全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
大肠杆菌乙酸产生及其控制研究
张晓云 1 叶勤 2
(1江苏大学食品与生物工程学院 ,镇江 212013; 2华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室 ,上海 200237)
　　摘 　要 : 　大肠杆菌表达系统具有许多优点 ,是表达外源基因常用的宿主菌 ,然而在培养过程中易发生副产物乙酸的生
成和积累 ,造成碳源浪费 ,且会抑制菌体生长及外源基因的表达 ,影响了大肠杆菌的生产能力。介绍了大肠杆菌乙酸产生的
原因 ,分析了乙酸的抑制作用及其机理 ,并探讨控制乙酸生成和减少乙酸抑制的方法 ,为利用大肠杆菌生产重组蛋白提供过
程控制的参考依据。
关键词 : 　大肠杆菌 乙酸产生 抑制 控制
Study on Aceta te Production and Its Controlling in Escherich ia coli
Zhang Xiaoyun1 Ye Q in2
(1 School of Food and B ioengineering, J iangsu University, Zhenjiang 212013;
2 S tate Key Laboratory of B ioreactor Engineering, East China University of Science and Technology, Shanghai 200237)
　　Abs trac t: 　Escherichia coli is a widely used host strain for recombinant p rotein p roduction. But a significant portion of the metabolic
flux is channeled to acetate, a undesired p roduct. In ddition to a loss of carbon, acetate can inhibit cell growth and is detrimental to recom2
binant p rotein p roduction. The mechanism of p roduction, inhibition, and techniques of lessening accumulation and inhibition of acetate were
discussed in this paper,which would p rovide favored references for p rocess control of recombinant p rotein p roduction by E. coli.
Key wo rds: 　Escherichia coli Acetate p roduction Inhibition Controlling
收稿日期 : 2009205219
作者简介 :张晓云 (19752) ,女 ,山东莱西市人 ,博士 ,讲师 ,研究方向 :食品生物技术 ; E2mail: sdxyugu@yahoo. com. cn
　　大肠杆菌 ( Esherich ia coli)具有生长快、遗传背
景清楚、技术操作相对简单、大规模发酵成本低等优
点 ,是表达外源基因应用最广泛的宿主菌之一 ,已用
于许多具有重要药用价值的蛋白如胰岛素 [ 1 ]、生长
激素 [ 2 ]、干扰素、白介素、集落刺激因子、人血清白
蛋白 [ 3 ]及一些酶类 [ 4 ]等的生产。但是大肠杆菌在
以葡萄糖作为碳源表达外源蛋白时 ,会有很大一部
分碳源流向乙酸生成途径。当乙酸累积到一定浓度
时 ,菌体比生长速率迅速下降 ,产物合成降低 [ 5, 6 ] ,并
形成恶性循环 ,同时外源基因表达也受到严重影响。
