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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
木聚糖酶高产黑曲霉的选育及其酶学性质研究
王聪 张光杰
(安阳工学院生物与食品工程学院，安阳 455000)
摘 要: 木聚糖酶是一种可以将木聚糖水解为木二糖和木二糖以上的低聚木糖，以及少量木糖和阿拉伯糖的组酶，在
饲料、食品和造纸等行业具有广阔的应用前景。研究了紫外选育得到的一株木聚糖酶活力比较高的黑曲霉突变菌株 Aspergil-
lus niger N86 的最佳产酶条件及其酶学性质。
关键词: 黑曲霉 木聚糖酶 紫外诱变 发酵条件 酶学性质
Sthdy on Mutation and Enzymic Properties of
Highly Production Xylanase Strain
Wang Cong Zhang Guangjie
(Anyang Institute of Fechonology，Anyang 455000)
Abstract: Xylanases are a group of enzymes that can break down xylans into xylooligosaccharides，xylose and arabinose，and can be
of high potential for use in feed，food and paper making industry. In this study，a mutant with high xylanase activity was screened by ultra-
violet，named as Aspergillus niger N86. The best conditions of the enzyme production and the properties of the xylanase were investigated.
Key words: Aspergillus niger Xylanase UV mutation Fermentation conditition Enzymic properties
收稿日期:2010-01-13
作者简介:王聪，男，硕士，助教，从事蛋白质(包括酶)、核酸的结构和功能以及生物调控的分子基础等方面的研究;E-mail:shiziwangcong@ so-
hu. com
通讯作者:张光杰，男，硕士，讲师，从事焙烤及果酒制品加工方面的研究;E-mail:zhangguangjie000@ 163. com
植物中含有 20% － 30%的半纤维素，木聚糖是
半纤维素的重要组分，在植物细胞壁中的含量仅次
于纤维素，约占细胞干重的 35% ［1］。木聚糖在自然
条件下很难被降解利用，尽管一些化学方法可以提
高木聚糖的降解，但同时给其他操作带来很大的不
便，甚至会对人类的健康带来严重的影响。木聚糖
酶能够降解木聚糖生成功能性低聚木糖产品，或降
解生成可利用的单糖，可用于化学或生物化学加工，
可制取酒精、食品、单细胞蛋白、医药品及其化学化
工原料，从而为人类解决粮食、能源、资源等危机提
供重要途径［2］。本研究以一株经紫外选育的黑曲
霉 Aspergillus niger N86 为木聚糖酶的来源，对其产
酶条件进行优化，并对其酶学性质进行了研究。
1 材料及方法
1 1 药品及仪器
黑曲霉(Aspergillus niger)为东北农业大学食品
学院保藏菌种;桦木木聚糖(Birch-xylan)、木糖(xy-
lose)购自 Sigma 公司。其他化学试剂均为国产分析
纯。麸皮，市购，过 40 目筛;PDA 培养基:马铃薯
200 g /L，蔗糖 20 g /L，琼脂 20 g /L，pH值自然，121℃
灭菌 20 min;固体初筛选培养基:木聚糖 5 g /L，
NaNO3 2 g /L，K2 HPO4 1 g /L，KCl 0 5 g /L，MgSO4
0 5 g /L，Fe2 (SO4)3 0 5 g /L，蔗糖 30 g /L，琼脂
20 g /L，pH值自然，121℃灭菌 20 min;液体发酵培养
基:葡萄糖 2 g /L，蛋白胨 10 g /L，K2 HPO4 2 g /L，
MgSO4 7H2O 0 5 g /L。
紫外分光光度计:UV-2401PC，SHIMADZU;pH
