全 文 ：技术与方法
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011年第 5期
DGGE技术在森林土壤微生物多样性研究中的应用
王洋清 杨红军 李勇
(西南大学资源环境学院,重庆 400715)
摘 要: 微生物在森林土壤物质转化中扮演着重要角色, 与森林的林型、土壤理化性质存在着密切关系。森林土壤微
生物多样性及其变化在一定程度上反映了土壤环境的生产力和稳定性,对表征森林演替, 土壤生态修复等有重要意义。变性
梯度凝胶电泳 ( DGGE)技术测定微生物多样性具有快捷、高效和可重复性高等优点。简要介绍 DGGE技术的原理,分析这一
技术的局限性和优化方法。重点以实例说明该技术在森林土壤微生物多样性研究中的应用现状, 展望该技术的发展前景,以
期能为今后这一领域的研究提供科学依据。
关键词: 森林土壤 DGGE 微生物多样性
Application of the DGGE Technique inM icrobial
Communities D iversity Research
W angYangqing YangH ong jun L iYong
(College of Resources and Environment, Southwest University, Chongqing 400715)
Abstrac:t Forests has an im po rtant func tion in the ecosystem. M icrobes p lay an im portant ro le in fo rest so i,l as w e l.l F or this
v iew, m icroorgan ism s have a c lose relationsh ip w ith the type o f forest stands, so il physical and chem ica l nature. It is wo rthy to emphasis
tha t, m icrob ial diversity play a key function in fo rest comm un ities. It can indicate the station of the forest env ironm ent. So it can be used
in success ion and restoration study. Recently, mo re and mo re published papers focus on th is area. The DGGE approach serve as a fast
and reproduc ible too ,l comp lem enting and fac ilitating future eco log ica l and eco tox ico log ica l communities research. In th is rev iew, we in-
troduced the pr inc iple of DGGE techn ique sho rtly, m a in ly reported the app lica tion o f this techno logy and dem onstrate on selected exam-
p les.
Key words: Forest so il DGGE M icrob ia l d iversity
收稿日期: 2010-12-01
基金项目:中央高校基本科研业务费专项资金资助项目 ( XDJK2009C 121 )
作者简介:王洋清,女,硕士研究生,研究方向:微生物学; E-m ai:l 445732773@ qq. com
通讯作者:李勇,男,博士研究生,研究方向:农业微生物; E-m ai:l liyongw @f sw u. edu. cn
微生物是土壤的重要生物指标, 在养分活化和
迁移中有重要作用 [ 1]。土壤微生物多样性的研究
可以间接反映土壤的理化性质。再者, 微生物的丰