为了解决这个问题 ,针对大肠杆菌乙酸的产生和抑
制、控制大肠杆菌乙酸的产生或减少乙酸的抑制作
用 ,国内外进行了大量的研究。但到目前为止 ,对大
肠杆菌乙酸产生机理仍然没有完全明确。
1 乙酸产生的机理
1. 1 乙酸的产生
乙酸的产生是一种代谢溢流现象。在好氧条件
下 ,主要有两条产生途径 :一条是丙酮酸在丙酮酸氧
化酶作用下生成乙酸 ( PoxB途径 ) ;另一条主要途径
是丙酮酸首先通过丙酮酸脱氢酶系的作用产生乙酰
CoA ,再由磷酸转乙酰酶 ( Pta)和乙酸激酶 (Ack)催
化生成乙酸。厌氧条件下 ,丙酮酸在丙酮酸甲酸裂
解酶 ( Pfl)作用下形成乙酰 CoA 和甲酸 ,再由乙酰
CoA经 PTA2ACK途径生成乙酸。
D ittrich等 [ 7 ]对肠杆菌 MG1655的 Pta2Ack缺陷
株 CD61和 PoxB 缺陷菌株 CD58的 AckA 和 PoxB
酶活测定结果表明 , Pta2Ack途径主要在对数期起作
用 ,而 PoxB途径主要在对数后期和静止期导致乙酸
产生。无论在好氧还是厌氧条件下 , Pta2Ack途径在
指数生长期对碳源的平衡都起着非常重要的作
用 [ 8 ]。而丙酮酸氧化酶在指数后期和静止期活性
较高 ,可能参与维持游离 CoA代谢库的平衡 [ 9 ]。
1. 2 乙酸产生的机理推断
对于大肠杆菌乙酸的产生 ,目前主要有 3种不
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2009年第 10期 张晓云等 :大肠杆菌乙酸产生及其控制研究
同的推断。
1. 2. 1　乙酸的形成是由于通过呼吸链和氧化磷酸
化的电子传递受到限制 氧的比消耗速率与葡萄糖
的比吸收速率之间的这种关系与酵母连续发酵相
似 ,酵母产生乙醇是由于限制性的呼吸能力。与此
相似 ,大肠杆菌乙酸的形成也是由于限制性呼吸能
力的结果。Reiling等 [ 10 ]发现在产乙酸临界稀释率
时氧的比消耗速率达到其最大值 ,超过临界稀释率
时 ,仍然保持在这一水平上。高稀释率或高葡萄糖
浓度抑制 TCA 循环和电子传递系统相关酶的活
性 [ 11 ] ,而导致细胞内出现高浓度 NADH, NADH的
积累使碳流向乙酸形成分支途径 [ 12 ]。
1. 2. 2　乙酸的形成与三羧酸循环 ( TCA )的有限能
力有关 在低的生长速率时 , TCA循环可满足合成
和分解代谢的需求 ,然而在高的生长速率时 ,这两者
的需求将超过细胞本身所具有的 TCA 循环能力。
Han等 [ 13 ]认为大肠杆菌在这样的条件下将由 TCA
循环和乙酸形成代谢共同满足代谢的能量需求。
1. 2. 3　乙酸的形成与有限的 TCA循环能力和有限
的电子传递系统的能力有关 据 Majewski[ 14 ]的分
析 ,有限的 TCA循环能力启动乙酸的产生 ,而有限
的呼吸能力在接近最大比生长速率时影响乙酸的形
成。大肠杆菌选择乙酸形成途径作为好氧时能量的
来源 ,是因为该途径能够产生第二大量的 ATP。
2 乙酸的抑制机理
2. 1 乙酸的抑制作用
乙酸积累至一定浓度时会抑制菌体生长。随着
乙酸浓度在培养基中的增加 ,菌体比生长速率迅速
下降 ,并形成恶性循环 ,进一步加剧乙酸积累 ,同时
外源基因表达也受到严重影响。在 SD27培养基中添
加不同浓度乙酸钠的摇瓶培养试验发现 ,大肠杆菌
JM105、重组菌 JM105 (pOS4201)和乙酸激酶突变株
JRG1061受乙酸抑制程度类似 ,比生长速率均随乙酸
钠浓度的增加而呈对数趋势下降 [ 5 ]。例如 ,杜鹏 [ 15 ]
利用乙酸过滤耦合发酵大肠杆菌 W3110 (pEC901)生
产干扰素 ,当乙酸浓度达到 1. 52 g/L时菌体生长和
干扰素的表达都受到抑制。
2. 2 乙酸的抑制机理
乙酸 (盐 )的抑制机理通常认为是其破坏了跨
膜质子梯度 ,而跨膜质子梯度是氧化磷酸化和其它
需能跨膜运输所必需的。质子化的乙酸具有弱亲脂
性 ,能够穿过细胞膜 ,充当质子推动力 , (尤其是
