全 文 ：2008年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论·
收稿日期:2007-11-12
基金项目:湖南省科技厅重点资助项目(编号:01NKY1002)
作者简介:周海燕(1974-),女,博士生,研究方向:蛋白质工程;E-mail:petrelshirley@163.com
通讯作者:吴永尧,E-mail:yywu357@sohu.com
甘露聚糖酶是一类具有半纤维素酶活性或兼
具纤维素酶活性的广谱诱导酶,能够水解如甘露聚
糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及半乳葡萄甘露
聚糖等高聚糖分子。这类酶在动植物,尤其是不少
细菌和真菌体内均有发现[1～3]。
甘露聚糖酶被广泛应用在医药、食品加工业、
造纸、纺织印染、饲料工业及石油开采等方面。饲料
中添加甘露聚糖酶可以催化饲料原料中甘露聚糖
的水解,避免抗营养因子的形成 [4,5];甘露聚糖酶可
以与其它酶制剂复配,增强洗涤效果;与木聚糖酶
等协同作用,提高纸浆的漂白度、打浆性与抗撕裂
性;另外,甘露聚糖酶还可用作油井压裂液的优质
生物破乳剂,效率高,对地层伤害小;富含甘露糖残
基的多糖化合物被甘露聚糖酶降解成寡糖,这种寡
糖具有促进肠道益生细菌的生长[6],消除自由基、
增强机体抗氧化性的能力[7],降血脂[8],减轻肝脏对
血氨的解毒负担[9]等多种生理功能。
1 甘露聚糖酶的来源
甘露聚糖酶普遍存在于植物、动物和微生物组
织中,已发现的甘露聚糖酶植物源有Cofeaarabica[10]
(咖啡树),Daucuscarota[11](胡萝卜),Lactucasativa[12]
(莴苣),Lycopersiconesculentum[13](番茄),Amorphap
halusKonjacC.Koch(魔芋)等。动物源种类较少,而
且大多数属于软体动物,如 Haliotisdiscushannai[14]
(皱 纹 盘 鲍 ),Litorinabrevicula[15](滨螺),Mytilus
edulis[16](紫贻贝)等。
甘露糖酶的微生物源种类最为丰富,初步统计
已发现的可产生具有水解甘露聚糖活性酶的微生
物将近 100种,其中芽孢杆菌属微生物是研究最多
的产甘露聚糖酶的类群,如 Bacilussubtilis,Bacilus
circulans等。原核微生物来源除了表 1所列种类之
外还有 Bacilusstearothermophilus[17],Bacteroidesthet
aiotaomicron,Caldibaciluscelulovorans[18],Caulobacter
crescentus,Clostridiumacetobutylicum[19],Clostridium
thermocelum[20],Frankiasp.,Moorelathermoacetica,
Prevotelabryanti,Rhodobactersphaeroides,Roseovari
usnubinhibens,Streptomyceslividans[21],Thermomonos
poraFusca[22]等,而真核微生物还包括 Candidaalbica
甘露聚糖酶的多样性分析
周海燕 赵文魁 吴永尧
(湖南农业大学生化与发酵工程实验室,长沙 410128)
摘 要: 不同来源的甘露聚糖酶在组成、结构形式、理化性质以及催化功能等方面表现出丰富的多样性,其原因主
要在于底物多样性的选择、编码基因的差异、翻译后加工修饰的差异以及酶作用微环境的影响,对此进行了综述。
关键词: 甘露聚糖酶 多样性
ReviewAbouttheDiversityofMannanase
ZhouHaiyan ZhaoWenkuiWuYongyao
(HunanAgriculturalUniversity,BiochemistryandFermentationEngineeringLab.,Changsha410128)
Abstract: Mannanasesobtainedfrom difrentsourcesexhibitgreatdiversityincomposition,structure,chemical
andphysicalproperties,andcatalyticfuction.Thediversityismainlybasedondiferentiationofsubstratesand genome,
andalsogenemutation,modificationaftertranslation,andalterationofenzymemicroenvironment.
