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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 10 期
制备高效大肠杆菌电转化感受态
细胞和电转化条件的研究
朱森康1，2 黄磊2 李燕飞2，3 钟卫鸿1 徐志南2
(1浙江工业大学生物与环境工程学院，杭州 310032;
2浙江大学化学工程与生物工程学系，杭州 310027;3浙江工业大学药学院，杭州 310032)
摘 要: 旨在建立一种高效大肠杆菌电转化感受态细胞的制备方法，研究了摇瓶装液量，菌体生长阶段，转化电场强
度，转化后复苏时间以及感受态细胞存放时间等对转化效率的影响。结果表明，装液量为 400 mL /2 L，菌体在 OD600值为
0. 452 时收集所制备的感受态细胞，在电场强度 12. 5 kV /cm 条件下电击 5 ms，转化后复苏时间 2 h，转化效率可达到 1010
CFU /μg DNA。此条件下制备的感受态细胞转化效率高，质量稳定，重复性好。
关键词: 大肠杆菌 电转化 感受态细胞 转化效率
Preparation of Efficient Electrotransformation Competent
Cells of Escherichia coli and Condition of Electrotransformation
Zhu Senkang1，2 Huang Lei2 Li Yanfei2，3 Zhong Weihong1 Xu Zhinan2
(1College of Biological and Environmental Engineering，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032;
2 Department Chemical and Biological Engineering，Zhejiang University，Hangzhou 310027;
3College of Pharmaceutical Science，Zhejiang University of Technology，Hangzhou 310032)
Abstract: The aim of this study was to optimize the preparation of E． coli electrotransformation competent cells． In the present
work，the effects of different prepare conditions were systematically investigated to improve the transformation efficiency of the competent
cells． The optimal conditions were determined as follows:cultivation in 400 ml /2 L LB medium，collection of the cells at OD600 of
0. 452，electrotransformation at 12. 5 kV /cm for 5 ms，posttransformation culture for 2 h． Under these conditions，the transformation effi-
ciency could reach 1010 CFU /μg DNA．
Key words: Escherichia coli Electrotransformation Competent cells Transformation efficiency
收稿日期:2011-03-25
基金项目:国家自然科学基金项目(21006088) ，浙江省自然科学基金项目(Y4100344)
作者简介:朱森康，男，硕士研究生，研究方向:生物化学与分子生物学;E-mail:zskchuangqiang@ gmail． com
通讯作者:黄磊，男，博士，讲师，E-mail:lhuangblue@ zju． edu． cn
感受态细胞的制备和转化是现代分子生物学实
验中一项重要的常规操作技术［1］，可用于基因克隆
以及 DNA文库构建等研究。自 Cohen 首次报道质
粒 DNA 转化大肠杆菌(Escherichia coli，E． coli)以
来，转化效率就一直是研究者们所关心的热点问
题［2］。目前转化方法很多，如氯化钙法、Hanahan［3］
法以及 Inoue［4］法。但这些方法转化效率最高达到
106 － 107 CFU /μg DNA，只能满足一般常规克隆的
需求。对于涉及构建基因文库、抗体库和突变库等
研究，这样的转化效率就不能满足试验要求。研究
发现电转化方法是有效提高转化效率的途径之一，
然而普通电转化方法的转化效率也只有 108 －
109 CFU /μg DNA，本研究对电转化感受态细胞制备
及电转化条件中几个关键因素进行探索，所制备的