计:Beckman 公司;水浴锅:江苏金华天坛实验设备
厂;控温培养箱:上海跃进医疗器械厂;电子天平:德
国塞多利斯公司;冷冻离心机:Sigma 公司;SANYO
蒸汽压力灭菌锅:日本三洋电子有限公司;超纯水系
统，USF PURELAB PLUS，德国;超净工作台，上海浦
东物理光学仪器厂;可控温大振幅摇床:中国科学院
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
武汉科学仪器厂。
1 2 木聚糖酶的酶活测定
1 2 1 酶活定义 试验条件下每毫升酶液(或每
克酶制剂)每分钟水解木聚糖生成 1 μmol木糖所相
当的酶量定义为一个酶活力单位。
1 2 2 木糖标准曲线的制备 1 mg /mL 木糖标准
溶液:将一定量分析纯木糖于 80℃真空干燥箱中干
燥至恒重，准确称量 0 1 g木糖，用蒸馏水完全溶解
后，在容量瓶中定容至 100 mL，4℃冰箱保存，备用。
分别量取 0、0 1、0 2、0 3、0 4、0 5 mL 木糖标
准溶液置于 10 mL带塞玻璃管中，用蒸馏水补齐至
2 mL，再加入 2 mL DNS试剂，沸水浴 5 min，流水冷
却，加蒸馏水定容至 10 mL，反转混匀。在紫外分光
光度计上进行比色，波长 540 nm，用空白管调零，测
出 1 － 5 号管的光密度值。以光密度值为纵坐标，木
糖浓度为横坐标，绘制木糖标准曲线［3］。
1 2 3 DNS 酶活测定方法［4］ 对照组:取 1 8 mL
的 1 0%木聚糖溶液于 10 mL 加塞玻璃管中，加入
相应灭活的稀释酶液 0 2 mL，DNS 试剂 2 mL。沸
水浴5 min，流水冷却后，用蒸馏水定容至 10 mL。
每一个样品设有一个对照。样品组:取 1 8 mL 的
1 0%木聚糖溶液于 10 mL加塞玻璃管中，加入稀释
酶液 0 2 mL，50℃水浴 10 min，取出后立即加入
DNS试剂 2 mL。沸水浴 5 min，流水冷却后，用蒸馏
水定容至 10 mL，反转混匀后，在波长 540 nm 分光
光度计上进行比色，用对照组调零点，每次做 5 个平
行试验，结果取平均值，根据光密度值从标准曲线上
得到还原糖的浓度。
1 2 4 木聚糖酶的酶活公式
木聚糖酶酶活(IU /mL)= N × C × 10M × T × V × 1 000
试中，N为上清的稀释倍数，C 为由标准曲线得
到的浓度(mg /mL) ，M 为木糖的分子量(150) ，T 为
反应时间(s) ，V为加入稀释后上清的体积(mL)。
1 3 菌种的选育
1 3 1 单孢子悬浮液制备 取 PDA斜面培养基上
生长 5 －6 d黑曲霉孢子，置于装有生理盐水和玻璃珠
的三角瓶中，摇床上 200 r /min 震荡 1 h 使孢子分散，
然后用脱脂棉过滤孢子悬液，用血球计数板对孢子进
行镜检计数，并将孢子浓度调整到 106 －107个 /mL。
1 3 2 紫外线处理 将单孢子悬液注入 9 cm 无
菌培养皿中，厚度约 2 mm，然后置于 15 W紫外灯下
28 cm处照射 180 s，致死率 90% －99%。
1 3 3 菌株的初筛 将紫外线处理过的孢子
悬液在红光下稀释成一定的浓度梯度，涂抹到固
体初筛培养基上，30℃恒温培养 4 d 后，采用刚果
红染色法，根据木聚糖酶分解木聚糖底物生成的
寡糖不能被刚果红染色，从而在菌落周围形成透
明圈这一特性［3，5］。挑取产透明圈直径与菌落直
径之比大的菌落于 PDA 培养基中，30℃恒温培养
72 h后，然后接入摇瓶培养基进行复筛。
1 3 4 菌株的复筛 在 250 mL 三角瓶加入 2 g
麸皮和 50 mL、pH6 液体发酵培养基，灭菌后降温到
室温，将初筛后的菌株接入摇瓶发酵进行复筛，每瓶
接 1 － 2 环，接种后在 30℃，220 r /min的摇床中培养
84 h后，在 4℃，用 4 000 r /min 的速度将发酵液离
心 10 min，上清液即为粗酶液。DNS 法测木聚糖酶
酶活后，选出酶活最高的一株即为突变菌株。
1 3 5 突变菌株的遗传稳定性 将突变菌株传代
10 次，DNS 法测其木聚糖酶酶活，确定其遗传的稳
定性。
1 4 突变菌株与出发菌株酶学性质的比较
1 4 1 突变菌株与出发菌株酶种类的比较 纤维
素酶酶活的测定方法:取 0 5 mL适当稀释的的酶液
加入 0 5 mL 1%CMC溶液(溶于 0 05 mol /L柠檬酸
缓冲液，pH5，50℃保温 30 min，加入 1 mL DNS试剂
