全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 8期
端粒和端粒酶的发现及应用
杨品红 1, 2 王志陶 1, 3 王志勇4
( 1湖南文理学院生命科学学院,常德 415000; 2湖南省水产工程技术研究中心,常德 415000;
3中国科学院水生生物研究所,武汉 430072; 4朗晴货运有限公司,深圳 518000 )
摘 要: 2009年诺贝尔医学或生理学奖被授予 E lizabe th H B lackburn, JackW Szostak和 Caro lW Greider 3位博士, 以表
彰他们发现了具保守功能的端粒重复序列末端是如何预防染色体的降解与重组, 以及鉴定了负责合成端粒 DNA的新的酶复
合物 端粒酶。端粒酶和端粒结构维持的研究为我们洞悉诸如癌症、衰老以及遗传疾病综合症等医学高度相关领域提供
了新方略, 并促进了目前正处于临床检测的基于以端粒酶活性及表达为目标的癌症治疗新策略的发展。综述了端粒和端粒
酶发现的背景、过程及其作用。
关键词: 端粒 端粒酶 癌症 衰老 遗传疾病综合症 2009年诺贝尔生理学或医学
D iscovery and Application of Telomeres and Telomerase
Yang P inhong1, 2 W ang Zhitao1, 3 W ang Zhiyong4
(
1
College of L ife Science, H unan University of A rts and Science, Changde 415000;
2
Hunan ProvinceM arine
Products Engineering T echniqueR esearch Center, Changde 415000; 3 Institute of H ydrobiology,
Chinese A cademy of Sciences, Wuhan 430072;
4
Langqing Angie Exp ress Co., L td., Shenzhen 518000)
Abstrac:t The 2009 Nobe l P rize in Phy sio logy orM ed ic inew as aw arded toD rs. E lizabeth H B lackburn, JackW Szostak and Ca r
o lW Greider for their discovery o f how the conserved function o f chromosom a l te lom ere repeat sequences protects aga inst deg rada tion
and recom bina tion events and have identified a new enzym e com plex, telom erase, that is responsib le fo r the synthes is o f te lom ereDNA.
Stud ies of telom erase and te lom erem aintenance have prov ided very im po rtant insights into a reas of high m edical relevance such as canc
e r, ag eing and hered ita ry d isease syndrom es. The d iscover ies have also led to the deve lopm en t o f new therapeutic stra teg ies for cancer
treatment based on the targeting of te lom erase activ ity or expression that are now undergo ing c linical testing. In this pape r The back
