全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
木质素降解菌 Bax的筛选及特性研究
姜明国 黎海菲 陆冠颖 夏璐
(广西民族大学化学与生态工程学院，南宁 530007)
摘 要: 为了高效降解造纸污水中木质素类化合物，采用苯胺兰和鞣酸平板法从腐木分离、筛选得到一株具有高降解
木质素活性的丝状真菌，经鉴定为绿色木霉，命名为 Bax。最适碳源为葡萄糖和蔗糖，最适氮源为蛋白胨和尿素，最适酸碱度
为 pH 5. 0，最适温度为 30℃。通过对木质素氧化酶系分析，主要起作用的是漆酶和木质素酶，为造纸污水的处理奠定了基础。
关键词: 木质素 木霉 漆酶 造纸污水
Screening of Lignin-degradation Filamentous Fungi
Jiang Mingguo Li Haifei Lu Guanying Xia Lu
(College of Chemical Engineering and Ecology，Guangxi University for Nationality，Nanning 530007)
Abstract: The filamentous fungi was isolated from the rotten wood by aniline blue and tannic acid plate． Bax that can possess the
ability of lignin biodegradability was identified as Trichoderma viride． The optimum carbon source was glucose and sucrose;the opti-
mum nitrogen source was peptone and urea;the optimum temperatures were 30 ℃ and the optimum initial pH values were 5. 0． The lig-
nin-degradating ability was analyze by qualitative and quantitative methods． In the 15-day incubation period，the Lac secreted from Bax
was maintained with upward tendency，and the Lac secreted from Bax increased gradually at first and then drop．
Key words: Lignin Trichoderma Laccase Waste water from pulp and paper mills
收稿日期:2010-09-08
基金项目:广西科学基金项目(桂科青 0640017)
作者简介:姜明国，男，博士，副教授，研究方向:微生物生物技术;E-mail:mzxyjiang@ 163． com
木质素是一种由类苯丙烷亚单位组成的天然聚
合物，与其他生物聚合物在结构上很不相同。木质
素的亚单位的连接方式是一种非线性的随机方式，
木质素的类苯丙烷前体物在一种细胞壁上的过氧化
物酶的催化下，经历单电子氧化，生成苯氧基自由
基，这些自由基发生各种共振，并彼此偶联缩合形成
聚合物从而使得木质素的结构比较稳定，在一般条
件下很难被分解［1］。在造纸工业生产的过程中使
用木材、稻草、芦苇和破布等为原料，经高温高压蒸
煮而分离出纤维素，制成纸浆，最后排出含有木质
素、纤维素和挥发性有机酸等黑液，污染环境［2］。
木质素的微生物降解主要发生在次生代谢阶
段，当一些主要营养物，如氮、碳、硫受限制时与降
解活动相关的酶如漆酶(laccase)、锰依赖性过氧化
酶(mnp)和木质素酶(lip)才会形成，通过形成一个
复杂的胞外过氧化酶系统而对木质素进行降
解［3，4］。目前报道能降解木质素的微生物多是白腐
真菌、褐腐真菌和软腐真菌［5，6］，木霉属一般产生纤
维素酶，降解木质素的研究较少［7］。本试验从腐木
中分离筛选到一株对木质素具有较高降解能力的真
菌菌株 Bax，对其进行形态学和分子生物学鉴定，及
其部分特性进行研究。
1 材料与方法
1. 1 培养基
PDA固体培养基:马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼
脂 15 g，加水定容到 1 L，pH 自然;鞣酸平板培养基:
马铃薯 200 g，葡萄糖 20 g，琼脂 15 g，终浓度为 0. 5%
的鞣酸，加水定容到 1 L，pH 自然;产酶培养基:葡萄
糖 10 g /L，酒石酸铵 0. 1 g /L，KH2PO4 1. 0 g /L，Mg-
SO4·7H2O 0. 0035 g /L，CuSO4·7H2O 0. 007 g /L，
121℃灭菌 30 min;木质素降解培养基:0. 5 g 葡萄
糖，0. 5 g MgSO4·7H2 O，0. 5 g KH2 PO4，0． 5 g
NaCl，1. 0 g KNO3，碱木质素 560 mg，pH7. 4 定容 1
L，121℃灭菌 30 min。
2011 年第 3 期 姜明国等:木质素降解菌 Bax的筛选及特性研究
1. 2 菌种分离筛选
采集广西民族大学校园内的亚热带自然林保护
区的腐朽倒木碎片，先用灭菌蒸馏水冲洗振荡，把
碎木片去掉，然后进行 10 000 r /min高速离心分离 5
min，把上清液弃掉，沉淀用灭菌蒸馏水稀释，采用平
板稀释法在 PDA培养基上培养，挑选单个菌落到鞣
酸平板进行筛选，有阳性反应的丝状真菌进一步纯
化，验证漆酶活性后，把一份菌株转移到斜面 4℃冰
箱中保藏，而另一份菌株放入 5 mm × 5 mm × 5 mm
木块，在相同环境下继续培养 5 － 10 d 后，转移至
4℃冰箱中作饲木保藏培养［8］。
1. 3 菌株产木质素降解酶的分析
选择目标菌接种于产酶培养基中，150 r /min 培
养 15 d定时取样，培养液 13 000 r /min离心 10 min，
取上清液作为粗酶液。
漆酶(lac)活性测定采用 ABTS 法，酶活定义:
一个酶活力单位(U)是指在一定条件下，反应体系
中每分钟催化 1 μmol ABTS［4］;过氧化物酶(LliP)
活性测定采用藜芦醇法［9］;锰过氧化物酶(MnP)活
性测定按照 Rogalski方法进行［10］。
1. 4 木质素降解的分析
Bax菌株分别接入 200 mL 木质素降解培养基
和造纸污水培养基(木质素降解培养基中的水用造
纸污水部分取代)中在摇床培养箱中于 30℃，150
r /min条件下培养，按时间采样于 13 000 r /min下离
心处理液，测定木质素浓度。
1. 5 菌株鉴定
真菌形态鉴定参照齐祖同［11］介绍的方法和分
类依据进行初步的分类。进一步采用 18S rDNA 基
因进行分子鉴定。总 DNA的提取 CTAB提取法［12］，
真菌 18S rRNA 基因通用引物为 ITS1 (5-TCCG-
TAGGTGAACCTGC-GG-3和 ITS4(5-TCCTCCGCT-
TAT TGATATGC-3) ，PCR反应程序:预变性 95℃，5
min，变性 95℃，30 s，退火 52℃，30 s，延伸 72℃，1
min，最后延伸 72℃，10 min，循环次数 35。琼脂糖
凝胶电泳检测 PCR产物，回收纯化测序(上海捷瑞
生物工程有限公司)。
1. 6 不同条件对菌株的影响
将活化后的菌种接种到不同 pH 值(3. 5、4. 0、
4. 5、5. 0、5. 5、6. 0、6. 5、7. 0 和 8. 0)液体 PDB 培养基
中，30℃培养，3 d后对其菌体干重进行测量;将活化
后的菌种接种到 pH 5. 0 液体 PDB培养基中，分别置
于 20℃、25℃、30℃、37℃及 42℃温度下进行培养，3 d
后对其菌体干重进行测量;将菌种接入 pH值合成培
养基中，27℃条件下培养 3 d，测试最佳碳源和氮源。
2 结果
2. 1 降解木质素菌株的筛选
采集样品初筛出能降解木质素的真菌 17 株，通
过产酶发酵试验复筛出具有较高木质素酶活的菌株
1 株，编号为 Bax。Bax菌株在苯胺兰平板呈阳性反
应，鞣酸平板培养 5 d脱色直径达 7 cm(图 1-A) ，说
明该菌株既产过氧化物酶又产漆酶，因此选定菌株
Bax作进一步研究。
2. 2 菌株 Bax的鉴定
Bax菌株菌落生长快，在 PDA平板上 28 － 30℃
生长茂盛 48 h 后，菌落直径达 70 － 90 mm，72 h 后
整个平板上形成轮状的绿色孢子，正面为暗绿色，背
面无色(图 1-B) ，气生菌丝具有横隔，菌丝分枝交
错，分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，直立、分枝
(图 1-C)。
图 1 菌株 Bax的形态与显微图
