全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-04-21
基金项目：973 计划前期研究专项（2007CB516810）
作者简介：郝美君（1970-），女，硕士研究生，从事病毒分子生物学研究
通讯作者：黄爱龙，教授，博士生导师；Tel:023-68485230,E-mail:ahuang@cqu.edu.cn
引言
近年来，microRNA 的相关研究属研究领域的热点问题， 通过将 pre-miRNA 片段构建到绿色荧光蛋白
下游，通过绿色荧光蛋白的表达情况间接指示 microRNA 的表达，并采用多种方法进行验证证实，首次构建
了融合绿色荧光蛋白的 microRNA 表达载体，为今后 microRNA 功能研究提供了良好的技术平台。
1 方法
1.1 microRNA 表达载体构建
以 HepG2215 细胞基因组为模板扩增 microRNA122 前体。 引物设计 Pre-microRNA122（invitrogen 公司合
成）上游引物 5-GAC GTCGACTAAGAATGTGAAGGTGAAGTT-3。 下游引物 5-CACGGATCCACAAGATTGAGA
MicroRNA122真核表达载体的构建及在 HepG2
细胞中的表达与检测
郝美君 张祯祯 张文露 曾爱中 崔静 黄艺丹 黄爱龙
（重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室，重庆 400016）
摘 要： 为进一步研究microRNA的功能及作用靶标提供技术平台，构建microRNA真核表达载体。从HepG2215
细胞基因组DNA扩增microRNA122前体，克隆到pEGFP-C1的载体上，经测序鉴定后转染至HepG2细胞中，荧光显微
镜观察绿色荧光蛋白表达情况并提取基因组总RNA，RT-PCR检测microRNA122表达，TA克隆鉴定。结果表明，成功
构建microRNA122真核表达载体，并证实其在真核细胞HepG2中表达。此方法成功构建microRNA表达，并为后续研究
提供良好的技术平台。
关键词： microRNA 绿色荧光蛋白 真核表达载体
Construction and Detection of Eukaryotic Expression
Vector for MicroRNA122
Hao Meijun Zhang Zhenzhen Zhang Wenlu Zeng Aizhong Cui Jing
Huang Yidan Huang Ailong
（Institution of Viral Hepatitis，Key Laboratory of Molecular Biology on Infectious Disease，Chongqing University of Medical
Science，Chongqing 400016）
Abstract： The eukaryotic expression vector of PEGFP-c1-micro122 was constructed to research the function of
mircroRNA122. The pre-mircroRNA122 was amplified from total DNA of hepatoblastama cell line HepG2215. Gene
from HepG2215 was inserted into PEGFP-c1 vector to construct a vector PEGFP-c1- microRNA122 for fusion protein.
The expression of the fusion protein in HepG2 cell transfect with the vector was evaluated by the expression of GFP.
Total RNA was extracted and the expression of microRNA122 was evaluated by RT-PCR and sequencing. As a result，
the recombinant PEGFP-c1- microRNA122 was successfully constructed in Pegfp-c1 plasmid and the expression of
microRNA122 with EGFP was detected.
Key words： microRNA EGFP Eukaryocyte expression vector
2008年第 6期
AGACTAATA-3。 其中引入 Sal I 和 BamH I 两个酶切位点。 PCR 扩增条件 94℃预变性 5min，94℃变性 30s，
54℃退火 30s，72℃延伸 30s，5 个循环；94℃ 30s，56℃ 30s，72℃ 30s，25 个循环，72℃ 5min。 凝胶电泳鉴定可
见约 300bp 目的条带。 用 promega 纯化试剂盒纯化 PCR 产物。 BamH I 和 Sal I（购于 TAKARA 公司）双酶切
后再次纯化得到 microRNA122 前体目的片段 。 pEGFP-c1 载体用 BamH I 和 Sal I 双酶切并纯化后 ， 插入
microRNA122 前体目的片段，载体构建成功。
1.2 转染细胞
HepG2 细胞（购于上海细胞所）用 MEM（10%HYCLONE 血清）培养，转染前 1d 种 6 孔板，每孔细胞数为
