全 文 ：·综述与专论·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 6期
siRNA核糖分子化学修饰对 RNA i功能的影响
武文斌
(海军医学研究所 ,上海 200433)
　　摘 　要 : 　RNA干扰 (RNA i)是基于正常 RNA生理调节反应 ,主要由小干扰 RNA ( siRNA )引发的转录后基因沉默现象。
RNA i技术是基因功能研究的重要手段。目前困扰 siRNA进入临床的主要困难有 siRNA分子易降解、稳定性差、转运效率低、
存在靶外效应和免疫刺激反应等。 siRNA分子骨架中核糖化学修饰能够一定程度克服上述障碍 ,降低 siRNA给药剂量 ,减少
副作用 ,是 siRNA进入临床最可能的方式。对核糖分子常用位点尤其是 22′羟基化学修饰后 siRNA分子的药动学性状及 RNA i
功能做了分析。
关键词 : 　RNA干扰 　小干扰 RNA　化学修饰 　核糖
Effects of Chem ically2M odif ied Ribose in siRNA on RNA Interference
W u W enbin
( Institute of N avy M edicine, Shanghai 200433)
　　Abs trac t: 　RNA Interference (RNA i) has been recognized as a powerful tool to regulate gene function and has been used for se2
quence2specific, post2transcrip tional gene silencing by knocking down mRNA in mammalian cells1 The potential use of small interfering
RNA ( siRNA) as therapeutic agents has attracted great attention as a novel app roach for treating severe and chronic disease1 However,
the relatively high dose of siRNA required for gene silencing due to its instability, nuclease easily degradation and difficulty in delivery
lim its its therapeutic app lications1 This review discussed a ribose chem ically2modified strategy to imp rove therapeutic efficacy as well as
to abrogate off2target effects and immunostimulation caused by siRNA s1 These kinds of design in siRNA molecules has successfully im2
p roved their physicochem ical and pharmaceutical p roperties and shown great expectation to overcome the barriers to RNA i2based thera2
p ies1
Key wo rds: 　RNA Interference (RNA i) 　Small interfering RNA ( siRNA) 　Chem ically2modified　R ibose
收稿日期 : 2008212225
