的极性。利用过渡性 RNA i策略通过
RdRP由初级靶区向上游延伸合成 dsRNA产生 siR2
NA,可促进与其同源的基因家族基因的沉默。显然
RDR酶在沉默效应的扩大和转移中都起到关键的
作用 ,可以预见随着有关 RDR酶的深入研究 , RNA i
深层次机理将会不断丰富。
214　植物中 RNA i的抑制
植物中 RNA i表现为基因组水平的免疫现象 ,
是一种植物对抗来自外来基因 (如病毒 )表达的防
御机制。而在漫长的进化过程中 ,一些病毒为了生
存相应地也产生了反防御机制 ,一般是通过表达抗
沉默的抑制蛋白 ,如 P19蛋白、辅助蛋白 (HC2Pro)、
2 b蛋白、P50蛋白等。另外 ,所有能够抑制 RNA i
途径中各组分的行使功能的因素 ,都可以认为是
RNA i的抑制子 ( supp ressor)。而有意思的是 ,烟草
花叶病毒为减轻对寄主造成的过度伤害 ,通过自身
的运动蛋白 (MP)增强植物的 RNA沉默的扩散 ,而
抑制自身的繁殖 [ 8 ]。
3　RNA i在植物中的应用
植物 RNA i具有特异性、高效性、系统性以及可
遗传性等特点。可利用 RNA i技术进行基因功能研
究的初步筛选 ,或直接利用 RNA i创造的特殊性状
变异体进行植物改良 ,同时在植物发育的不同阶段
抑制特定基因的表达 ,对发育生物学研究也具有重
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
要意义。另外利用 RNA i的系统性等特征 ,也有望
在植物防虫、抗病、抗逆等方面取得突破。
311　基因功能的研究
后基因组的主要工作是将已经测序的大量基因
进行功能性分析。构建 RNA干扰文库显然是对传
统基因功能研究方法的重要补充。RNA i文库技术
进行功能基因组研究的基本思路 :根据已测基因序
列 ,预测设计对应各个基因序列的有效 siRNA 或
dsRNA,构成基因组的 RNA i文库 ,将文库中不同序
列的 siRNA或 dsRNA分别导入不同个体的细胞内 ,
通过观察对应的缺失表型可以大致确定基因功能。
RNA i文库技术作为高通量基因功能分析工具 ,具有
操作简单 ,周期短 ,成本低、高特异性和高效性等特
点。而作为转录后基因沉默的手段 , RNA i拥有与传
统的基因研究方法所不具备的优势。如针对植物生
长发育必需基因的研究 ,通过传统的基因敲除手段
便较难实现。如 Nunes等 [ 9 ]采用 RNA i技术沉默
GmM IPS1基因 ,在 RNA i再生植株中没有检测到
GmM IPS1的表达 ,同时种子发育受阻现象 ,表明
GmM IPS1 基因的表达和种子发育有密切关系。
RNA i技术亦可用于家族基因的研究 ,M iki等 [ 10 ]设
计水稻 O sR ac基因家族中高保守性序列构建 RNA i
载体 ,结果不同效率地抑制了所有成员基因的表达 ,
并证明该基因家族在生长发育过程中有重要的
作用。
随着对 RNA i途径的不断认识 ,研究者也对
RNA i技术体系作了许多改进。现今用于植物 RNA i
技术按导入方式的不同有粒子轰击、病毒诱导基因
沉默 ( virus2induced gene silencing, V IGS)、农杆菌介
导等方式。粒子轰击指用基因枪将包裹有 siRNA s
或 dsRNA s的金粉或钨粉直接轰击整合入细胞组
中 ; V IGS是通过对已知植物病毒的改造 ,将合适的
目标序列整合入病毒载体中 ,然后感染寄主植物体
内并超表达目标序列的正义链或反义链 ,或通读表
达其反向重复序列形成 dsRNA,诱发 RNA i途径。
前两种方法多用于瞬时基因沉默效应的研究 ,而要
获得长效并稳定遗传的基因沉默效果 ,则需要利用
到农杆菌介导体内表达 dsRNA s。一般做法是针对
靶基因 ,设计反向重复序列构建成含发夹结构的双
链 RNA ( hairp in RNA , hpRNA ) T2DNA质粒或含内含