Keywords: Mannanase Diversity
2008年第2期
ns,Piromycessp.[23],TrichodermaReesei[24]等。
2 甘露聚糖酶的多样性表现
2.1甘露聚糖酶种类的多样性
通常认为甘露聚糖酶由二类酶组成,1为内切
甘露聚糖酶(endo-mannanase),这类酶作用于高聚
糖分子内部的非结晶区,随机水解甘露糖苷键,截
短长链分子,产生大量带非还原性末端的小段糖链。
2为外切甘露聚糖酶(exo-mannanase),这类酶作用于
高聚糖线性分子末端,水解产物为一个二糖分子。如
果彻底降解还需要一种甘露糖苷酶(mannosidase),
它将二糖水解成单糖。
甘露糖苷酶普遍存在于各种生物体内,尤其是
高等动植物体内都含有不同类型的甘露糖苷酶,但
是大多数高等生物体内不产生甘露聚糖酶,这也是
为什么高等动物无法消化饲料中大量甘露聚糖的
原因,而甘露聚糖酶则主要由微生物产生,有些微
生物能够同时产生内切和外切甘露聚糖酶,但不产
生甘露糖苷酶,两种酶相互协同将含甘露糖残基的
高聚糖分子水解成寡糖。
2.2 甘露聚糖酶结构的多样性
已知结构的甘露聚糖酶通常是单链蛋白,有的
还带有同一种生物体内经常产生多种不同类型的
甘露聚糖酶,如 Bacilussubtilis、Baciluscirculans
等,这表明对甘露聚糖酶的基因改造工作具有很大
空间。对于外泌型甘露聚糖酶的分子改造来说使用
Bacilussubtilis作为表达载体更加适合,因为在大
肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸
化等翻译后加工,常形成包涵体而影响表达蛋白的
生物学活性及构象[25]。
根据氨基酸序列的相似性、疏水基团及空间结
构等信息,甘露聚糖酶被分别归类到 Glycosyl
hydrolase中的 3个不同的家族——family5、family
26和 family76,尽管已知的 family5和 family26在
亲核基团、供体质子及折叠方式上均雷同,但是序
列同源性不高。甘露聚糖酶氨基酸序列的保守性在
不同类生物个体及不同族酶蛋白之间有较大差别。
表 1 甘露聚糖酶三个家族的序列对比
周海燕等:甘露聚糖酶的多样性分析 61
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
从目前的研究来看,对甘露聚糖酶活性中心氨
基酸序列的报道也并不多。吴襟[41]等利用各种化学
修饰剂对诺卡氏菌形放线菌 β-D-甘露聚糖酶的结
构与功能进行了初步研究,证明了巯基、酪氨酸残
基和色氨酸残基是维持酶活性的必需基团。
余红英[42]等对枯草芽孢杆菌 β-甘露聚糖酶进
行了化学修饰,发现除了巯基和色氨酸残基可能位
于 β-甘露聚糖酶的活性中心外,还可能包括羧基
(Asp/Glu)和丝氨酸残基,组氨酸残基对维持酶的
活性虽然有重要作用,但不位于酶的活性中心。
2.3 甘露聚糖酶性质的多样性
甘露聚糖酶在理化性质上具有较大的差异,目
前研究表明甘露聚糖酶可以由 1至多个不同蛋白
组成,且各个组分的性质也不尽相同,甘露聚糖酶
性质的多样性与产酶生物个体的生存方式、生活环
境等有着密切的关系。
2.3.1 酶的分子量 甘露聚糖酶蛋白的分子量分
布较广,从几千道尔顿到十几万道尔顿,最短的酶
蛋白链只有 31个氨基酸,最长的酶蛋白链可包含
1300多个氨基酸残基。
细菌是产生甘露聚糖酶最大的群体,其中研究
最为详细的当数芽孢杆菌,由细菌产生的甘露聚糖
酶分子量大部分分布在 20kDa～130kDa之间[18~34,43]。
真菌是第二大类产甘露聚糖酶的群体,从已报
道的资料来看,真菌所产的甘露聚糖酶分子量相对
较集中,一般在 25kDa～70kDa之间。
植物中间较少几种产甘露聚糖酶,动物种类就