感受态细胞转化效率可达 1010 CFU /μg DNA。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌种和质粒 E． coli DH5α 菌株和质粒
2011 年第 10 期 朱森康等:制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究
pUC18 均为本实验室保存。
1. 1. 2 主要试验仪器及培养基 分光光度计 Ultro-
spec 3300 pro购自 Amersham Biosciences(Sweden)。
0. 2 cm电击杯和 gene Pulser II 电脉冲基因转移仪
均购自 Bio-Rad公司。LB培养基:1% (W/V)蛋白
胨，0. 5% (W/V)酵母粉，1% (W/V)氯化钠。
SOC培养基:2% (W/V)蛋白胨，0. 5% (W/V)酵
母粉，0. 05% (W/V)氯化钠，0. 186 g /L 氯化钾，
0. 95 g /L 氯化镁，3. 6 g /L葡萄糖。甘油为国产分
析纯，氨苄青霉素(Amp)购自 TaKaRa 宝生物
公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 感受态细胞的制备 从新鲜活化 LB 平板
上挑取单菌落，接种于 50 mL LB 培养基中，37℃，
220 r /min 振荡培养过夜制备种子液。种子液按
1%转接到一定装液量的 LB 培养基中，37℃，
220 r /min 振荡培养。培养一定时间，测定菌液浓度
OD600达到一定值后，取出培养三角瓶，冰浴冷却
20 min，4℃，5 000 r /min 离心 15 min，倾去上清液;
将细胞重悬于预冷的去离子水中，4℃，5 000 r /min
离心 10 min，重复清洗 3 次。再将细胞重悬于预冷
的 10%(V /V)甘油溶液中，4℃，8 000 r /min 离心
10 min，重复清洗 3 次。最后细胞用 1 /1 000 初始菌
液体积的预冷 10%(V /V)甘油溶液重悬，100 μL分
装至 1. 5 mL离心管中，保存于 － 85℃备用。
1. 2. 2 电转化及转化效率的计算 取 100 μL感受
态细胞，冰上融化后，迅速加入 1 ng pUC18 质粒，转
入预冷的电击杯(间隙 0. 2 cm)中，一定电场强度电
击后迅速加入 900 μL 37℃ SOC 培养基，37℃，
220 r /min 培养一定时间。以一定倍数稀释后，取
100 μL菌液涂布于 Amp 抗性平板上，37℃恒温培
养过夜，菌落计数后按下式计算转化效率。转化效
率(CFU /μg DNA)=(每皿转化子平均数 × 10 ×菌
悬液稀释倍数)/质粒微克数，每一样本同时转化
3 份。
2 结果与讨论
2. 1 E． coli DH5α菌株的生长曲线
E． coli DH5α在 LB培养基中的生长曲线如图 1
所示，菌体在约 1. 5 h 后进入对数生长期，7 h 后进
入稳定期。
图 1 E． coli DH5α生长曲线
2. 2 E． coli DH5α 菌株在不同生长阶段的电转
化效率
种子液转接培养后，每一个 OD600值时均重复制
备 3 批电转化感受态细胞，不同生长阶段制备的 E．
coli DH5α电转化感受态细胞的转化效率如图 2 所
示。可见，不同生长阶段所制备的电转化感受态细
胞转化效率存在明显差异，在 OD600为 0. 452 时出现
一个转化效率峰值。有研究表明，对于转化率而言
生长不足和生长过度的细菌均只能获得较低的转化
率，尤其是生长过度的细菌转化率更低［5］。OD600为
0. 452 处于对数生长初期，细胞生长旺盛，且细胞壁
结构相对疏松，因此在电击时，更易于孔洞的形成，
便于外源 DNA 的进入，细胞感受能力较强。同时，
由于对数初期细胞代谢活跃，在其电击后利于快速
恢复。随着培养时间延长，单位体积内细胞数目虽
然增加，但细胞感受能力迅速下降，尤其当生长过度
后下降更为明显［5］。
图 2 E． coli DH5α在不同生长
阶段的电转化效率
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
2. 3 不同装液量制备的电转化感受态转化效率
种子液按 1%转接到 LB培养基中，选取 4 个不
同的装液量，即在 2 L 三角瓶中分别装液 200、400、
600 以及 800 mL。试验均重复 3 次，转化效率如表
1 所示。
表 1 不同装液量下制备的 E． coli DH5α电转化效率
装液量(mL) 转化效率(× 109CFU /μg DNA)
200 5. 8
400 10. 3
600 0. 8
800 0. 07
装液量为 400 mL 时，转化效率最高，可达到
1010 CFU /μg。随着装液量的增加，转化效率明显下
降，当装液量为 800 mL时，转化效率不到 400 mL时
的 1%。三角瓶中菌液在振荡器上振荡，促使空气
中的氧有效溶解，因此装液量的多少直接影响溶氧
水平，从而影响细胞生长。随着装液量的增加，体积
溶氧系数降低，溶氧不能满足细胞生长需求，细胞活