富度及其变化能够体现其适应环境的过程。森林植
被对土壤环境有一定的影响,进而影响到土壤微生
物的群落结构和多样性, 所以研究森林植被多样性
和土壤微生物多样性之间的相互关系, 对于反映林
区土壤生态和微环境气候的变化等有积极作用 [ 2 ]。
但是, 自然界中可培养的微生物不到总数的 1% [ 3 ] ,
这就给客观认识环境中微生物的存在状况造成严重
障碍。分子生物学技术的发展为这一领域的研究提
供了重要工具。1986年, Pace等 [ 4]最先采用核酸测
序技术来研究微生物生态和进化, 将分子生物学技
术应用于微生物生态学的研究, 开辟了探究环境微
生物的新途径。1993年, M uyzer[ 5]首次将变性梯度
凝胶电泳 DGGE技术引入微生物生态学研究。近
年来, DGGE技术广泛应用于微生物多样性研究中,
涉及湖泊 [ 6]、草地 [ 7]、湿地 [ 8]、熔岩 [ 9]、食品 [ 11, 12]和
农田 [ 10]等各个领域。在森林土壤微生物多样性研
究中的应用也日趋增多。因此,本研究将对 DGGE
技术在森林土壤微生物多样性研究中的应用现状进
行综述;并对这一技术的应用前景作出展望,以期为
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
这一领域的研究提供科学依据。
1 DGGE技术简介
变性梯度凝胶电泳 ( DGGE )技术可将 PCR产
物分离,其主要原理是,在含有尿素和甲酰胺两种变
性剂浓度线形递增的聚丙烯酰胺凝胶电泳中, 双链
DNA分子部分解链, 电泳迁移率降低; 而序列不同
的 DNA分子解链行为不同, 从而在凝胶的不同位置
停止迁移,使得长度相同而序列不同的 DNA片段分
离。因此,样品 DNA经特异性扩增, 所得产物通过
电泳分离,根据电泳条带的多寡和条带的位置可以
初步辨别出样品中微生物的种类多少, 粗略分析土
壤样品中微生物的多样性。
这一技术的一般研究路线: 先将样品中提取的
DNA进行 PCR,其产物通过变性梯度凝胶电泳得到
电泳图谱。根据图谱可以直接进行聚类或相关性分
析以及探针杂交,亦可用以测序,回收 DNA并测序,
然后与 GenBank数据库中的序列进行同源性比对,
分析系统发育, 进而进行有目的的富集分离;再者,
也可以以此来设计探针进行原位杂交。
2 DGGE技术的重要环节及局限性分析
21 土壤 DNA的提取
土壤总 DNA的提取方法主要分为直接提取
法 [ 13]和间接法 [ 14] 两类。目前多采用直接提取
法 [ 15- 17 ] ,主要有以下几种: 溶菌酶或蛋白酶 K法、
SDS法、SDS和蛋白酶 K法、SDS-CTAB法、液氮处
理和冻融法以及以上方法的结合运用和商品试剂盒
提取等。玻璃珠打碎 ( bead-beat ing )是多数文献建
议使用的方法,其微生物多样性较一般方法高,但对
DNA的损伤也大, 如果获得的基因组 DNA片段小
于 1 kb不适合进行 PCR扩增。每种方法都存在局
限和优势,具体采用哪种方法, 要结合试验情况来选
择和探究。如, 李安英等 [ 18]采用 3种不同的方法提
取了草莓根际土壤中的 DNA, 比较结果表明, 预洗
处理的 PVP法为最适方法。何沙娥等 [ 19]研究了最
适于竹林土壤 PCR-DGGE分析的微生物总 DNA提
取方法。此外, 试剂盒也被研究者广泛采用: 如
D ineen等 [ 20]评价了不同试剂盒提取土壤细菌孢子
的效果,在研究中发现 FastDNA SPIN k it提取产量
高,而 E. Z. N. A. So ilDNA k it和 Pow erSo il DNA Iso-
lation k it能有效去除土壤中 PCR抑制剂。不同的
纯化方法对 PCR成功率有一定的影响, M arketa
等 [ 21]研究发现用 CaC l2法纯化 DNA, PCR成功率最
高, 可达 95%。
22 PCR反应及优化
PCR是 DGGE分析的关键, 在扩增过程中需要
选择合适的引物和确定最佳条件。目前,细菌引物
设计一般选择 16S rDNA的可变区。常用通用引
物: 338 f /518 r ( V3区 )、341 f /926 r( V3- V5区 )和