作者简介 :武文斌 (19732) ,男 ,助理研究员 ,博士 ,研究方向 :分子流行病学 ; E2mail: wuwenbin_smmu@1261com　　RNA干扰 ( RNA interference, RNA i)主要是由一类小干扰 RNA分子 ( small interfering RNA, siR2NA)引发的转录后基因沉默现象 ,是基于双链 siR2NA反义链又称引导链介导的 R ISC ( RNA2inducedsilencing comp lex, R ISC)对靶 mRNA的特异酶降解反应。 siRNA可以化学合成或酶转录获得 ,较长的双股 RNA ( dsRNA )在胞质 RNase Ⅲ族核酸内切酶D icer作用下断裂成 21～23 nt的 siRNA, 3′2羟基端有两个核苷酸的突出 , 5′为磷酸末端 ,中间为 19 nt的互补双链区。 siRNA分子与 R ISC结合后 ,在解旋酶的作用下双链分开 ,负链引导 R ISC与靶 mRNA的互补区结合。双链复合物在 Ago2蛋白作用下在相当于反义 RNA 5′端第 10与第 11位碱基之间发 生磷酸二酯键的断裂 ,从而实现了 siRNA分子介导的特异性靶 mRNA基因沉默。RNA i广泛存在于生物体内 ,是生命基因表达和生长发育的重要调控手段 ,对基因功能研究和基因治疗药物开发有着重要的应用价值 [ 1 ]。1　siRNA药物转化的障碍RNA i作为基因治疗药物的性能优势表现在其沉默靶基因的序列特异性和降解反应的级联扩大性。但目前制约 siRNA s进入临床的最主要困难在于药物递送 ,具体表现在分子稳定性差 ,体内分布广泛 ,细胞摄取困难 ,使用剂量大 ,靶向性差 ,存在靶外基因沉默现象和免疫刺激等。例如 ,裸 siRNA容易受到细胞内外环境 RNase 降解 ,其半衰期不足 30
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2009年第 6期 武文斌 : siRNA核糖分子化学修饰对 RNA i功能的影响
m in; siRNA分子量约为 16 kD,低于肾滤过阈值 (约
为 60 kD) ,肾脏对 siRNA清除导致其血浆浓度快速
降低 ; siRNA双链骨架结构中磷酸富含负电荷亲水
基团 ,致使细胞膜对裸 siRNA 难以摄取 ;裸 siRNA
对转入细胞没有选择性 ,靶向性的缺乏是 siRNA出
现靶外基因干扰 (off target)效应的重要原因之一 ,
补偿性大剂量给药又会加重细胞毒性反应 ; dsRNA
可诱发哺乳动物天然免疫反应 ,产生干扰素样副作
用 ,导致细胞蛋白合成减少 ,严重者可导致细胞和试
验动物死亡 [ 2 ]。
2　siRNA体内使用策略
siRNA体内使用的关键技术在于转染 ,主要包
括病毒基因治疗载体表达和非病毒载体携带两种方
式。后者包括阳性脂质体、多聚复合物、靶向性纳米
颗粒等 ,多种转染媒介结合使用可以提高转运效率。
siRNA的治疗作用取决于其在血清中的稳定性 ,虽
然双链 siRNA分子的稳定性优于单链 ,但在 RNase
的作用下数小时内还会被降解殆尽。在保持 RNA i
活性不变的前提下 ,对 siRNA分子进行某种化学基
团修饰 ,可以使其具有良好的热力学稳定性、细胞穿
透力、靶基因沉默活性以及药物代谢学特征。 siR2
NA化学修饰不借助外部载体 ,只形成纯粹的单体
分子 ,从这一角度看它更符合临床给药要求。目前
siRNA的化学修饰主要集中在以下几个方面 : ( 1 )
磷酸骨架修饰主要为硫代修饰 ,即用一个硫原子取
代磷酸二酯键的非桥氧原子 ,以提高 siRNA分子的
抗 RNase降解能力 ,增加其稳定性。 ( 2)碱基修饰
是利用 5′溴 (碘 ) 2尿嘧啶取代尿嘧啶可以提高与靶
mRNA的相互作用 ,增加 R ISC对后者的识别和剪
切。 (3)末端修饰是 siRNA 3′或 5′端化学耦联胆固
醇或者细胞穿透肽 ( cell penetrating pep tide, CPP)能
够提高 pep2siRNA的细胞选择性和穿透力。 ( 4)核
糖修饰主要是 2′2OH (羟基 )和 4′2O的化学基置换、
加长等 ,是 siRNA化学修饰最主要的方式 [ 3 ]。
3　核糖 2′2O H化学修饰对 RNA i的影响
311　提高 siRNA稳定性
对 siRNA分子最重要的修饰是对核苷酸戊糖
2′位的改变。 siRNA 分子体内降解主要是由于
RNase的酶催化水解 , 3′磷酯键断开 ,与 2′2OH形成
环状磷酸二酯 ,最终在碱的作用下形成水解产物。
核糖 2′位的修饰虽然多种多样 ,但目的都是为了提
高 siRNA分子 RNase抗性 ,提高细胞内外稳定性 ,
增加正电荷量 ,增加亲脂性 ,引入靶向性 ,改变 R ISC
末端偏嗜性等方面 [ 4 ]。
由于 siRNA富含磷酸基团 ,其负电荷总数约为
40。正电荷基团修饰 2′2OH 不仅可以增强 siRNA
