全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
微生物耐铝机制的研究进展
王阁奇 年洪娟 陈丽梅
(昆明理工大学生物工程技术研究中心,昆明 650224)
摘 要: 铝毒是酸性土壤中限制作物生产最主要的因素。微生物与铝作用逐渐受到关注, 一些微生物特别是模式微生
物的耐铝机制已被提出。主要综述了酵母,假单胞菌及其它微生物耐铝机制的研究进展,并展望了微生物耐铝机制研究发展
的方向。
关键词: 微生物 酵母 假单胞菌 耐铝机制
Research Progress on Alum inum ToleranceM echanism ofM icroorganisms
W angGeqi N ian H ongjuan Chen L mi e i
(Biotechno logy Research Center, Kunm ing University of Science and T echnology, Kunming 650224)
Abstrac:t A lum inum tox icity in acidic so ils is the most im portant fac to rsw hich cou ld lim it crop production. G row ing attention has
been taken on interactions be tw een m icroo rganism s and alum inum. Severa l alum inum to lerance m echanism s of m icroorg an ism s have
been proposed recently, espec ially m ode lm icroorg an ism s. In th is paper, a lum inum to le rance m echan ism s o f the yeast, P seudom onas,
m yco rrh iza l fung i and o ther m icrobes w ere rev iew ed, and direc tions o f research and development on a lum inum to lerancem echan ism s of
m icroorg an ism s w ere also prospec ted.
Key words: M icroo rganism s Yeast P seudomonas A lum inum to le rance m echan ism
收稿日期: 20091130
基金项目: 973!计划项目 ( 2007CB 108901)
作者简介:王阁奇,男,硕士研究生,研究方向:植物代谢途径基因工程; Em ai:l w geq@i qq. com
通讯作者:陈丽梅,女,教授,博士生导师, Em ai:l chen lim eikm@ yahoo. com. cn
在 pH低于 4. 5的酸性土壤中, 铝主要以 A l3+
形态存在,这一形态的铝被认为是对植物毒性最强
的形态 [ 1]。铝毒被认为是酸性土壤中限制作物生
产最主要的因素。农业上通常靠施加大量的生石灰
来解除铝毒害,但成本高,环境污染严重, 且对深层
土壤的酸化没有实质性的改变。筛选和通过遗传改
良获得抗铝毒害能力较强的植物品种, 是解决酸性
土壤中铝毒害的高效途径之一 [ 2 ]。有关植物的铝
毒害问题研究比较多, 若干耐铝机制已被提出 [ 3]。
新近一些研究发现, 一些微生物对铝具有很高的
耐性 [ 4- 6] , 微生物由于其结构简单, 繁殖快, 遗传
操作便利等优点, 为深入研究耐铝机制提供了很
多便利。随着研究工作的深入, 有些微生物特别
是模式微生物的耐铝机制已先后被提出。主要综
述了酵母, 假单胞菌及其它微生物耐铝机制的研
究进展。
1 酵母耐铝机制的研究进展
1. 1 有机酸及其代谢产物对铝的螯合作用
这可能是在植物和微生物中广泛存在的一种抵
御铝毒害的生理调控机制。 Suzuk i等 [ 7]研究表明酿
酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae )在铝胁迫下分泌亮
氨酸生物合成中的一种中间产物 2异丙基苹果酸
( 2isopropylm alic acid, 2iPMA )。由于 2iPMA在培
养基中结合 A l3+ ,所以被认为可以减轻由 A l3+引起
的毒害。在低 pH和低浓度的磷和镁的培养基中研
究 2iPMA和苹果酸 ( malic ac id, MA)对铝毒害的影
响,结果显示, 酿酒酵母在 100 M A l3+胁迫条件下
生长受到抑制。1. 0 mM的 2iPMA要比 10mM的