g round and process, as we ll as the function of the found ing of telom eres and enzym e telom erase w ere summ ar ized.
Key words: Te lomere Te lomerase Cancer Age ing Hered itary disease syndrom es Nobel pr ize in physio logy orm edicine in 2009
收稿日期: 20100329
作者简介:杨品红,男,博士,教授,研究方向:水生生物学及其应用研究; Em ai:l ypk ing@ 263. net
由于揭示了染色体是如何通过端粒和端粒酶而
得到保护的机理, 2009年诺贝尔生理学或医学奖授
予伊丽莎白 布莱克本 ( E lizabethH B lackburn) ,杰
克 绍斯塔克 ( Jack W Szostak)和卡萝尔 格雷德
( C aro lW Greider) 3位博士。他们解决了染色体末
端是如何在持续的细胞分裂过程中避免遭受侵蚀或
重组而得以幸存并维持自身结构稳定这一长期困惑
生物学家的基本问题。通过创造性的基因试验,证
实染色体末端具有经进化保留的结构与功能。随
后,精细的生化研究揭示了负责染色体 DNA末端合
成的端粒酶这一早就预测到的对其内在 RNA模板
具有依赖性的酶的存在。端粒酶的缺失将导致端粒
重复结构在连续的细胞分裂中逐渐缩短,生命力受
到抑制,并在复制衰老过程中以细胞死亡终结。人
体中,编码端粒酶复合物的基因编码元件发生的突
变将导致以癌变、干细胞再生和组织维持缺陷为特
征的遗传疾病发生。许多能够无限增值的癌细胞能
通过提高端粒酶活性来维持端粒结构稳定。端粒酶
的发现深刻地影响着生物医药的研究并促进了目前
处于评估阶段的癌症治疗的发展。
1 背景介绍
20世纪初, 染色体被认为是遗传信息的载体
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
( ThomasH M organ; 获 1933年诺贝尔生理学或医学
奖 )。分别获得 1946年和 1983年诺贝尔生理学或
医学奖的 Mu ller和 M cC lintock[ 1, 2]都发现受损的染
色体不稳定并趋于重组和融合,而染色体末端结构
却能防止上述反应发生, 染色体末端所具有的特殊
性质受到关注并被 Mu ller命名为端粒 ( telomeres)
[来自希腊词 telos(末端 )和 meros(部分 ) ], 但在当
时有关端粒的分子结构还不了解。
另一有趣的问题自显于 DNA 结构的揭示
( F rancis C rick, W atson和 M aurice W ilk ins, 获 1962
年诺贝尔生理学或医学奖 ) [ 3]及 DNA聚合酶的发
现 ( A rthurKornberg,获 1959年诺贝尔生理学或医学
奖 ) [ 4]。由于 DNA聚合酶起始复制时对事先形成
的引物具有依赖性, 这一事实与真核生物染色体线
性 DNA末端的完全合成的实现相矛盾。W atson和
O lovn ikov
[ 5, 6 ]分别意识到了该问题并指出新合成的
DNA分子将留有一条单链尾巴, 此外人们认为这种
不完全的复制将导致染色体随着时间的推移而逐渐
缩短, 最终致使生命力下降。O lovn ikov还指出在组
织培养过程中观测到的人类体细胞有限的复制力可
能与染色体的逐渐缩短相联系 [ 6, 7]。滞后链线性
DNA分子利用对随后被降解的 RNA引物具依赖性
的 DNA聚合酶采取逐步的形式进行复制, 随后缺口
经填补和连接形成一完整的 DNA分子, 在最末端
DNA聚合酶不能填补缺口从而使末端经由每次复
制而逐渐变短,此 !末端复制问题∀ (图 1)必定有一
种恰当的解决方式, 从而保证每次细胞分裂中染色
体复制的忠实性。正如我们所知道的, 这也是真核
生物正常生命活动的特殊需求。在大多数原核生物
和病毒中组成基因组的 DNA是环状的,因此回避了
这一困难。
2 为发现奠定基础