稳定性 ,还可以中和核酸分子自身的负电荷 ,提高对
细胞膜的黏附 ,增加 siRNA的细胞摄取量。Odadz2
ic[ 5 ]证实 2′2O2氨乙基 (正电荷 )、2′2O2胍基乙基 (正
电荷 )和 2′2O2氰乙基 (电中性 )修饰 siRNA 5′端后
其稳定性增高 ,三者修饰 12 mer siRNA 分子 △Tm
值分别升高 110℃、311℃和 019℃。21 mer siRNA
血清半衰期延长 ,分别为 63 m in、61 m in和 58 m in,
未修饰 siRNA为 30 m in,即正电荷较电中性修饰分
子更稳定。
Chiu[ 6 ]发现 2′2OH不是 siRNA发挥作用的必须
基团 ,对 siRNA单链或双链的 2′2OH化学修饰都不
会明显影响其基因沉默效应 ,而且反义链 5′端修饰
对 RNA i效果明显好于 3′端。研究认为 2′2OH化学
修饰除了通过增强 RNase抵抗力发挥作用 ,还应具
有其它的催化反应机制。
312　提高 RNA i活性
2′2OH修饰 siRNA双链分子的 RNA i效果在体
外细胞试验和体内动物模型中均得到了验证。
A llerson[ 7 ]的研究证实 ,将 siRNA 一条链全部进行
2′2氧甲醛 (OMe)和 2′2氟 ( F)置换可以增强其在血
清中的稳定性 ,并能够提体外 RNA i活性 ,单一位点
修饰后的 siRNA的干扰效果较之未修饰者高出 500
倍。Prakash[ 8 ]在 Hela细胞体外 RNA i研究中以磷
酸酯酶和强力蛋白同系物 PTEN为靶基因 ,发现 2′2
O2Me不同位置修饰反义链后的 RNA i变化较大 , 5′
端修饰后 RNA i能力不如 3′修饰 , 2′2F修饰位置对
RNA i效果的改变通常不明显 ,而 2′2O2MOE (甲氧乙
基 )在反义链的任何位置修饰都会使 RNA i显著降
低。同时 2′2O2Me和 2′2O2MOE对正义链的修饰后
的 RNA i与位置关联不大。Morrissey[ 9 ]将 2′2H (脱
氧 )、2′2F、和 2′2O2Me同时引入 siRNA分子反义链
5′端 ,当有 1～3个碱基修饰后 , RNA i能力提高 5
倍 ,成功地抑制了小鼠体内 HBV mRNA水平 ,而未
经修饰的 siRNA 没能显示出任何基因沉默作用。
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 6期
此外 , siRNA是典型的极性分子 ,脂溶性差 ,具有极
强的亲水性和水合作用 ,对胞膜脂质双分子层亲和
力差。L iao[ 10 ]在对胰岛素样受体进行基因干扰时
发现 2′2O22, 42二硝基苯修饰不仅可以提高 siRNA
的稳定性 ,还因为修饰基团的亲脂性进而提高 siR2
NA胞膜穿透力 ,增强 RNA i效果。Odadzic[ 5 ]针对
EGFP沉默实验表明修饰 siRNA 较未修饰或错配
siRNA具有更强的 RNA i活性。
R ISC与 RNA结合的选择性除了与 5′端磷酸有
关外 ,还与 siRNA 分子的热力学不对称性密不可
分。正义链 3′端和 /或反义链 5′端的化学修饰可以
引起该部位的解链温度低于另一侧 ,易于 R ISC对
siRNA分子双链中 △G较低的一侧选择性结合 ,这
一定程度上解释了化学修饰为何可以提高 RNA i效
果。Schwarz[ 11 ]利用 siRNA的两条链分别对应两种
报告基因 ,通过对两基因的 RNA i测定 ,计算 R ISC
与 siRNA两条链的结合率 ,证实 R ISC更容易与 5′
端碱基互补结合力低的一条 RNA分子结合。这种
R ISC对 siRNA链的选择性通过末端一个碱基的变
化就可以发生转向。因此反义链 5′端或正义链 3′
端的化学修饰一定程度上取决于修饰基团大小和电
荷数改变热力学溶链温度 ( Tm值 ) ,影响 R ISC对反
义链选择 ,增强 RNA i效果。
313　降低 siRNA副反应
RNA i的靶外效应也制约着 siRNA 的临床使
用 ,约有 1 /3的 siRNA存在靶外效应 ,造成培养细胞
活力下降甚至中毒。通常认为 siRNA 分子中至少
有 11个碱基与靶基因一致 ,靶外效应才可能降低。
进一步研究发现 ,反义链 5′端的 2～8 nt区域 ( see2