通过 NCBI 利用 BLAST 功能搜索 Bax 的 18S
rDNA基因同源性序列，菌株 Bax 与木霉属的 Tri-
choderma viride 同 源 性 达 到 了 99. 82%，运 用
DNASTAR软件按照 Neighbor-joining 法构建系统
102
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
进化树(图 2) ，根据以上结果，鉴定该菌为绿色 木霉。
图 2 T． viride的分子进化树
2. 3 木质素降解分析
经过 15 d的培养，Bax对木质素培养基中的木质
素从 560 mg /L 降解 290 mg /L，降解率为 48. 21%;
对造纸污水培养基中的木质素从 210 mg /L 降解
135 mg /L，降解率为 35. 71%;菌体木质素培养基中
的干重到第 9 天增加到 2. 9 g /100 mL 后重量不再
增加(图 3)。结果表明，木质素的降解随着菌丝体
的增加而增加，这说明 Bax 在生长的过程中就产生
了木质素降解的相关酶，当菌体停止生长时降解活
性仍然在增加，这可能与黄孢原毛平革菌当营养全
部消耗触发或启动了一系列的自由基链反应，实现
对底物的氧化和木质素的降解相似［13］。Bax 对木
质素培养基中的木质素降解效率明显高于造纸污水
中木质素，这可能是由于污水中有多种物质对其生
长和代谢产生影响，导致生长和降解均弱于在木质
素的培养基。
图 3 木质素降解能力的变化
2. 4 产酶特性研究
根据目前公认的木质素微生物降解相关酶
Lac、Mnp和 Lip的测定发现，Bax从第 3 天起就可以
测到漆酶的活性，一直呈上涨趋势直至到 15 d 产生
32. 85 U /L;木质素酶的产生到第 9 天达到高峰 254
U /L，之后迅速下降;然而锰依赖性过氧化酶的产量
一直很低。但是木质素降解试验中降解活性一直在
增加，这可能和漆酶的一直增加有关，只产生漆酶或
者产生漆酶和木质素酶的真菌具有高效降解木质素
的真菌已有大量文献报道［13］。
图 4 液体培养绿色木霉产酶曲线
2. 5 菌种特性研究
经过 3 d培养后 pH4. 5 和 5. 0 的菌体干重分别
为 1. 12 g /100 mL和 1. 31 g /100 mL均高于其他 pH
值，当 pH8. 0 时菌体几乎不生长。在 pH5. 0 的条件
下对不同温度考察表明，30℃时菌体干重为 1. 35
g /100 mL，其他温度时的菌体干重均低于 30℃时
(差异显著) ，在 37℃与 42℃下，菌体不生长。对碳
源的测试发现，在葡萄糖和蔗糖为唯一碳源时菌体
干重分别为 1. 43 g /100 mL 和 1. 41 g /100mL 均高
202
2011 年第 3 期 姜明国等:木质素降解菌 Bax的筛选及特性研究
于其他碳源，但两者之间差异不显著。从菌落形态
上观察，在葡萄糖和蔗糖上生长的菌丝茂盛;在木糖
和果糖上长菌丝很少，都是贴面生长;麦芽糖上的菌
丝生长良好，由中心向外辐射;乳糖上长的菌丝比较
稀疏;羧甲基纤维素钠也是向外辐射生长，但只有很
少的菌丝。对氮源的测试发现在蛋白胨和尿素为唯
一氮源时菌体干重分别为 1. 47 g /100 mL 和 1. 42
g /100 mL均显著高于其他氮源。从菌落形态上观
察，蛋白胨培养基上的菌丝体茂盛，且气生菌丝体
长;加尿素的培养基上，气生菌丝茂盛，菌丝较高，且
以接种点为中心，形成一圈圈的生长圈;在氯化铵上
菌丝比较矮，贴面生长比较多，菌丝尖端有微小水
珠;在干酪素上气生菌丝很少，都是贴面向外扩增;
在硝酸铵上只有中间有菌丝体生长，且是非常集中
的长成一丛，生长缓慢;在硝酸钠和亚硝酸钠上的菌
丝体比较稀疏，向外扩张的生长。结合菌体干重和
菌落形态，由此得出这株菌的最适碳源为葡萄糖和
蔗糖，最适氮源为蛋白胨和尿素，最适酸碱度为
pH5. 0，最适温度为 30℃。
3 结语
通过系列试验筛选到一株具有降解木质素高活
性的丝状真菌，经形态学和分子生物学鉴定该真菌
同绿色木霉 T． viride 同源性达到了 99. 82%，命名
为 Bax;该菌最适碳源为葡萄糖和蔗糖，最适氮源为
蛋白胨和尿素，最适酸碱度为 pH5. 0，最适温度为
30℃。Bax对木质素培养基中的木质素降解率为
48. 21%，对造纸污水培养基中的木质素降解率为
35. 71%;产酶分析 Bax主要产漆酶和木质素酶。该
研究证明了木霉属除了产生纤维素酶外，同时也会