MA能更加有效的缓解这种现象, 这说明 2iPMA有
较强的 A l3+螯合能力,从而阻止 A l3 +进入细胞达到
耐铝效果。MacD iarm id等 [ 8]将柠檬酸和苹果酸分
别添加到 LPM培养基上, 有效地缓解了 A l3+对酿酒
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
酵母细胞的毒害。
通过改变参与柠檬酸合成代谢途径中不同的酶
可以改变酿酒酵母对铝的耐受能力。柠檬酸合酶突
变酵母表现出柠檬酸积累和耐铝能力的下降, 然而
顺乌头酸酶突变体与异柠檬酸脱氢酶突变体则呈现
柠檬酸积累增加和耐铝能力提高。这是因为在
TCA循环的酶中柠檬酸合酶作用于柠檬酸的上游,
而顺乌头酸酶与异柠檬酸脱氢酶作用于柠檬酸的下
游。柠檬酸脱氢酶,柠檬酸合酶,顺乌头酸酶, 异柠
檬酸脱氢酶可能是柠檬酸代谢在耐铝中应用的潜在
遗传操作位点 [ 9]。
1. 2 抗氧化胁迫作用
Ezak i等 [ 10]分离了两个铝离子诱导表达的酿酒
酵母热击蛋白基因 ( heat shock prote in gene)H SP150
和细胞壁蛋白基因 SED1, 并分别对这两个基因的各
自缺陷型进行铝离子处理和氧化处理。结果表明,
SED1在铝离子胁迫时能起保护作用, HSP150则既
起到铝离子胁迫的保护作用,又起到氧化胁迫的保
护作用。
1. 3 抗细胞程序性死亡
最近有研究报道了在植物和动物细胞中铝诱导
的类似于细胞凋亡的细胞死亡。 Zhang等 [ 11]证明
酿酒酵母短时间暴露于低且有效浓度的铝中, 可以
通过剂量和细胞密度依赖的方式增强细胞分裂。在
高浓度的铝或延长暴露时间,铝诱导细胞死亡和生
长抑制。在铝处理过程中表现数个细胞凋亡特征,
包括细胞皱缩,液泡化,染色质边缘化,核断裂, DNA
降解, DNA链断裂, 同时伴随细胞聚集。酵母菌株
分别过表达抗细胞凋亡基因 ced9, bcl2和 PpBI1,
显示比对照细胞有更多的耐铝能力。从流式细胞术
研究的数据显示这 3个抗凋亡成员没有影响活性氧
物质水平,尽管细胞内的活性氧物质和钙离子水平
都增加,但是在铝胁迫应答中钙离子信号降低了。
随后在烟草中进一步证实了过量表达 ced9可以抑
制铝诱导的细胞程序性死亡,同时增强了烟草的耐
铝能力 [ 12]。这表明对程序性细胞死亡的负调控过
程的操作可能赋予了耐铝的新的机制。
1. 4 其它金属离子及通道蛋白的作用
M acD iarm id等 [ 13]研究表明过量表达酿酒酵母
中的 ALR1和 ALR2两个基因可以缓解 A l3 +对酵母
细胞的毒害。ALR基因编码 Mg2+通道蛋白,这是由
于 A l3+抑制了 ALR通道蛋白对 M g2 +的转运而引
起。已有研究表明在植物和酵母中, C a2+可以有效
地缓解铝毒害 [ 8]。K inra ide等 [ 14]证明了这种现象
主要是通过减少膜表面的负电荷,从而使 A l3+活性
下降。相反,研究发现 Ca2+对酵母中的铝毒害影响
较小。然而,相比较于那些用来分析植物中铝毒害
和阳离子缓解作用的培养基离子强度 (如 0. 42
mM ),酵母合成培养基中的离子强度相对较高, 总
的阳离子浓度为 47mM。尽管在试验中采用了较宽
的 Ca2+浓度 ( 02mM ), 培养基中较高的阳离子浓度
可能掩盖了钙离子对铝毒害的影响。如果 Ca2+对
缓解酵母中铝毒害不起作用是真实的,那么这可能
是由于植物和酵母细胞壁的离子结合能力有差异,
或质膜的表面电荷和组成不同。
2 假单胞菌耐铝机制
2. 1 应用抗氧化防御策略降低氧化损伤
S ingh等 [ 15]研究荧光假单胞菌 (P seudomonas f lu
orescens)在铝胁迫下细胞内活性氧物质的变化, 发现
O
-
2和 H2O2的含量都明显上升。虽然铝胁迫细胞的
氧化脂质和蛋白含量要高于对照细胞,但 NADPH产
量在这些铝胁迫细胞中也显著增加。异柠檬酸脱氢
酶和葡萄糖 6磷酸脱氢酶在耐铝微生物中过量表
达,并可以被铝、H 2O2或维生素 K调节,说明这些酶
在抑制由铝引起的氧化环境中起重要作用。在毫摩
尔量的铝胁迫下, 细胞中超氧化物歧化酶 SOD也会
上升,表明荧光假单胞菌应用一套抗氧化防御策略来
达到耐铝效应。
2. 2 积累和分泌有机酸螯合铝
2. 2. 1 草酸的作用 对荧光假单胞菌中有机酸及
其代谢途径在耐铝机制中的作用研究比较深入。
H amel等 [ 16]研究发现, 荧光假单胞菌主要以调节
TCA循环过程中的酶来对铝胁迫作出应答, 草酸在
这个过程中发挥关键作用。通过乙醛酸氧化途径产
生草酸,使参与 TCA循环的酶促反应需要大的重配
置。异柠檬酸裂解酶可将异柠檬酸裂解成乙醛酸和
琥珀酸,对乙醛酸的需求似乎增强了异柠檬酸裂解
酶的活性,它在铝胁迫的细胞中含量也增加了 4倍。