ΔpH) ,去偶联剂的角色 [ 5, 16 ]。乙酸 (盐 )在中性 pH
环境中以离子化 ( CH3 COO - ) 和质子化 ( CH3
COOH)两种形式存在 ,质子化的乙酸可以穿过细胞
质膜进人胞内 ,在胞内 (pH7. 5)解离成 CH3 COO - 和
H + 。结果引起电中性的净 H +内流 ,降低了胞内的
pH值。由于具有缓冲能力的培养基体积比细胞体
积大得多 ,乙酸的这种渗透作用不会导致胞外 pH
发生剧烈变化 ,从而引起解偶联效应。而大肠杆菌
自身具有平衡机制 ,即使质子推动力没有发生改变 ,
也需要消耗 ATP将 H +泵到胞外来调节这种胞内
pH值的降低 [ 17 ] ,因此扰乱了细胞的正常代谢和生
理活性。所以细胞要快速生长不仅需要大的质子推
动力 ,还需要维持合适的胞内 pH值。
不过 Russell等 [ 18, 19 ]认为 ,虽然分子态乙酸可以
穿过细胞膜并随后在胞内水解 ,但是由此而导致质子
推动力降低的幅度很小。当牛链球菌在含有 100 mM
乙酸的低 pH环境中生长时 ,不管胞外 pH如何 ,跨膜
pH梯度是相对稳定的。而阴离子的积累作为跨膜
pH梯度的响应 ,最终导致胞内乙酸根离子浓度将达
到 5 M。所以他又提出了乙酸抑制影响主要是由于
细胞内阴离子 (CH3 COO - )的积累观点。
而 Roe等 [ 20 ]则认为乙酸抑制生长不仅是由于
细胞内质子的释放 ,同时阴离子积累对细胞内阴离
子的平衡产生了重要的影响 ,生长抑制是这些影响
共同作用综合的结果。但 Axe等 [ 21 ]利用核磁共振
(NMR)技术测定细胞内外的乙酸及乳酸的浓度 ,进
一步为乙酸等弱酸是质子推动力 2能量生成解偶联
剂的假说提供了证据 ,认为可排除阴离子积累与破
坏跨膜质子梯度的联合影响。
此外 ,有报道短链脂肪酸对 DNA、RNA、蛋白
质、脂质和肽聚糖等大分子物质的合成均有抑制作
用 [ 22 ] ,从而进一步影响菌体生长和外源蛋白生产。
3 控制乙酸生成和减少乙酸抑制的方法
3. 1 培养基的优化
大肠杆菌在培养的过程中乙酸的形成与培养基
的成分密切相关 ,特别是碳源的种类和含量。葡萄
糖作为碳源 ,其吸收速率远远大于其他碳源 ,代谢失
衡极易发生。如果以甘油作为碳源 ,细胞吸收甘油
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 10期
的速率较低 ,进入糖酵解的碳流下降 ,可以显著降低
乙酸产量或者不产生乙酸 ,相对容易实现高密度培
养 [ 6 ] ,但甘油的生成成本比葡萄糖高、菌体生长慢。
无机盐浓度对乙酸的产生也有影响。研究发现在基
本培养基中添加 Fe2 +和 Fe3 +使大肠杆菌 DH5α生
长改善 ,单位菌体乙酸生产降低 ,其耐乙酸突变株
DA19的乙酸产量减少 [ 23 ]。Lee[ 24 ]发现氮源不足
时 ,大肠杆菌生长受限制 ,而葡萄糖仍被消耗 ,结果
乙酸生成大大增加。因此大肠杆菌高密度培养时必
须注意培养基各成分之间的平衡 ,包括碳源和氮源
及微量元素等 ,以保证细胞既快速生长 ,又避免由于
副产物生成而受抑制。
3. 2 过程控制
大肠杆菌的代谢与环境存在着密切的关系 ,在
长期的进化过程中 ,逐渐形成了多种可适应一定环
境的代谢调控机制 ,因此 ,通过发酵过程控制可对细
胞代谢有效地进行调控 ,降低乙酸生成量 ,使代谢朝
着更有利的方向进行 ,以达到提高发酵水平的目的。
3. 2. 1控制补料 葡萄糖作为碳源广泛应用于大肠
杆菌的培养 ,但糖浓度高时乙酸积累往往很严重 ,导
致外源基因表达效率下降。因此以葡萄糖为碳源培
养重组大肠杆菌时要使其浓度控制在低水平以减少
乙酸的生成。目前大多数高密度发酵均采取了限制
流加葡萄糖的方法 ,各种流加策略制定的原则是以
控制乙酸生成为前提。Shiloach[ 25 ]采用低糖浓度先
分批培养再补料培养重组大肠杆菌 BL21 (pVC45)
和 JM109 (pBR322) ,两菌株产酸量比高糖分批培养