更加稀少,由这类高等生物产生的酶蛋白分子量非
常相近,在 45kDa～55kDa之间。
2.3.2 等电点 培养条件、酶离体后微环境的改变
都可以引起酶蛋白等电点的变化。
绝大多数的甘露聚糖酶等电点在 2.5～6.5之间,细
菌中一般为 4.0～5.5,真菌中为 3.5～5.0。
2.3.3 最适作用 pH 细菌来源的甘露聚糖酶最
适反应 pH多为 5.5～7.0[18,30,36,44],真菌来源的多为
4.5～5.5,植物的甘露聚糖酶则略显酸性,而且在植
物的不同生长发育时期产生的甘露聚糖酶性质和
量都有差异[45,46],主要是为了适应不同生长期植物
的生理需求。
近几年来随着造纸和洗涤剂工业的发展,人们
还从嗜碱性的 Bacilus属中某些种筛选到碱性甘露
聚糖酶[47,48],可以产生在碱性条件下保持较高活性
的甘露聚糖酶。
2.3.4 最适作用温度 细菌中的甘露聚糖酶一般
都有较好的耐热性,最佳反应温度 50～70℃,真菌
产生的酶最适反应温度为 55～75℃,但耐热性较芽
孢杆菌的要差。植物源的甘露聚糖酶最适温度则接
近常温,耐热性比细菌和真菌源的都要差。
随着极端微生物科学的发展,Hilge,M.等[41]在
80℃下培养一种嗜热型放线菌 Thermomonospora
fusca,并从中得到一种热稳定极强的甘露聚糖酶。
Politz等[30]还报道了来自海洋细菌 Rhodothermus
marinusATCC43812的高度热稳定性 β-甘露聚糖
酶,并将其基因进行了克隆,转化到大肠杆菌中表
达,重组酶在 70℃和 90℃保持 1h后酶活力仍为起
始酶活的 70%和 25%。
耐热甘露聚糖酶的发现提高了其在工业中的
应用价值。
2.3.5 酶催化功能的多样性 甘露聚糖酶虽然分
属于两个不同的家族,glycosylhydrolasefamily5和
glycosylhydrolasefamily26,但是在催化过程中的亲
核基团和质子供体均为 Glu。酶基因也大多只有一
个开放阅读框(ORF),但某些种的芽孢杆菌的甘露
聚糖酶基因 ORF可以编码一种以上的酶蛋白,这
种现象主要是在转录、翻译和蛋白质加工过程中发
生的多方向变化导致的。
有些微生物,如 Pseudomonasfluorescens,产生
的多功能酶不仅具有甘露聚糖酶活性,其酶蛋白还
带有纤维素结合域(CBD),除水解含甘露糖残基的
多糖以外,还可以水解其他类型的多糖。
3 甘露聚糖酶多样性的分析
3.1 甘露聚糖结构的多样性是酶多样性的动力
甘露糖残基除了相互之间形成的高聚分子之
外,可以与其他糖类物质,如葡萄糖、半乳糖等形成
杂多糖,还可以与非糖物质结合,如蛋白质、核酸
等。此外,糖残基的构型可以是 α型,也可以是 β
型。成键时连接形式以 1,4键较为常见,另外还有
1,3键、1,6键等形式。同时高聚糖分子都有复杂的
超分子结构,分子链之间通过次级建的作用形成结
构严密的大分子化合物网状结构(图 3)。
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图 1 魔芋葡甘聚糖结构图
魔芋葡甘露聚糖是一种高分子多糖,由分子比 1:1.6的葡萄糖
和甘露糖残基通过 β-1,4糖苷键聚合而成,在某些糖残基 C-3
位上存在由 β-1,3糖苷键组成的支链,主链上每 3280个糖残
基有 1个支链,每条支链有几个至几十个糖残基,大约每 19个
糖残基上有一个以酯键结合的乙酰基
一般来说,酶的催化反应有高度的专一性,有
的酶只作用于一种底物,有的酶作用于具有同种空
间结构的底物,含有甘露糖残基的高聚糖分子所具
有的多样性和复杂性使甘露聚糖酶在进化过程中
渐渐产生了水解各种底物的不同种甘露聚糖酶蛋
白,在种类、结构、性质以及酶作用机理方面表现出
多样性。
3.2 编码基因的差异及突变是多样性的根本原因