在 20世纪 70年代早期, 人们已经注意到接近
或存在于真核生物染色体线性末端的 DNA重复序
列 [ 8, 9] ,但直到 1978年才获得该末端序列的详细信
息。1975年伊丽莎白 布莱克本在剑桥 Frederick
Sanger(获 1958和 1980年诺贝尔化学奖 )的实验室
学习并掌握了 DNA测序的早期方法, 获得博士学位
后她来到了耶鲁 Joseph Gall的实验室,当时 G all对
核糖体 RNA编码基因 ( rDNA )感兴趣, 并已揭示在
图 1 末端复制问题 Nobe lP rize
特定机体中外源 rDNA获得了大量扩增。通过物种
专一的以嗜热四膜虫这一单细胞纤毛虫为模式生
物, 他发现那些扩增的 rDNA是以线性 DNA的形式
存在 [ 10]。布莱克本试图对 rDNA分子的末端进行
测序以期提供与扩增和复制机制相关的信息, 结果
发现各 rDNA分子末端都包含重复数在 20到 70不
等的六核苷酸 ( CCCCAA )串联重复结构 [ 11]。
20世纪 70年代晚期杰克 绍斯塔克在哈佛医
学院建立了属于自己的实验室并致力于酵母同源重
组内在机制的研究,此前他已发现导入酵母细胞中
的线性质粒 DNA分子具有能促进重组, 能与同源染
色体 DNA反应及整合并使之不能长期维持原状的
高重组性 [ 12]。这些发现与上文提到的 Muller和
M cC lintock提出的破损的染色体高度不稳定的早期
发现相一致。这与他实验室的另一感兴趣点, 即能
否构建能稳定和忠实的复制的人工酵母染色体
相关。
3 端粒和端粒酶的发现
31 端粒 DNA稳定染色体结构是经进化保存
1980年伊丽莎白 布莱克本和杰克 绍斯塔
克共同参加了戈登会议并决定合作研究能否通过将
四膜虫染色体 DNA末端重复序列添加到线性酵母
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2010年第 8期 杨品红等:端粒和端粒酶的发现及应用
质粒以稳定酵母末端,使之得以复制的课题,这使得
端粒的研究迈出了至关重要的一步。四膜虫 rDNA
中长 15 kb的片段被连接到含有酵母来源复制起
点的线性化质粒的两端, 连接后的分子用于转化跨
越了真核生物界界限的酵母细胞 (图 2)。
图 2 附有四膜虫线性 DNA分子末端序列的
人工微染色体在酵母中长期稳定保存 N obe lP r ize
这一试验得到了顺利运行, 绝大多数转化产物
保留了线性的杂合质粒形式。通过用酵母 DNA替
换从四膜虫中获得的一个末端,经筛选后的产物也
能克隆酵母中在功能上互补于四膜虫 rDNA末端的
序列。酵母末端不仅与四膜虫相应的末端部位相
似,并且它在酵母基因组中和在所有染色体中有相
同的拷贝数。染色体末端的结构和功能在远缘物种
间具有惊人的保守性。布莱克本和绍斯塔克将该研
究结果发表在 1982年的 #细胞∃杂志上 [ 13]。
四膜虫 rDNA末端片段的这种经进化保留的功
能特征确保了染色体结构的稳定这一关键性的结论
在这些试验中初显,加之酵母中存在功能类似序列,
促生了如下推论:这些末端序列扮演了端粒的功能。
同时, 存在于 rDNA 分子中六核苷酸序列
( CCCCAA )也存在于嗜热四膜虫基因组内的许多位
点 (这与它的普遍功能相一致 )。此外,在其它 3种
四膜虫 [ 14] 及 Physarium 和 D icy tostelium 两种霉
菌 [ 15, 16 ]的 rDNA分子末端也发现了类似的重复序
列。伯克利、加利福尼亚大学布莱克本的实验室和
其它科研机构发现线性 rDNA以及其它的长度不同
的 DNA分子的末端能够得到延伸 [ 17, 18]。
在随后的研究中, 布莱克本和绍斯塔克的实验
室鉴定出了酵母端粒串联重复序列为 C13A,并显示
四膜虫和酵母的端粒序列都能在稳定地存在于酵母
中的基础上得到延伸 [ 19]。令人注目的是, 在序列上
与四膜虫相应部位存在明显差异的酵母端粒重复结
构也能加在四膜虫来源质粒的末端。
不同的模型被用来诠释端粒的完全复制机制,
其中包括重组及转座的事件, 回文结构或发夹结构