终止反应，煮沸 5 min，于 540 nm 波长下比色，由比
色读数换算成每 mL酶液作用半小时后产生的葡萄
糖毫克数。规定在上述条件下，每分钟产生1 μmol
葡萄糖为 1 个酶活力单位［6］。
淀粉酶酶活的测定方法:吸取 20 mL 可溶性淀
粉溶液于试管中，加入 5 mL 缓冲液，摇匀后，于
60℃恒温水浴中液预热 5 min。加入适当稀释的待
测酶液 1 mL，立刻计时，摇匀，准确反应 5 min。立
即吸取 1 mL反应液于 5 mL稀碘液中，摇匀，并以稀
碘液作为空白，于 660 nm 波长下用 1 cm 比色皿迅
速测定其吸光度(A)，根据其吸光度查“吸光度与测试
酶液浓度对照表”，求得待测酶液的浓度(IU /mL)［7］。
1 4 2 突变菌株与出发菌株木聚糖酶 pH 值稳定
性的比较 用不同 pH的上述缓冲液分别在 50℃下
822
2010 年第 6 期 王聪等:木聚糖酶高产黑曲霉的选育及其酶学性质研究
处理木聚糖酶溶液 30 min，DNS 法测定酶活，考察
木聚糖酶的 pH 稳定性，以酶活最高者为 100%，在
其他条件下的酶活占最高酶活的百分数即为该酶在
此 pH条件的相对酶活。
1 4 3 突变菌株和出发菌株的木聚糖酶温度稳定
性的比较 用最适 pH 的缓冲液配制溶液，分别在
30、40、45、50、55、60、65、70℃下保温 30 min 然后放
入冰水中冷却，DNS 法测酶活，以酶活最高者为
100%，在其他条件下的酶活占最高酶活的百分数即
为该酶在此温度条件的相对酶活［8］。
1 4 4 突变菌株木聚糖酶的反应动力学 用最适
pH 的缓冲液配制成 0 2%、0 4%、0 6%、0 8%、
1 0%浓度的木聚糖溶液，按照 DNS 法，将不同浓度
的木聚糖溶液与突变菌株产的木聚糖酶粗酶液按照
9∶ 1 的比例混合，在最适温度下测定酶的活力，利用
米氏方程双倒数作图法确定 Km、Vmax
［9］。
2 结果与分析
2 1 木糖标准曲线
按 1 2 2 方法制作的木糖标准曲线结果如表
1、图 1。
表 1 木糖的标准曲线
木糖浓度(mg/mL) 0 0 01 0 02 0 03 0 04 0 05
吸光度值(540 nm) 0 019 0 185 0 314 0 481 0 687 0 819
图 1 木糖的标准曲线
2 2 菌种的选育
黑曲霉单孢子悬液经紫外线照射 180 s，涂抹到
固体初筛选择培养基上，30℃培养 4 d 后，培养皿中
加入适量 0 1%的刚果红溶液，染色 30 min;弃去染
液，加入适量 l mol /L 的 NaCL 溶液，洗脱 30 min。
假如黑曲霉产生木聚糖酶，则菌落的周围会出现清
晰的透明圈(背景为红色) ，从培养基上挑选有透明
圈直径与菌落直径之比比较大的黑曲霉菌落，确定
为初筛菌株，斜面扩大培养。
将初筛菌株接入液体产酶培养基中发酵 84 h，
DNS法测定木聚糖酶的活力，经过比较，从中选择
一株木聚糖酶活力较高的黑曲霉突变菌株 Aspergil-
lus niger N86。在相同的产酶条件下突变菌株 Asper-
gillus niger N86 比出发菌株的酶活力提高近 30 个单
位，提高了约 40%。发酵观察发现，在以麸皮为碳
源的发酵培养基中，正突变菌株大都菌丝团较小并
且较均匀，这样生物量大，并且发酵周期长，有利于
产酶。负突变菌株大部分结成较大菌丝团，产酶、传
氧、生物量都下降，导致发酵周期短、菌丝易自溶。
分析其原因与菌丝生长速度过快有关。诱变结果如
表 2。
表 2 紫外线诱变结果
菌株号
酶活
(IU /mL)
菌株号
酶活
(IU /mL)
菌株号
酶活
(IU /mL)
出发菌株 54 N47 49 N86 83
N1 61 N48 41 N88 45
N14 54 N51 53 N90 24
N26 19 N54 42 N97 60
N35 16 N63 23 N104 51
N39 46 N74 35 N107 44
N41 59 N78 57 N109 54
2 3 突变菌株的遗传稳定性
将突变菌株 Aspergillus niger N86 的孢子在 PDA
斜面上转接 10 代后，接入液体产酶培养基中进行液
体发酵，DNS 法测定木聚糖酶的活力，结果如表 3。
结果表明，Aspergillus niger N86 木聚糖酶酶活具有
比较好的稳定性，是一株遗传稳定的黑曲霉菌株。
表 3 突变菌株 Aspergillus niger N86 的遗传稳定性