子的 ihpRNA ( intron2containing hairp in RNA )表达载
体 ,然后利用农杆菌介导转化整合到植物染色体中 ,
通读反向重复序列转录形成 dsRNA,进而诱导 RNA i
的产生。Helliwell等 [ 11 ]对比发现 ihpRNA表达质粒
载体比 hpRNA 质粒沉默效率要高。另外 , Zhai
等 [ 12 ]以拟南芥的原生质体作为研究材料 ,利用
RNA干扰的方法成功的降低了谷胱甘肽合成途径
中关键酶基因 A tECS1的表达 ,并对这一新的方法作
了一系列改进 ,研究认为原生质体 RNA i以它快速、
耗费成本低和占用空间小等优点 ,可作为现有的遗
传工具一个有效的补充 ,可为所挑选的植物基因的
功能研究进行初步地筛选。
312　植物遗传改良
将 RNA i技术应用于植物遗传改良的基本思
路 :分析目的基因的功能和表达途径 ,利用 RNA i技
术抑制相关基因的表达 ,使目的基因产物表达受阻
或向特定的方向富集。如 Davuluri等 [ 13 ]采用果实
特异启动子结合 RNA i技术来抑制番茄内源光形态
建成调节基因 D ET1的表达 ,结果显示再生植株中
D ET1的表达下降 ,类胡萝卜素和类黄酮含量明显
升高 ,而果实的其它品质参数没有发生大的改变。
这表明利用器官特异基因的沉默可以有针对性的改
善植物营养品质。青蒿素是一种有效的抗疟疾药
物 ,但在青蒿中含量很低。 Zhang等 [ 14 ] 通过发夹
RNA介导的 RNA i技术 ,抑制青蒿素生物合成途径
中一个关键酶 SQS基因的表达 ,农杆菌介导转化获
得了 23个独立的阳性转基因植株。HPLC2ELSD分
析结果表明 ,青蒿素含量在某些转基因植株中明显
增加 ,最高达到 3114 mg/g (干重 ) ,约为对照的 3114
倍。这预示 , RNA干扰是一种改变植物代谢物含量
的有效基因工程策略。
为验证 RNA i对植物遗传改良的效果 , W ang
等 [ 15 ]靶向烟草中 1, 42丁二胺 2氮 2甲基转移酶基因 ,
比较并利用 RNA i、共抑制和反义链等 3种介导该基
因沉默的方法 ,获得了 200个尼古丁的含量减少
911% ～9617%的转基因烟草株系 ,并证实 RNA i在
基因沉默中是最有效的 ,而另两种方法不太有效。
在花卉改良方面 ,应用 RNA i技术干涉与色素
形成有关的基因 ,能诱导产生一些不同寻常颜色甚
至花型的花 [ 16 ] ,如日本和澳大利亚研究者就利用
8
2009年第 8期 白描等 :植物 RNA i的特点及其应用研究进展
RNA i沉默玫瑰中二氢黄酮醇 42还原酶基因 ,培育
出了蓝色玫瑰。
313　植物抗性研究
在植物抗病毒方面 , RNA i一开始就被认为是真
核生物中普遍存在的外源核酸 (如病毒 )入侵的防
御机制 ,即利用基因转化系统将表达与病毒同源的
dsRNA的载体整合到植物基因组 ,表达后就能够引
起病毒基因组的特异性降解 ,阻止病毒的复制扩散 ,
并可获得稳定遗传的抗病毒植物。
Shim izu等 [ 17 ]利用 RNA i,沉默了水稻矮缩病毒
的一个病毒原质基质蛋白基因 Pns12 ,结果获得了
病毒抗性的转基因水稻。Kamachi等 [ 18 ]利用 RNA
沉默技术靶向黄瓜绿斑驳花叶病毒 (CGMMV )的外
壳蛋白 (CP)序列。获得了 7个独立的转基因系 ,分
别接种 CGMMV 后检测出其中 5 个株系显示对
CGMMV的系统抗性 ,并能检测到 CP序列特异的
siRNA。这些研究都证明 , RNA i技术是非常有效的
抵抗植物病毒的方法。W ang等 [ 19 ]以大麦黄矮病毒
(BYDV2PAV )的多聚酶基因反向重复序列载体
( hpBYDVpol)转化大麦 ,获得了 PAV免疫植株。他
们还观察到转基因植株同时受到大麦黄矮病毒