968 f /1401 r ( V6 - V8区 )。研究报道表明 [ 22- 24] ,
V3区扩增得到的片段长度一般为 200- 250 bp, 分
离效果最好, 条带数最多。V3- V 5区扩增片段的
长度一般为 450- 500 bp。在前期研究中发现, V3
区通用引物 F341-GC /R534的最适程序为: 94 4
m in, 94 30 s, 62 30 s(每个循环降 05 ), 72
30 s, 12个循环; 94 30 s, 56 30 s, 72 30 s, 23
个循环,最后 72 7 m in。真菌多样性的分析中通
用引物主要有: NS1、NS3、NS5、NS6、NS8、NS9、18SF
和 18SR, TS1、 ITS2、 ITS3、 ITS4、 ITS1-F 和
ITS4B
[ 25, 26]。此外,也有采用 28S rDNA序列的部分
片段作为通用引物的例子。如李欣雨等 [ 27]以 28S
rDNA的 U1 /U 2为引物, 用 DGGE法分析了施用甲
胺磷对土壤真菌群落的影响。沈洪等 [ 28]在研究羊
肚菌土壤真菌多样性真菌中也选用了这一引物。
在森林土壤微生物多样性研究中, 由于提取所
得 DNA中腐植酸以及有机质的含量较高,通过纯化
和稀释模板可提高 PCR产率。此外, 有报道表明,
半嵌套式 PCR可以提高 PCR成功率,有利于 DGGE
分析。
23 DGGE技术的局限性及改进方案
DGGE的优点在于它可以不依赖于培养, 同时
检测多种群落的组成。然而, 这种方法并不能检出
样品中的全部群落。主要的限制因素和对策: ( 1)
微生物细胞壁的严谨程度不同,在 DNA提取过程中
裂解率就不同;在 DNA提取时提高裂解时的水浴温
度 ( 90 )可以裂解。 ( 2) PCR扩增中引物存在偏好
性, 扩增所得到的产物并没有完全包括样品中的类
群; 嵌套式 PCR可以提高扩增的重现性和特异性。
( 3)可供测序的序列很短, 只能分辨 500 bp以下的
片段,这就限制了下游试验, 因为序列太短, 不能包
含全部的遗传信息, 难以准确鉴定。 ( 4)共迁移现
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2011年第 5期 王洋清等: DGGE技术在森林土壤微生物多样性研究中的应用
象,同一位置的片段所代表的种类并不是单一的某
一类, 一条 DGGE带可能代表几种菌, 也可能不同
的几条 DGGE带代表同一种菌,结合其他分析方法
可以解决这一问题。 ( 5)不能确定代谢活性、微生
物数量和基因表达的水平, 这就需要与传统方法相
结合。因此,用多种方法相结合来研究可以得到更
为详细的信息 [ 29]。
3 DGGE技术在森林土壤微生物多样性研
究中的应用现状
森林土壤微生物多样性分析,是近 10年来才发
展起来的一个领域。目前,相关报道逐渐增多,研究
领域也不再局限于热带、亚热带地区。研究的主要
内容是利用一些传统方法和分子生物学技术来分析
优势种群或微生物多样性与林型、土壤养分、土壤酶
活、土壤水分以及季节变化的关系。在微生物多样
性研究中, DGGE技术被研究者们广泛应用, 这一技
术主要应用于监测森林土壤中细菌和真菌的群落分
布的多样化程度以及在森林生态系统演替过程中微
生物群落的变化。主要包括以下一些方面: ( 1)群
落结构的研究。主要是分析不同林型土壤的群落分
布情况, K rista等 [ 30 ]通过 DGGE与克隆相结合,分析
了以外生菌根植物单一优势林和以丛枝菌根植物为
主导的混交林两种热带雨林中真菌的 18S rDNA,进
而通过分析群落组成, 验证了热带雨林中外生菌根
真菌在凋落物降解中有重要作用。Sach ie等 [ 31]在研
究 Collimonas细菌对土壤真菌群落组成的研究。
K orkama等 [ 32]选用 ITS1-F /ITS2研究了挪威云杉林
真菌的多样性。阮晓东等 [ 33]应用 PCR-DGGE技术
分析了油松阔叶混交林不同层次优势植被根区土壤
真菌的群落结构。N athali等 [ 34]利用 DGGE法和限