传代次数 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
酶活(IU /mL) 69 74 72 70 83 72 71 81 74 75
2 4 突变菌株与出发菌株酶学性质的比较
2 4 1 突变菌株与出发菌株酶种类的比较 突变
菌株和出发菌株的木聚糖酶、纤维素酶、淀粉酶的活
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
力测定结果表明，突变菌株的木聚糖酶活力是出发
菌株木聚糖酶活力的 2 5 倍，而纤维素酶和淀粉酶
的活力和出发菌株的差别不大。
表 4 突变菌株和出发菌株酶种类的比较
菌株
酶种类
突变菌株 出发菌株
木聚糖酶酶活(IU /mL) 136 54
纤维素酶酶活(IU /mL) 37 32
淀粉酶酶活(IU /mL) 0 0
2 4 2 突变菌株与出发菌株木聚糖酶 pH 值稳定
性的比较 测定突变菌株和出发菌株木聚糖酶在不
同 pH值下的木聚糖酶酶活，结果如图 2。试验结果
表明，出发菌株木聚糖酶在 pH5 － 9 之间稳定性良
好，能保持 59 5%以上的酶活。突变菌株木聚糖酶
在 pH5 － 9 稳定性良好，能保持 63 4%以上的酶活。
二者在 pH3 － 4 之间酶活都较低。
图 2 突变菌株与出发菌株木聚糖酶 pH值稳定性
2 4 3 突变菌株和出发菌株的木聚糖酶温度稳定
性的比较 测定突变菌株和出发菌株的木聚糖酶在
最适 pH值，不同温度保温 30 min的酶活，结果如图
3。试验结果表明，随着温度的升高出发菌株和突变
菌株的木聚糖酶酶活都下降，两者在 30 － 50℃范围
内保持比较好的热稳定性。出发菌株的木聚糖酶半
失活温度在 55℃左右，突变菌株木聚糖酶半失活温
度在 60℃左右。当温度超过 70℃的时候，二者几乎
检测不出酶活力。
2 4 4 突变菌株木聚糖酶的反应动力学 按照
1 4 4方法配制不同浓度的木聚糖溶液，在 50℃，
pH6 条件下测定突变菌株木聚糖酶酶活，结果如表
5、图 4。根据米式方程，以 v对 v /［S］作图，得到一
图 3 突变菌株和出发菌株的木聚糖酶温度稳定性
条直线，其纵轴截距为 Vmax，横轴截距为 Vmax /Km，斜
率为 － Km。
Km =7 352 9 mg /mL，Vmax =16 9 μg /(mL·min)。
Km值是反映酶与底物结合的重要参数，Km值越小，说明
酶与底物的结合就越紧密，该底物也就是该酶的最适
反应底物，由此可以判断，木聚糖为木聚糖酶比较适宜
的反应底物。
表 5 酶反应速率与底物浓度的关系
样品标号
产物浓度
(mg /mL)
反应速
度(v)
底物浓度( ［S］)
(mg /mL)
v /［S］
反应
时间(min)
1 0 016 0 003 4 1 8 0 001 8 5
2 0 028 0 005 6 3 6 0 001 6 5
3 0 036 0 007 2 5 4 0 001 3 5
4 0 042 0 008 4 7 2 0 001 2 5
5 0 047 0 009 4 9 0 0 001 0 5
图 4 酶反应速率与底物浓度的关系
3 结论
本研究用紫外线对黑曲霉出发菌株进行处理
后，从中筛选到了一株木聚糖酶活力比较高的突变
菌株 Aspergillus niger N86，传代 10 次后产酶能力稳
定性良好。突变菌株 Aspergillus niger N86 产木聚糖
(下转第 250 页)
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
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2005.
(上接第 230 页)
酶最佳的液体发酵的最佳条件为麸皮 4%，葡萄糖
0 1%，(NH4)2SO4 2 0%，吐温-800 1%，KH2 PO4
0 2%，MgSO4·7H2 O 0 05%，培养基初始 pH5，
250 mL 三角瓶的装液量为 50 mL。在 30℃，摇瓶
转速220 r /min的条件下，培养 72 h 木聚糖酶活力达
139 IU /mL。对生物、食品等行业的发展具有积极的
指导意义，同时为人类解决粮食、能源、资源等危机
提供重要途径。
参 考 文 献
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