(BYDV2PAV )和谷类黄矮病毒 ( CYDV2PAV )侵染
时 ,仅表现对前者免疫 ,而对后者感染 ,证明了 RNA i
技术的序列特异性。最近 , Katiyar2Agarwal等 [ 20 ]发
现了一种由细菌病原体诱导产生的内源性 siR2
NA———nat2siRNAATGB2,并证明真核生物宿主细胞
不仅可以通过 RNA i防御病毒侵染 ,也能利用 siRNA
防御细菌侵染。这一研究将对植物细菌性病害的防
治有积极意义。
植物抗虫方面 ,通过 RNA i技术下调表达的特
异基因 ,已被广泛用于线虫的基因研究。该方法依
赖于微注射或饲喂 dsRNA ,而在作物抗虫的实际应
用中行不通。但最近的结果表明 ,双链 RNA作为昆
虫的可食成分可以有效地下调目标基因。更重要的
是 ,针对合适的靶基因表达双链 RNA在转基因抗虫
植物中已经显示出获得性虫害防御 ,这为新一代抗
虫作物的研制开辟了道路 [ 21 ]。
Sindhu等 [ 22 ]利用 RNA i转基因改造的拟南芥 ,诱
导其寄生的甜菜孢囊线虫 4个生命周期相关基因的
沉默。发现线虫在取食 RNA i植物后 ,相应的 4个线
虫基因表达丰度显著降低 ,并导致不同干扰株系中的
成熟雌性线虫减少 23% ～64%。这表明 ,通过 RNA i
定位于寄生虫的生命周期相关的基因 ,可有效地获得
水平抗性作物。Mao等 [ 23 ]验证了 CYP6AE14基因编
码的细胞色素 P450,能赋予棉铃虫对棉酚的耐受力。
而当喂养表达对应双链 RNA的转基因植物材料后 ,
发现 CYP6AE14转录本明显减少 ,幼虫表现出生长延
缓。该研究表明 ,昆虫取食表达双链 RNA的植物材
料 ,可触发昆虫的 RNA干扰 ,预示该技术可以应用到
昆虫学研究和田间虫害控制中。
在植物抗逆研究中 ,虽然还未见到利用 RNA i
技术改造植物获得抗旱品种的报道。但 Marzin
等 [ 24 ]利用瞬时基因沉默 ( transient induced gene si2
lencing, TIGS)的方法靶定大量大麦干旱胁迫应答相
关的基因 ,快速筛选出了 4个关键的干旱应答基因。
它们分别编码大麦干旱应答因子 HvDRF1 (DREB22
like)、脱水素 6、胚胎发育后期丰富蛋白 HVA1和液
泡膜 Na /H逆向转运蛋白 HvHNX1。这一结果显示
TIGS系统对大量干旱或脱水胁迫候选基因的预筛
选工作十分有效。
4　展望
从基因工程的发展来看 ,任何一个研究工具总
有其适用范围 , RNA i技术也不例外。RNA i的某些
特性既是其作为研究工具的有利前提 ,也是限制其
发展的因素 ,在研究试验设计中不可忽视。如由于
RNA i的高特异性 ,在进行基因功能的研究时 ,其他
冗余基因可能弥补 RNA i造成的功能缺失 ,引起表
型不明显 (假阴性 )。反过来过度性 RNA i又可能潜
在地影响特异性 ,导致与目的基因同源基因的沉默。
目前 ,与 RNA i途径相关的核酸、蛋白等成分及作用
模式并不是特别清晰 ,如 DCL 精确的剪切机制、
R ISC对 siRNA正反两条链准确识别的问题、系统性
RNA i效应的机制及其信号分子等 ,这给该技术在应
用方面 ,带来一些不可预知的后果。另外 ,植物与线
虫等低等生物相比导入 dsRNA比较困难、耗时长 ,
而且针对不同的植物转化体系还不健全 ,不同外界
因素对诱导沉默的影响还不甚明了 ,这些都阻碍了
RNA i技术的发展。针对 RNA i的局限性 ,如果研究
者能够充分掌握 RNA i的深层原理 ,灵活的设计与
运用 ,该技术在植物功能基因组、遗传育种、植病防
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 8期
治等方面研究中将发挥更关键性的作用。
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