异柠檬酸脱氢酶与异柠檬酸裂解酶存在某种竞争关
系,它的活性在铝胁迫的条件下呈现下降趋势。在
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2010年第 4期 王阁奇等:微生物耐铝机制的研究进展
铝胁迫下的细胞对草酸的需求体现在降低了 酮
戊二酸脱氢酶复合体的活性,但柠檬酸合酶的活性
没有明显改变。因此铝胁迫的结果表现为, 为了产
生草酸合成的必须前体,从而调节 TCA循环中的各
种酶含量及其活性。H ame l[ 17 ]随后的研究表明, 荧
光假单胞菌中脱铝毒过程不仅有草酸的参与, 同时
包括磷脂酰乙醇胺的作用。草酸与磷脂酰乙醇胺分
别以与铝结合的形式排出体外,从而使荧光假单胞
菌达到耐铝的效应。
2. 2. 2 柠檬酸的作用 微生物系统被认为有精细
而复杂的内在代谢策略来应对众多的金属离子的毒
害影响。M ailloux等 [ 18]发现, 荧光假单胞菌在铝胁
迫下会产生一种新型的代谢网络途径来增强柠檬酸
的合成。在有苹果酸的环境生长, 则会引起一个独
特的代谢途径转换,促进了柠檬酸的合成来螯合铝。
电泳和分光光度测定显示, 几个苹果酸代谢的酶包
括苹果酸脱氢酶和苹果酸酶在铝处理细胞中的活性
和表达量都增加了。柠檬酸合酶活性上升伴随顺乌
头酸酶和 NAD异柠檬酸脱氢酶活性的下降似乎是
柠檬酸积累的最直接的手段。同时, HPLC分析结
果显示,在铝胁迫的培养物中有高浓度的柠檬酸。
因此, 在含铝丰富的环境可以引起荧光假单胞菌中
代谢途径的转换,促使苹果酸转换为柠檬酸。 de la
Fuente等 [ 19 ]证明在烟草和木瓜中过量表达铜绿假
单胞菌 (P seudom onas aerug inosa)中的柠檬酸合酶基
因,可增强转基因植物的耐铝能力,这也进一步论证
了柠檬酸在耐铝毒害中的作用。
2. 2. 3 其它代谢产物作用 荧光假单胞菌在铝胁
迫条件下会造成代谢转换, 目的是使草酰乙酸转向
可以螯合铝的物质 ( alum inophore)的生成 [ 20]。这个
代谢改变主要通过两个葡萄糖异生酶作用, 即丙酮
酸羧化酶 ( PC )和磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 ( PEP
CK)。PC在活性和表达量上显示明显的增加, PEP
CK则急剧的下降。苹果酸酶和 NAD激酶共同参与
维持一个还原的环境, 这两种酶在铝胁迫的细胞中
显著的增加。荧光假单胞菌通过对以上几种酶调节
从而表现出对铝胁迫的代谢适应, 目的是产生草酰
乙酸, 维持体内草酰乙酸的平衡 [ 20]。
3 其它微生物耐铝机制
温泉红藻 (Cyanidium caldarium )是一种单细胞
的红藻,能够耐受高达 200 mM A l3+ [ 21]。用透射电
子显微镜和能量色散型 X射线分析发现, 在含 200
mM A l
3+的培养基中培养的红藻细胞, 它的类囊体
内腔中有明显的物质改变, 而其它的细胞器基本不
受影响。在对照和铝处理的细胞中, 都发现了几个
球状的电子致密体在靠近细胞核附近的胞质中。在
对照细胞中有较高浓度的铁, 但免疫细胞化学和形
态学分析数据表明,这与铁积累物质如铁蛋白和肌
醇六磷酸的标准数据不符。此外, 在铝处理的细胞
内发现有铝。温泉红藻中这种电子致密体作为一种
新的铁储藏颗粒在正常的培养条件下用于储存铁,
在高浓度铝胁迫条件下则起隔离铝的作用 [ 21 ]。
Zhang等 [ 22]分离到一株耐铝微紫青霉菌 ( P eni
cillium janthineleum ) F13,该菌能在含 100 mM铝离
子的培养基中生长。试验结果表明菌丝体中的铝含
量很低,不足以导致培养基中的高铝含量的下降。
在 GM培养基上可以分泌柠檬酸,但是这个浓度 (通
过螯合 )还不足以减少介质中铝的含量至无毒水
平, 即大约为 1 mM (这个浓度为低的抗铝真菌所能
耐受的铝水平 )。尽管这两个现象都会减轻铝毒
害, 但菌丝体中总铝含量或胞外分泌有机酸导致的
铝浓度下降都离高浓度的铝 ( 100 mM )相差甚远。
因此,微紫青霉菌 F13能抗外部高浓度铝并不是由
于内在或外在对铝的隔离, 可能存在另外一种耐铝
机制。
4 展望
微生物耐铝机制是个复杂的生物学过程, 一种
微生物可能包含多种耐铝机制, 且不同种之间的耐
铝机制存在较大差异。随着分子生物学技术的发展
和应用,生物体耐铝的分子机理最终有可能通过研
究模式微生物的耐铝机制得以揭示。今后微生物耐
铝机制的研究重点将是耐铝基因表达调控, 铝信号
在胞内的传递系统等方面。随着研究的不断深入,
酵母等模式微生物在耐铝机制研究中将发挥巨大的
作用。
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