的出现, 抑或是存在重新合成端粒 DNA所需, 但区
别于任何已知酶的特异酶活性的存在的研究。
32 四膜虫染色体 DNA末端的重新合成
此时,卡萝尔 格雷德在伯克利布莱克本的实
验室读研,她们开始一起致力于采用生化方法探索
端粒末端是如何合成的, 她利用了四膜虫 rDNA分
子中反应所需的自由 3%OH 存在于与含 CCCCAA
重复序列的核苷酸链互补的富含鸟嘌呤 ( G ) DNA
链这一优势,以四膜虫细胞提取物设计试验。合成
的 DNA寡核苷酸链 ( TTGGGG ) 4被作为引物用于起
始合成,试验证实在体外重新生成了 TTGGGG重复
结构,这表明在她获得的细胞提取物中存在酶活性。
这种蛋白质类型的具有以逐步形式添加单核苷酸的
类末端转移酶酶活性仅添加特异的引物指导下的相
应端粒序列,该酶作用过程的保守性在四膜虫物种
的 TTGGGG六核苷酸重复序列添加到了以特异的
GTGGG结尾的酵母端粒 DNA末端相应的引物中这
一关键性试验中得以证实, 试验发现一额外的鸟嘌
呤 ( G )首先加入到含有 3个 G残基的酵母引物末
端,使含有 4个 G残基的四膜虫 TTGGGG重复序列
得以在随后反应过程中正确的添入。把合成的
( TTGGGG ) 4、酵母端粒寡聚物、( CCCCAA ) 4和
pBR322序列寡聚物作为引物添入四膜虫细胞提取
物中 (图 3)。此外,反应体系中还掺入了放射性标
记的 dGTP和未被标记的 dTTP, 试验结果中带放射
性标记的梯带数与 DNA分子中填加的 TTGGGG重
复在数量上是一致的 (图 3)。格雷德和布莱克本在
1985年的 #细胞∃杂志发表了该项结果 [ 20]。
在随后的研究中格雷德和布莱克本证实该酶是
对其自身蛋白质和 RNA成分具紧密依赖性的核糖
核蛋白复合物 [ 21 ]。在随后的第二篇文章端粒酶这
一称法开始被采用。基于对其中的 RNA成分潜在
功能的重视, 她们写道 ! RNA成分可能参与了决定
合成的端粒重复序列和 /或对特异引物的识别的相
47
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
泳道 58中引物分别为 ( TTGGGG ) 4、酵母端粒寡聚物、( CCCCAA) 4和 pBR322序列寡聚物
泳道 14分别代表上述 4种寡聚引物的分子大小,泳道 9中无引物
图 3 延伸反应的引物特异性 N obe lP r ize
关推断是诱人的,如果端粒酶 RNA中含有 CCCCAA
序列的话,该序列能起内源引物的作用∀。
作为 Co ld Spring Harbor实验室一名独立的科
学家格雷德继续与布莱克本合作研究端粒酶, 并致
力于克隆及描述与端粒酶一同获得纯化的小 RNA
的特征。正如她们在 1989年 #自然 ∃杂志发表的文
章中报道的那样, RNA成分中确实发现含有被认为
合成 TTGGGG重复结构的模板的 CAACCCCAA序
列 [ 22] ,该模序的高利用率与端粒酶的酶活性相一
致。而最终证明 RNA序列 ( CAACCCCAA )为端粒
合成的模板的是布莱克本研究组,她们发现 RNA序
列突变导致合成的 DNA序列发生相应的替换 [ 23]。
此时, 作为一种特殊种类的带有催化蛋白成分
和内源 RNA模板、具逆转录酶性质的端粒酶, 其主
要特征已阐明,端粒合成及结构维持的基本机制建
立起来 (图 4), 该机制解释了中止在 TTGGGG序列
中的任何位置的 3%末端是如何正确延伸而产生
( TTGGGG ) n串联重复。
包括哺乳和灵长类动物在内的真核生物维持染
色体结构稳定的普遍原理的发现都来源于对相对简
单的模式生物的研究,这些发现意义重大。
33 进一步发展
同样致力于鉴定端粒酶的绍斯塔克的实验室开
始着手用遗传学的方法研究酵母并分离到了一命名
为不断缩短的端粒的突变体 ( EST1), 该突变体表现
出端粒序列逐渐丢失, 并伴随有染色体缺失频率的
提高及表型衰老的延迟的特点 [ 24] ,该发现表明端粒
结构的维持在保持基因组结构稳定及维持细胞活力
中具有重要作用。基于对细胞分裂的考虑, 文中谈
到:可能在某一给定的细胞系, 体细胞端粒 DNA在