减少了 1倍多。
3. 2. 2　控制溶氧 (DO ) 大肠杆菌好气培养时 ,氧
气分子是电子传递最终受体。发酵初期细胞浓度较
低 ,要控制补料速率以防止代谢溢流的发生。随着
细胞生长补料速率增大 ,氧消耗也增加 ,而反应器供
氧能力存在极限 ,容易发生供氧不足 ,而缺氧时乙酸
积累迅速增加 [ 24 ]。葡萄糖耗竭时 DO会突然跳升 ,
可以此指示葡萄糖间歇流加 ,控制溶氧在非限制水
平。Konstantinov[ 26 ] 采用平衡恒溶氧法 (Balanced
DO2stat)培养重组大肠杆菌 AT2471 ( p sY130214 ) ,
整个培养过程中乙酸浓度几乎保持在零 ,最终细胞
浓度达 36 g/L ,苯丙氨酸产量达 24 g/L,而乙酸积累
严重时苯丙氨酸产量仅为 8 g /L。
3. 2. 3　控制 pH pH也会影响大肠杆菌乙酸分泌。
以大肠杆菌作为宿主菌表达外源基因时 ,由于菌株
和产物之间存在差异性 ,需探索合适的 pH值 ,从而
在一定程度上减少乙酸生成。Kleman等 [ 27 ]高密度
培养大肠杆菌 W 3100时发现 , pH控制在 6. 0和 6. 5
时 ,积累的乙酸为 6 g/L ,而在 7. 5时高达 12 g/L。
3. 3 代谢工程方法
通过切断细胞代谢网络中乙酸的产生途径来减
少乙酸的生物合成是降低乙酸产生最直接的手段。
已知大肠杆菌产生乙酸的途径主要有两条 :丙酮酸
氧化酶 ( PoxB)途径和磷酸转乙酰酶 2乙酸激酶 ( Pta2
AckA)途径。因此应用代谢工程方法控制乙酸的生
成 ,首先是选育这两条途径缺失的菌株。D ittrich
等 [ 7 ]发现大肠杆菌 MG1655的 Pta2Ack缺陷株 CD61
在对数期几乎不积累乙酸 ,但有大量丙酮酸积累 ;而
PoxB缺陷菌株 CD58 对数期的乙酸积累类似于
MG1655,到静止期则开始消耗乙酸。
另外 ,还可以利用代谢工程方法对代谢途径进
行修饰 ,重新调节碳代谢流 ,将乙酸生成的碳流转向
其它无害或毒性小的代谢物 ,如乙醇、丙酮等 ,可以
减少乙酸的产生。
3. 4　发酵与分离耦合
在发酵生产的过程中 ,为了提高生产效率 ,可以
采取适当的措施及时除去发酵液中的产物或有害副
产物。透析培养是常用的方法之一。杜鹏等 [ 15 ]利
用中空纤维过滤器进行了耦合乙酸分离的干扰素发
酵研究 ,使干扰素活力提高了 3. 2倍。发酵与分离
耦合并未影响到乙酸分泌 ,且相当数量的葡萄糖转
化为乙酸而浪费了。此外 ,透析培养由于透析材料
的较高价格和实际操作存在难度 ,所以不适合工业
上大规模应用。
3. 5 耐乙酸突变株的选育
控制流加葡萄糖是发酵控制乙酸积累的最有效
的方法。但在大规模发酵中 ,特别是大型发酵罐 ,如
果加入的高浓度葡萄糖不能及时混和 ,局部地区葡
萄糖浓度过高会引起乙酸积累。而且利用大肠杆菌
表达外源蛋白通常需要较高的比生长速率以获得高
的表达水平 ,同时乙酸产量也大为增加。因此利用
耐乙酸突变株可以大大改善外源蛋白表达时乙酸的
抑制情况。
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2009年第 10期 张晓云等 :大肠杆菌乙酸产生及其控制研究
李志敏和朱才庆 [ 28, 29 ]采用 60 Co诱变及存在乙
酸钠为选择性压力的连续培养方法富集耐乙酸菌
株 ,已获得了大肠杆菌 JM109的耐乙酸突变株 JL3
和 DH5α的耐乙酸菌株 DA19和 DB15等菌株。突
变菌不仅耐乙酸性能提高 ,在相同培养条件下乙酸
的产量也降低。
4 总结
乙酸积累对细胞代谢造成的不利影响 ,是利用
大肠杆菌作为宿主菌表达外源蛋白的一个不可忽视
的问题。研究大肠杆菌乙酸产生及其控制 ,有助于
帮助人们采取有效措施解决大肠杆菌发酵过程中的
乙酸积累和抑制问题 ,提高产物产量 ,创造更高的经
济效益。
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