制性片段长度多态性 ( RFLP)结合简单重复序列
PCR ( ISSR ) ,通过分析澳大利亚硬叶森林中杜鹃花
科和桃金娘科的菌根真菌的 ITS序列, 探究了杜鹃
科植物与一定范围内的非杜鹃科植物的菌丝形成效
应。 ( 2)气候变化与微生物群落多样性之间的关
系。潘雪莲等 [ 35]利用 DGGE法分析了黄土高原的
土样, 根据分析结果显示, 夏季风加强而冬季风减弱
的时期,气候温暖潮湿, 风化成土作用强烈, DGGE
图谱中土壤样品条带多而密;相反,风化成壤作用较
弱时, DGGE图谱中的条带少而疏,由此推测出土壤
细菌与季风性气候引起的温湿环境变化及冰期有
关。 ( 3)自然修复与森林演替。一些研究者利用
DGGE技术以 16S rDNA V3区 GC-357 f/517为引
物,研究了黑土在长期自然修复、耕作和荒废 3种状
态下的细菌群落分布。据 DGGE图谱分析结果显
示, 3个样地不同深度土样中细菌的分布趋势相同。
经克隆测序分析等最后得出结论, 试验样地主导细
菌不可培养 [ 36]。王奇赞等 [ 37]采用 DGGE法分析了
天目山毛竹入侵阔叶林后土壤细菌群落结构的变
化。研究结果表明,入侵后土壤细菌多样性无显著
变化。王新洲等 [ 38 ]研究比较了喀斯特生态系统中
乔木和灌木林根际土壤微生物生物量及其多样性,
通过 DGGE图谱的聚类和相关性分析,证实了植被
的演替通过改变土壤微生物的特性影响,植物―微
生物―土壤之间的物质和能量循环, 进一步影响喀
斯特生态系统的稳定和健康。 Jure lev icius[ 39 ]应用培
养法、SIP探针以及 DGGE技术相结合, 研究了在石
油污染土壤中生长的 Cyperus rotundus. L 根部和根
际土壤中的细菌群落。在研究中选择细菌 16S rD-
NA U968F /L1401R为引物, 经聚类分析 DGGE法得
到的图谱发现,表层土壤、根际土壤与根部土壤中细
菌多样性相似度很高。此外, 还用 PCR-DGGE法分
析了氨氧化细菌的 a lkB基因和固氮菌的 nifH基因
结合培养获得的结果, 对部分序列进行了测定。研
究结果显示, Bosea、Cupriavidus、Enterobacter、Gor-
donia、Mycop lana、Pandoraea、P seudomonas、Rhizobium
和 Rhodococcus等 9个属可能与植物修复有关。
总之, DGGE技术在森林土壤微生物多样性研
究中应用的例子还有很多,这一方法在不断地改进,
在多样性分析中与其他方法相结合能够获得更加全
面的分析微生物的多样性, 使得到的结果最大程度
的反应原位群落结构。
4 发展前景
森林土壤微生物多样性的研究是森林土壤微生
物研究的一个重要分支。多样化的程度与林型, 季
节变化,土壤理化性质, 土壤酶活, 土壤水分都存在
着一定的关系。微生物作为一种灵敏的生物指标,
分析其多样性与上述指标的相关性,在森林演替、退
化、功能性微生物的筛选方面都有重要的意义。
DGGE技术作为这一领域研究中的一种快捷、有效、
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2011年第 5期
重复性高的分子生物学工具,虽存在一定的局限性,
但在森林土壤微生物多样性分析中发挥着重大作
用。因此, 在未来的研究中, 应该将 DGGE技术不
断改进,更好的应用于这个领域。相关领域的研究
者应该致力于探究出适合于不同林型、不同土壤的
DNA提取方法,寻找更为适合真菌多样性分析的引
物,以更好地研究森林微生态系统。此外,在研究中
应该将其与其他技术手段相结合, 不断优化相关技
术,发现新方法; 系统全面的分析森林土壤微生物的
多样性。进而结合其他有关森林土壤微生物的研
究,不断地推进森林土壤微生物的研究深度,扩大这
一领域的研究范围,并将研究成果应用到实际中去。
参 考 文 献
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(责任编辑 马鑫 )
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