每次分裂时的丢失决定了该细胞的分裂次数。布莱
克本的实验室在研究四膜虫端粒 RNA突变体时也
( 1)四膜虫端粒酶含有一长 13碱基悬突的 TTGGGG链,
端粒酶在识别 TTGGGG链后, 3%最末端核苷酸与 RNA
中的 CAACCCCAA序列杂交; ( 2) TTG以单核苷酸的形
式逐一填入; ( 3) 3%末端 TTGGGG链的移位和调整,使 3%
最末端 TGG核苷酸与端粒酶的 RNA ( CAACCCCAA )系
列杂交; ( 4 )延伸再次发生, 拷贝模板序列合成 TT
GGGTTGG
图 4 端粒通过端粒酶得到延伸的模型 Nobe lP r ize
发现一具有衰老及细胞核缺陷表型的突变体, 这进
一步支持了端粒结构的保持对稳定基因组结构及保
持细胞活力有重要作用的观点 [ 23]。
如今,我们知道更多的有关端粒结构和功能、端
粒酶多蛋白复合体、转录端粒 RNA 的调控作
用 [ 25, 26]以及端粒再生调节 [ 27]的知识。令人瞩目的
是与酵母 EST1突变体相对应的正常基因具有编码
功能,所编码的蛋白质是端粒酶复合物的一结构成
分,并具有调节功能 [ 28]。端粒酶组成成分的一些不
规则功能开始得到揭示, 其中端粒酶逆转录酶
( TERT)的催化亚基和线粒体 RNA处理的内源核糖
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2010年第 8期 杨品红等:端粒和端粒酶的发现及应用
体核酸酶 ( RMRP)的 RNA成分之间的相互作用就
是最新发现的一实例, 该核糖核蛋白复合物出乎意
料地含有在合成双链 RNA分子中涉及的 RNA依赖
的 RNA酶活性 [ 29]。我们期待不断地有新研究成果
的涌现。
4 端粒和端粒酶的重要应用
这些发现在包括癌症、衰老、干细胞维持及遗传
病综合症的许多领域中具有重要的医学应用价值。
4. 1 癌症
人们很快发现端粒在许多癌细胞系中是不正常
的 [ 30, 31 ] ,端粒酶活性也提高了 80% - 90% [ 32, 33 ] ,无
端粒酶活性的肿瘤细胞常显示有替代的端粒延伸
(ALT)机制的作用 [ 34 ] ,这与癌细胞具有无限复制能
力相一致。上述发现与所观察到的太短或未被保护
的端粒将诱发衰老并最终导致细胞死亡这一现在被
认为对阻止细胞无限增殖及癌变起重要保护作用的
机制统一起来。缩短的和未被保护的端粒诱发基因
组的失稳定及随后的细胞复制受阻和细胞死亡。有
时基因的改变回避了上述反应而代之以细胞的转化
及癌变 (图 5)。
图 5 缩短的和未被保护的端粒的作用 Nob el Pr ize
以上发现促生了各种基于端粒酶的治疗策略,
而它们要么以阻遏端粒酶活性,要么采用癌症疫苗
方法消灭端粒酶而抑制肿瘤细胞的过度增殖。当前
与多种类型癌症相关的临床试验方兴未艾, 而其中
大多数是基于端粒酶的癌症免疫疗法 ( clinica ltri
als. gov)。不过,结论性的结论尚未取得。
然而潜在的难题仍然不少, 未被保护的端粒诱
导的衰老及细胞程序性死亡的作用过程表现为对
p53依赖性,而许多肿瘤中为什么会存在未活化的
p53突变体就是其中的难题之一 [ 35]。另一令人困
惑的事实来自于小鼠模型中观测到的端粒酶的消失
能诱发肿瘤,短端粒可能在某些情况下增强基因组
的不稳定性并加速肿瘤发生。这与在有癌症倾向的
以端粒酶功能缺陷为特征的家庭疾病综合症中观测
到的现象相一致 [ 36]。格雷德的研究组最近报道了
在小鼠中端粒的缩短诱发了非转录的原始细胞和肿
瘤细胞中的端粒重组以及其它的端粒维持机制 [ 37] ,
这表明利用药物阻遏端粒酶的疗法可能存在问题。
有报道称正常成体干细胞含有较长的端粒并具有端
粒酶活性是当前另一值得关注的潜在事实 [ 38]。这
也重申了抗端粒酶疗法具有引发副作用的风险。
最近,基因组范围相关研究显示 TRET是诱发
包括肺癌及 glioma在内各种类型癌症的敏感基
因 [ 3941] ,此外能降低端粒酶活性的 TERT基因变异
类型是导致急性 mye loid白血病的风险因子 [ 42]。
总之, 有关抗端粒酶疗法背后的基本原理以及