glycosylhydrolasefamily5和 glycosylhydrolase
family26两个家族的酶基因序列同源性低于20%,而
惟一一种 glycosylhydrolasefamily76家族的 α-1,6-
mannanase则几乎与前两者无同源性。
自然界中随时可能在生物个体内发生的基因
突变是酶蛋白多样性的内在表现,能够适应个体生
存环境的突变类型被保留下来,基因上的改变也就
体现为表达产物的多样性。
3.3 翻译后的修饰与加工是甘露聚糖酶多样性
的直接原因
对于大多数蛋白质来说多肽链翻译后还要进
行各种加工修饰[49],如氨基端和羧基端的修饰、糖
基化、水解断链等过程。
更多的时候酶分子与某些效应物结合,改变酶
分子的聚合状态或空间结构,对酶的性质、活性进
行调节。另外,蛋白质分子之间的相互作用也是影
响酶活的重要因素。
3.4 蛋白质微环境的改变导致酶表型的多样性
离体酶在发生催化作用的时候,会因为作用环
境的变化而表现酶的不同性质。例如反应体系中的
中间产物、终产物、离子类型和浓度的变化等,都可
能改变酶的构象和活性。
天然多糖有着复杂的分子结构,这就决定了其
降解过程不可能由一种酶单独完成。各种生物体内
所含多糖含量差异很大,对于绝大多数生物来说,
所产生的酶活性和量能够满足自身的生存、生长和
繁殖即可,因此不同生物体,甚至来自不同生长环
境的同种生物所产生的甘露聚糖酶在组成、性质、
产量和活力上都会有很大的差别,甘露聚糖酶的这
种多样性表现为人工筛选满足要求的甘露聚糖酶
物种来源提供了可能。
甘露聚糖酶多样性是在长期进化过程中对天
然含甘露糖残基的高聚糖结构复杂性的适应所致。
对甘露聚糖酶多样性的本质及规律的深入了解将
会为酶分子的改造提供很好的思路。
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素对固体发酵产酶的影响,这些方面取得一些进
展,但有待于进一步深入。
4 固体发酵产酶存在的问题及解决方法
尽管固体发酵产酶具有巨大的潜力和优势,但
是大规模地采用固体培养发酵产酶还没有达到液
体发酵产酶的程度,只有少数几种酶投入了工业生
产,大部份固体发酵产酶还停留在实验室阶段。目
前固体发酵产酶存在的问题主要有:①酶对温度比
较敏感,过低影响酶活,过高容易失活,而传热自然
是固体发酵比较难解决的问题;②与液体发酵相
比,固体发酵产生的副酶活比液体发酵更丰富,为
分离带来一些麻烦;③目前对于同一种酶,不同的
研究采用的分析方法各异,没有统一的标准,缺乏
可比性;④微生物种间,同一种的不同菌株之间存
在差异,相同的培养条件下产酶的种类和不同酶的
比例有所不同,增加了固体发酵产酶研究的复杂
性;⑤固体发酵基质不均匀,发酵参数较难控制。
针对上述问题,今后在酶的固体发酵生产中需
要重点研究以下几个方面:①研究耐高温的酶,扩
大酶的来源;②深入研究酶的分离纯化技术,提高
酶的质量;③为同一种酶的分析确定统一的标准;
④选育产酶的最佳菌种,优化培养条件,加强菌株
生理生化研究,使得菌株研究方面有丰富的参考数
据;⑤深入研究固体发酵生产的生物反应器,较好
的解决固体发酵参数控制问题,使固体发酵自动
化,减少人工操作强度。
5 结语
固体发酵的最大优势就是能有效利用有机废
物,减少环境污染,变废为宝、化害为利、经济有效,
微生物酶应用范围广泛,但目前酶制剂还主要是使
用液体发酵生产,产业化飞速发展的时代,固体发
酵产酶的巨大潜力吸引着越来越多研究者深入探
讨和开发研究经济友好型和环境友好型酶,然而固
体发酵产酶的应用和推广任重而道远,我们还要解
决许多固体发酵的技术难题,进一步拓展对固体发
酵产酶的研究。
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孙巍等:酶的固体发酵生产研究进展 67