性和生长状态受到影响，从而导致制备的感受态细
胞转化效率降低。因此，在 2 L 三角瓶中装液量以
不超过 400 mL为宜。
2. 4 不同电场强度和脉冲时间下的转化效率
使用间隙为 0. 2 cm电击杯，分别研究了电压为
1. 8 kV和 2. 5 kV，即电场强度分别为 9 kV /cm 和
12. 5 kV /cm时的转化效率，试验重复 3 次。如表 2
所示，转化效率在电场强度为 12. 5 kV /cm 时是
9 kV /cm 时的将近 2 倍。
表 2 不同电场强度下的 E． coli DH5α电转化效率
电场强度(kV /cm) 转化效率(× 109 CFU /μg DNA)
9 7
12. 5 13
电场强度对转化效率的影响机制较为复杂，电
转化是利用瞬间高压电击细胞的细胞膜，形成孔洞，
使外源 DNA 分子进入细胞内。Kimoto［6］的研究表
明，电击前，DNA 和细胞是随机分布于电极之间。
电脉冲早期，DNA和细胞被定向并向阳极运动。电
脉冲后期，DNA插入细胞的外膜或者进一步进入细
胞质间隙。随后在 37℃孵育期间，DNA通过内膜渗
透进入细胞浆。在高场强作用下，细胞壁和细胞质
膜被瞬间击穿，形成能通过外源物质的跨膜通道。
而在低场强作用下，并不能瞬间击穿，需要累积达到
一定的电荷强度，才可形成跨膜通道，这样也容易使
细胞内容物外流而引起细胞死亡。对于电脉冲时
间，太短则不能使 DNA 分子有效进入细胞，在一定
范围内脉冲时间延长，进入感受态细胞质粒 DNA越
多，转化效率越高。而电脉冲时间过长，电转化效率
的提高将被抵消，转化效率反而降低［7］。本研究表
明，电击脉冲时间以 5 ms为好，时间偏离 5 ms越多
转化效率越低。
2. 5 转化后复苏时间对电转化效率的影响
在 pUC18 质粒与感受态细胞混合转入电击杯，
电击后加入预热至 37℃的 SOC 培养基，置于 37℃，
220 r /min分别培养 1、1. 5、2 和 2. 5 h。研究转化后
复苏时间对电转化效率的影响，试验均重复 3 次，结
果如表 3 所示。复苏 2 h 转化效率最高，可达到
1. 1 × 1010 CFU /μg DNA。
表 3 转化后不同复苏时间 E． coli DH5α的转化效率
转化后复苏时间(h) 转化效率(× 109 CFU /μg DNA)
1 2. 5
1. 5 4. 5
2 11
2. 5 10
电击作用后应该立即加入复苏培养基以使受损
伤的细胞恢复正常生长，复苏 2 h的转化效率是 1 h
的 4 倍多。经 2 h复苏培养可以使细胞恢复电穿孔
伤害、进行细胞分裂或发生内部重组，进而增加筛选
出单菌落的数量。另外，2 h 的复苏培养对这些基
因在受体菌中的稳定表达是有益的，因此在复苏培
养基中不要添加任何抗生素，否则会大大影响转化
子的生长。而复苏时间为 2. 5 h 的转化效率与 2 h
相当，因此选择 2 h为较优的复苏时间。
2. 6 感受态细胞存放时间对电转化效率的影响
感受态细胞制备后通常并不立即用于转化，试
验比较了感受态细胞存放时间对电转化效率的影
响，每个不同存放时间均重复 3 次，结果如图 3
所示。
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2011 年第 10 期 朱森康等:制备高效大肠杆菌电转化感受态细胞和电转化条件的研究
图 3 感受态细胞存放时间对转化效率的影响
从结果可见，制备的感受态细胞立即使用时转
化效率并非最高，－ 85℃存放 3 d 后，转化效率是刚
制备的近 2 倍。有研究认为［8］，相对于转化的限制
因子，感受态形成因子更加耐受低温，而在低温下限
制因子迅速失活，将导致转化效率提高［9］。从第 3
天开始，转化效率则开始下降，在保存 30 d 后，转化
效率已下降至与刚制备时相差无几，随着保存时间
继续延长，细胞会衰老或凋亡，影响细胞活性与自主
修复过程，导致转化效率持续下降。
3 结论
大肠杆菌的生长包括 4 个阶段:停滞期、对数生
长期、稳定期以及衰亡期。从生长曲线和不同生长阶
段研究可知，大肠杆菌在约 1. 5 h 后进入生长对数
期，并在 OD600为 0. 452时，即对数生长初期时获得最
高转化效率。另外，研究结果表明，装液量为
400 mL /2 L、电场强度为 12. 5 kV/cm时、转化后复苏
培养 2 h，转化效率最高。对于细胞存放时间，保存前
期，效率有所增加，保存 3 d后，效率则持续下降。
本研究对高转化效率 E． coli DH5α 电转化感受
态细胞的制备及电转化条件进行了探索。结果表
明，不同装液量、菌体生长阶段和转化电场强度，转
化后复苏时间以及感受态细胞存放时间对转化效率
均有明显影响。在优化条件下，所制备的感受态细
胞转化效率高达 1010 CFU /μg，为相关的基因工程实
验打下了良好的基础。
参 考 文 献
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(责任编辑 狄艳红)
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