这种疗法是否能有效地抵制人类癌变的认知过程仍
然任重道远。
无论上文述及的有关肿瘤细胞中端粒维持的作
用的研究有多复杂,该研究已被证实对我们理解癌
变的生物学原理有意义重大。
4. 2 衰老
早期的试验证实端粒的缩短与培养中的人类细
胞复制力的减弱之间具有惊人的联系 [ 43] , 这与在模
式体系中获得的短端粒诱发衰老的早期遗传证据相
一致 [ 23, 24 ]。相反,将端粒酶引入培养中的正常人体
细胞则能使其生命力得到延长, 并明显没有引起其
它的细胞变化 [ 44 ]。然而其它的研究表明上皮细胞
通过突变失活或促进甲基化来降低 p16 /INK 4a的
表达的次生反应在获得永久表型的过程中扮演了重
要角色 [ 45, 46]。TERT还具有与端粒维持无关, 却能
提高细胞增殖能力的潜能 [ 33 ]的事实使得有关过度
表达 TERT这一人体端粒酶蛋白的组成成分的研究
结果变得复杂化。
机体衰老和端粒酶活性及端粒长度二者之间的
联系在端粒酶缺失 [ 47 ]及 TERT这一端粒酶成分过
度表达 [ 48]小鼠的研究中得到证实。然而有关端粒
49
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 8期
长度和细胞维持之间的关系还不能绝对化, 端粒功
能受损能导致不伴随有端粒逐渐缩短现象的组织退
化 [ 49] ,非常奇怪的是最新的研究显示 TERT也可能
促使组织起源细胞的具 TERT逆转录酶依赖性的增
殖。相反, TERT介导的涉及 Myc和Wn t的转录程
序的激活也证实非标准的反应机制的存在 [ 50, 51 ]。
此外, 现在人们发现诱导的多功能干细胞 ( iPS)与
胚胎干细胞的端粒性质在次生标记方面相似, 并且
通过端粒酶的重新导入端粒酶缺失小鼠细胞重组率
降低的问题可以得到解决 [ 52 ]。不容置疑,端粒长度
的维持及保护是控制细胞生命力的重要因素, 但机
体衰老是受多种因素影响的高度复杂过程。
4. 3 遗传疾病综合症
编码 TERT基因或属于人体端粒酶亚基的端粒
酶 RNA成分 ( TERC )亦或是编码一些端粒结合蛋
白的基因发生干细胞系突变与获得性及先天性再生
性障碍贫血症在基因水平存在联系 [ 53]。编码一种
与核糖体 RNA和 TERC相互联系的蛋白质的 DKC1
基因发生突变将引发伴 X染色体先天角质不全综
合症 ( DKC ) [ 54, 55]。其它形式的常染色体显性的先
天角质不全归因于 TERC、TERT或者其它与端粒维
持相关蛋白质的编码基因的突变, 这为端粒酶缺陷
是诱发该过程的潜在原因提供了可靠证据 [ 56 ]。在
揭示缩短的端粒与以指甲萎缩,口腔黏膜白斑病以
及异常的皮肤色素沉着等起决定性作用的特征外还
以掉发、头发枯黄、牙齿脱落以及骨质疏松等早衰为
标志特征的人类疾病之间存在联系的试验中 DKC
的端粒酶功能缺陷特征起了关键作用。其它的相关
综合症被认为与 TERC突变相关 [ 55]。在一些具原
发性的家族流行肺纤维症病人中发现 TERT 和
TERC以及缩短端粒的杂合干细胞系发生了
突变 [ 57, 58]。
正如所料,细胞广泛的功能保守性具重大意义,
基因缺陷引发的端粒与端粒酶完整性受损是许多疾
病的病因。有关潜在的分子机制的知识为正确诊断
提供了可能性,并增强了人们对未来治疗学发展的
信心。
5 展望
伊丽莎白 布莱克本, 卡萝尔 格雷德和杰
克 绍斯塔克 3位博士的发现解决了染色体是如何
通过端粒和端粒酶而得到保护这一生物学基本问
题,开辟了一全新的研究领域。端粒酶和端粒结构
维持的研究为我们洞悉诸如癌症、衰老以及遗传疾
病综合症等医学高度相关领域提供了新方略, 尽管
它们之间的联系比起初预测要更复杂。该发现也促
进了目前正处于临床检测阶段的基于以端粒酶活性
及表达为目标的癌症治疗新策略的发展。
说明: 本文主要参考诺贝尔官方网站瑞典卡洛
琳斯卡医学院诺贝尔奖组委会委员 Rune Toftgrd
的文章改写而成,并得到了原作者的授权。
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