1×105 个， 细胞生长至 90%融合时进行转染。 将构建的 microRNA122 表达载体用 lipofectamine2000 脂质体
10μl（购于 invitrogen 公司）转染到 HepG2 细胞中，24h 后观察绿色荧光蛋白表达情况。
1.3 两步法 RT-PCR 验证
转染 24h 后提取总 RNA，做 RT-PCR（试剂盒购于 TAKARA），RT-primer 5-3：GTCGTATCCAGTGCAGG
GTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACACAAAC。 Hsa-miR-122a 5-3：TGGAGTGTGACAATGGTG 通用反义引
物 5-3：GTGCAGGGTCCGAGGT。 体外转录 20μl 体系，RNA 模板 8μl，Buffer 4μl，RNase Inhibitor 2μl， 引物
2μl，DNTP 2μl，逆转录酶 2μl。反应条件：将 RT 引物 95℃处理 15min 后立即置冰上，16℃ 20min，42℃ 1h，立
即置冰上。 进行第 1 轮 PCR， 反应体系 25μl， 包括逆转录产物 10μl，microRNA122 上游引物 1μl（10pmol/
μl），通用下游引物 1μl（10pmol/μl），dNTP1.5μl，Buffer 2.5μl，Taq 酶 0.2μl，DH2O 9μl。 反应条件：95℃ 预变
性 5min，95℃ 变性 15s，47℃退火延伸 20s，72℃ 1min，30 个循环； 第 2 轮 PCR 以第 1 轮 PCR 产物为模板
5μl，条件同第 1 轮循环。
1.4 TA 克隆鉴定
以 RT-PCR 产物为插入片段，克隆到 PTA2-VECTOR 载体（购于 TAKARA 公司 ），蓝白斑筛选 ，提取阳
性质粒，PCR 鉴定。
2 结果
2.1 构建 microRNA 重组质粒表达载体
以重组质粒为模板 PCR 扩增 microRNA 前体 ， 可得到约
300bp 目的条带（图 2）。 并经过 DNA 测序表明 microRNA 载体
构建成功。
2.2 验证 microRNA 重组质粒表达载体
microRNA 表达载体转染 HepG2 细胞后与绿色荧光蛋白
融合稳定表达 （图 3）。 RT-PCR 后凝胶电泳 （图 4）， 可见 PCR 产物为 60bp 左右特异目的条带 ， 表明
microRNA122 前体表达载体成功转染到 HepG2 细胞中 ，microRNA122 前体可在宿主细胞内切割成成熟的
microRNA122；以 TA 克隆质粒为模板 PCR 扩增 microRNA122，凝胶电泳约 340bp 阳性克隆和约 280bp 阴性
对照条带，证明约 20bp 的成熟 microRNA122 成功表达（图 5）。
图 1 microRNA 重组质粒表达载体构建
CMV 为启动子，Sal I 和 BamH I 为酶切位点
图 2 microRNA 前体的 PCR 图
2：PCR 扩增 microR-
NA 前体前体，约
300bp；1：50bpDNA
ladder Marker
图 3 绿色荧光蛋白融合 Micro122 稳定表达图
Sal I BamH I
左图 ：pEGFP-Micro122 转染 HepG2 后 ，绿色荧光蛋白融合 Micro122 稳定
表达；右图：pEGFP-Micro122 转染 HepG2 前未见绿色荧光蛋白表达
郝美君等：MicroRNA122真核表达载体的构建及在 HepG2细胞中的表达与检测 145
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
3 讨论
miRNA 或 microRNA 是一类广泛存在于动植物体内 ， 进化上高度保守的内源性非编码双链 RNA。
miRNA 通常源于一个大小约为 1 000bp 的长链 RNA 初始转录产物——Pri-miRNA，Pri-miRNA 分子在双链
RNA 特异性 RNsaeIII-Drosha 及其辅助因子 DGCR8 的作用下形成具有茎环状结构的前 miRNA （Pre-
miRNA）。 Pre-miRNA 在转运蛋白 exportion-5 的作用下转运至胞浆中，被另一个双链 RNA 特异性 RNsaeIII-
Dicer 识别，进一步切割成 19~23nt 成熟 miRNA。 成熟 microRNA 通过与靶基因完全（植物内）或不完全（动
物内）互补结合，促进靶基因 mRNA 降解或者抑制翻译，调控基因表达，广泛参与生命过程中一系列重要
进程，包括早期发育、细胞增殖、细胞凋亡、脂肪代谢和细胞分化 [1~3]。 据估计 microRNA 种类在动植物体内
多达上千种，至少调控机体内 10%~30%基因表达，其在生命活动中的重要性可见一斑。
越来越多的研究发现，microRN 在调控机体正常生理活动的同时也与疾病的发生关系密切，microRNA
和病毒感染之间的关系已成为关注的焦点。 一方面，病毒通过自身编码 miRNA 作用于宿主细胞；另一方面
宿主内源性 miRNA 在病毒生活周期的调控中也发挥重要作用。 肝脏特异性 miR-122a 与丙型肝炎病毒复
制息息相关，采用反义技术失活 miR-122a，丙型肝炎病毒 RNA 复制降低约 80%[4]。 乙型肝炎病毒（hepatitis
B virus，HBV）感染呈世界范围广泛流行，是危害人民健康和造成国民经济损失最严重的疾病之一，目前还