生产木质素降解酶。在木霉属中起主要降解作用的
酶系本试验未涉及。本试验为生物法处理造纸污水
中的氯化木质素奠定了基础。
参 考 文 献
［1］Adler E． Lignin chemistry—past，present and future． Wood Science
and Technology，1977，11(3) :169-218．
［2］ Pokhrel D，Viraraghavan T． Treatment of pulp and paper mill
wastewater—a review． Science of the Total Environment，2004，333
(1-3) :37-58．
［3］ Arora DS，Chander MGill PK． Involvement of lignin peroxidase，
manganese peroxidase and laccase in degradation and selective ligni-
nolysis of wheat straw． International Biodeterioration ＆ Biodegrada-
tion，2002，50(2) :115-120．
［4］Youn HD，Hah Y CKang SO． Role of laccase in lignin degradation
by white-rot fungi． FEMS Microbiology Letters，1995，132(3) :
183-188．
［5］Bumpus JA，Aust SD． Biodegradation of environmental pollutants by
the white rot fungus phanerochaete chrysosporium:Involvement of
the lignin degrading system． Bioessays，2005，6(4) :166-170．
［6］Liang JF，Huang HS ，Zhang KQ ，et al． Study on the screening of
the lignin-degrading fungus and the degradation of straws． Acta Ag-
riculturae Boreali-Sinica，2009，24(5) :206-209．
［7］Silva-Stenico ME，Vengadajellum CJ，Janjua HA，et al． Degrada-
tion of low rank coal by trichoderma atroviride ES11． Journal of In-
dustrial Microbiology and Biotechnology，2007，34(9) :625-631．
［8］国家自然科技资源平台． 微生物菌种资源收集，整理，保存技
术规程汇编［C］． 2002．
［9］Archibald FS． A new assay for lignin-type peroxidases employing the
dye azure B． Applied and Environmental Microbiology，1992，58(9) :
3110．
［10］ Rogalski J，Szczodrak J，Janusz G． Manganese peroxidase produc-
tion in submerged cultures by free and immobilized mycelia of
Nematoloma frowardii． Bioresource Technology，2006，97(3) :
469-476．
［11］ 孙军，段玉玺，吕国忠． 辽宁木霉属(Trichoderma)真菌的形态
分类研究．菌物研究，2006，4(2) :38-44．
［12］ Henry T，Iwen PC，Hinrichs SH． Identification of aspergillus spe-
cies using internal transcribed spacer regions 1 and 2． J Clin Mi-
crobiol，2000，38(4) :1510-1515．
［13］ 李慧蓉．白腐真菌的研究进展．环境科学进展，1996，4(6):69-77．
(责任编辑 狄艳红)
302