ding region)毗邻 10 nt与 11 nt的 Ago2剪切位点 ,决
定着 siRNA的特异性。如果该区域存在 6～7个与
靶外基因相同碱基 ,就可能产生靶外基因沉默效应。
除 siRNA分子自身的因素外 ,转染试剂也可以产生
靶外效应。Jackson[ 12 ]发现在反义链 seeding region
第 2位碱基进行 2′2O2Me修饰后 ,在保持 RNA i效应
的同时 ,靶外基因沉默现象明显减少。与通常在
seeding region进行多个位点碱基替换以降低靶外沉
默效应不同的是 ,只在该区第 1或 2位碱基上进行
2′2O2Me修饰就能够抑制靶外基因沉默的发生。此
外 ,在 seeding region借碱基置换避免靶外基因沉默
的办法往往却带来另外的靶外基因沉默 [ 13 ]。
2′2OH修饰不仅可以提高 siRNA的稳定性 ,减
少使用剂量 ,降低靶外效应和细胞毒性 ,还能够减少
siRNA免疫刺激作用。 siRNA能够通过双链中的特
殊结构引发免疫刺激反应 ,即控制 dsRNA在 30 nt
以内 ,免疫刺激反应可以减少 ,但一些特定的 RNA
序列仍可以产生炎性因子和 Ⅰ型干扰素反应。长
dsRNA可以通过与 dsRNA激活蛋白激酶或 Toll样
受体 ( TLR s)作用 ,诱发干扰素反应。研究证实 siR2
NA特异序列 ,如 5′2GUCCUUCAA23′通过识别树突
状细胞 TLR27引发免疫反应。类似的序列还包括
富含 GU的片段和 CpG片段 [ 14～16 ]。2′修饰可以减
少 siRNA的免疫刺激作用 , Judge[ 17 ]证实 2′修饰尿
嘧啶 TLR27刺激序列在没有影响 RNA i活性的前提
下 ,免疫刺激反应明显降低。 Prakash[ 7 ]也证实 2′2F
与 2′2O2Me修饰还降低了免疫刺激反应强度。
Morrissey[ 8 ]证实 siRNA反义链 5′端修饰 2′2H、
2′2F、和 2′2O2Me后 ,在保持 RNA i的同时诱导细胞
因子等免疫刺激反应不再产生。在目前 siRNA 设
计在无法预见和筛选此类免疫刺激序列情况下 , 2′
化学修饰无疑是解决该问题最具希望的途径 [ 18 ]。
4　核糖其它化学修饰
锁状核酸 ( locked nucleic acid, LNA )通过 2′2O
和 4′2C之间的亚甲基桥联而成 ,由于它不影响 RNA
分子的立体结构且能够增强寡核苷酸的稳定性 ,因
此已在反义 RNA和核酶研究中使用。B raasch[ 19 ]将
其引进 siRNA领域 ,发现 LNA修饰 siRNA两端或中
间位点不仅提高了其稳定性 ,而且还不影响体外
RNA i活性。Elmén[ 20 ]发现 LNA修饰后的 siRNA血
清半衰期更长 ,更容易与 R ISC结合并提高其活性 ,
靶外基因沉默现象也明显地减少。
Hoshika[ 21 ]发现核糖 4′位 O2S置换后的 siRNA
具有更佳的热力学指标 ,其稳定性提高 600倍。虽
然全部 4′2S修饰使 siRNA分子丧失 RNA i作用 ,但
在 seeding region以外的碱基进行修饰却不影响影
响 siRNA的干扰效果。Dande[ 22 ]用右旋亚砜作为前
导物改良合成工艺后发现 , 4′2S修饰在提高 siRNA
稳定性的同时 ,修饰碱基在两链中的位置和数量都
可以产生不同程度的 RNA i效果。而要获得最大的
RNA i效果 ,修饰碱基数量、位置的选择和设计是必
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2009年第 6期 武文斌 : siRNA核糖分子化学修饰对 RNA i功能的影响
要的。将 4′2S修饰与 2′202Me和 2′2O2MOE联合使
用 ,可以获得更为稳定和更强的 RNA i效果。
5　结语
siRNA作为高效、特异的基因治疗手段 ,在临床
中具有巨大的反应前景。目前的困境在于体内稳定
性、靶向性、包膜穿透性均较差 ,副作用主要包括靶
外效应和免疫刺激反应。在目前无法完全达到 siR2
NA细胞或组织靶向性传递、免疫刺激序列鉴定以
及 siRNA文库特异的筛选方法建立之前 , siRNA药
物分子设计中核糖分子化学修饰尤其是 2′化学修
饰无疑是解决上述问题最可靠的途径。
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