没有 HBV 编码 microRNA 的报道。 应用 microRNA 芯片发现，稳定表达 HBV 基因组的 HepG2215 细胞系和
瞬时转染 1.3 倍 HBV 基因组 HepG2 细胞系中 microRNA 表达谱较空白对照 HepG2 细胞系发生明显变化。
这一结果提示，HBV 可能通过调控宿主 microRNA 而改变宿主细胞内环境和抑制免疫应答，使其更适合病
毒的生存；反之受到调控的内源性 miRNA 可能具有抗 HBV 感染的。 应用 TargetScan 和 PicTar 软件对这些
差异表达 microRNA 进行靶点预测时发现，microRNA 的靶基因多数为与细胞增殖信号通路蛋白有关 。 因
此，为了进一步研究乙肝病毒致病机理，构建 microRNA 真核表达质粒成为首要任务。
目前，对于 microRNA 功能研究主要通过真核表达载体、体外转录以及直接合成 3 种方法为主。 由于
RNA 本身容易收 RNA 酶污染而降解，合成价格昂贵、使用次数有限，使得后两种方法的应用有限，而采用
真核表达载体，却有独特的优势。
首先，构建的 microRNA122 真核表达载体转染到 HEPG2 细胞 ，该细胞本身低表达 microRNA122[1]，转
染进的 microRNA122 前体能被宿主细胞 Dicer 酶切割，成为成熟的 microRNA122，本试验为构建 microRNA
表达载体提出新的思路与方法。 其次，构建的质粒转染入细胞后可整合到细胞基因组中，稳定表达。 再次，
最新采用 CMV 启动子并与绿色荧光蛋白融合表达， 绿色荧光蛋白的表达可以间接反应 microRNA 表达情
况，并可以衡量质粒导入细胞过程中的转染效率以及表达情况。 此外，特殊的茎环状引物增加了 microRNA
的逆转录产物的长度，使其可以应用普通 PCR 检测，并通过 TA 克隆得到证实。真核表达方法操作简单，不
图 4 RT 产物 PCR 图 图5 T-A 克隆 microRNA 电泳图
RT-PCR 产物约 60bp；2，3 的电泳上样量分别
为 1μl 和 5μl；1：50bpDNA ladder Marker
1：340bp 阳性 TA 克隆；2：280bp 阴性对照；
3：50bp DNA ladder Marker
（下转第 151页）
146
2008年第 6期
（上接第 146页）
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
会产生 RNase 污染问题
综上，最新采用融合绿色荧光蛋白表达 miRNA 以及 RT-PCR 的检测等方法，为 microRNA 功能研究提
供了良好的技术平台。
参考文献
1 Chen CZ，et al.Science，2004，303：83~86.
2 Ambros V.Nature，2004，431：350~355.
3 Lim LP，et al.Nature，2005，433：769~773.
4 Lecellier CH，et al.Science，2005，308：557~560.
为了药物蛋白的进一步研究，对蛋白纯化路线进行了摸索。研究中发现在超滤过程中蛋白损失主要发
生在超滤初期，而且随着总超滤体积的增加蛋白的总回收率呈增加趋势，分析得出超滤膜对蛋白的吸附是
蛋白损失的主要原因。 为了减少超滤膜对目标蛋白的吸附，可先以白蛋白对膜进行饱和处理。 因超滤浓缩
后的发酵液中仍然含有较多色素，使得 Q-Sepharose 离子交换过程中蛋白的吸附量大大降低，如何有效去
除色素提高分离效率是今后研究的一个重点。 经超滤和 Q-Sepharose 两步分离得到纯度为 90%左右的蛋
白，通过进一步的条件优化有望得到符合临床要求的高纯度药用蛋白。 为了进一步的药代研究，需获得放
射化学纯度达 95%的高纯蛋白，采用 Sephacryl S-200 对蛋白进行了精细分离。 研究中发现该步分离能有效
去除 2 个大于目标蛋白分子量的杂蛋白，最终测定得放射化学纯度达 97%，符合药代动力学研究需要。
纯化后的 rh（GLP-1A2G）2-HSA 活性测定结果表明，rh（GLP-1A2G）2-HSA 具有天然 GLP-1 的促胰岛 β 细胞
增殖活性，说明试验中分子设计符合理论预测，在整个分离纯化过程中蛋白的活性得到了较好的保护，为
进一步研究和开发能够用于糖尿病临床治疗的长效 GLP-1 类似物奠定了基础。
参考文献
1 Lucas LH，Price KE，Larive CK．J Am Chem Soc，2004，126（43）：14258～14266.
2 Gallwitz B，Witt M，Paetzold G，Morys-Wortmann C，et al. Eur J Biochem，1994，225（3）: 1151～1156.
3 Kwon G，et al.J Biol Chem，2004，279（10）: 8938～8945.
4 Li Y，et al.J Biol Chem，2003，278（1）: 471～478.
5 姚艳丽，冯凭.生命的化学，2005，25（4）:316～317.
6 Ruiz-Grande C，Alarcon C，Alcantara A，et al. Horm Metab Res，1993，25:612~616.
7 戚楠，马清钧.中国生物工程杂志，2006，26（2）:79～8 .
8 陈家琪，高智慧，等.微生物学通报，2007，34（5）:871～874.
9 雷楗勇，张莲芬，等.中国生物工程杂志，2006，26（7）：13～18.
陈其亮等：重组胰高糖素样肽-1融合蛋白的纯化及其活性测定 151