全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 9期
两株高 DNA拓扑异构酶 I抑制活性的药用
植物内生真菌筛选
杨国武 1 黄秀丽 1 赖心田 1 黄雅丽2 周世宁 3
( 1深圳市计量质量检测研究院,深圳 518131; 2广州中医药大学基础学院,广州 510006;
3中山大学生命科学学院,广州 510275)
摘 要: 从 7种中国南方药用植物中分离了 278株内生真菌,分析了其发酵液甲醇提取物对人 DNA拓扑异构酶 I( hTo
poI)松驰活性的抑制能力。对 2株具有高 hTopoI抑制力的内生真菌 ( LF47L和 LF61)进行了深入研究。通过发酵物对 hTo
poI抑制能力的时间变化曲线, 表明 2株内生真菌的 hTopo I抑制物质在其生长停滞阶段才大量产生和积累。经分子鉴定,
LF47L可能是阴炭团菌 (H ypoxy lon stygium ), 而与 LF61L最相近的是毛竹基腐病菌 ( A rthr in ium phaeo sp ermum )。
关键词: 药用植物 DNA拓扑异构酶 I 内生真菌
Screening of TwoM edicinal P lant Endophytic Fungi Strains
withH igh hTopoIinhibiting Activity
YangGuowu
1
HuangX iu li
1
La iX int ian
1
Huang Yali
2
Zhou Shin ing
3
(
1
Shenzhen A cademy of M etro logy and Quality Inspection, Shenzhen 518131;
2
Guangzhou University of ChineseM edicine, Guangzhou 510006;
3
Schoo l of L ife Sciences, Sun Yatsen University, Guangzhou 510275)
Abstrac:t Two hundred and seventye ight stra ins o f the endophytic fung i were iso la ted from seven med ic inal p lants in the South
Ch ina. The hTopo Iinhibiting activ ity of their ferm entation cu lture w ere investigated. Tw o stra ins w ith h igh hTopoI inhibiting activ ity,
LF47L and LF61, we re cho sen for further study. The tim e curves o f the TopoIinh ib iting activ ity production ind ica ted that the inh ib i
ting activ ity in the fe rmentation cultures o f both strains accumu lated dur ing lag phages of grow th. The two funga l stra ins w ere pre lim ina
rily identified respectively by sequence ana lys is o f ITS of 18S rDNA. LF47L is close toHypoxy lon styg ium, and LF61 ism ost sim ilar to
A rthr in ium phaeo sp ermum.
Key words: M edic inal plan ts H um an DNA topo isom erase I Endophytic fung i
收稿日期: 20100311
基金项目:国家高技术研究与发展计划 ( 863!计划 )项目 ( 2007AA09Z448 )
作者简介:杨国武,男,博士,高级工程师,主要从事工业生物与食品安全研究; Em ai:l yangguow u@ yahoo. com. cn
通讯作者:周世宁,教授,博士生导师, Em ai:l lsszs@l m ai.l sysu. edu. cn
真核生物 DNA topo isomerase I和 II是多种抗肿
瘤药物的重要靶位。同其它抗肿瘤药物一样, DNA
topo isomerase靶位药物使用一段时间后, 肿瘤细胞
会出现耐药性。因此, 寻找新的靶位明确的抗肿瘤
药物十分重要而紧迫。人 DNA拓扑异构酶 I( hTo
po I)在肿瘤的化疗中蛋白表达水平比较稳定, 其靶
位药物如喜树碱及类似物似乎不易被 Pgp170识别,
故 hTopo I靶位药物在临床上不易出现耐药性 [ 1 ]。
因此, 开发新的特别是结构新颖的 hTopo I靶位药物
具有十分重要的意义。
目前,以真核生物 DNA拓扑异构酶 I为靶位的
抗肿瘤药物母体结构多来自于植物。内生真菌存在
于植物健康组织, 与植物互惠共生。因在植物体内
长期存在与进化, 部分内生真菌形成了与其它真菌
不同的遗传与代谢方式, 可能产生与普通真菌不同
的代谢产物。目前发现一些有重要药用价值的植物
的有效成分, 是由其中的内生真菌所产生 [ 2, 3]。本
研究选用南方药用植物 (具有抗癌等功效 )分离内
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
生真菌,调查它们对 hTopo I的抑制能力, 以筛选出
具有高 hTopo I抑制活性的真菌菌株,并进行深入研
究,具有一定的实用价值。
1 材料与方法
11 材料
7种药用植物 (大果安息香、喜树、麻风树、海南
大风子、铁冬青、大青、美登木 )采于中国科学院华
南植物园。产生人 hTopo I的重组毕赤酵母 SMD
hTopo I ( out)为中山大学微生物实验室保存。
12 方法
121 样品采集 采集每种植物健康的茎与叶,分
开存放于密封袋中,带回实验室后 4∀ 冰箱保存,并
尽快进行内生真菌的分离。
122 内生真菌的分离与纯化 将碘伏表面消毒
处理的若干茎段和叶片分别置于无菌研钵中, 加入
1 mL ST溶液 ( 09% N aC ,l 05% 吐温 80), 再加入
无菌石英砂,研磨成浆。取适量的浆液涂布于 PDA
培养基上。将涂布好的平板置于 28∀ 培养, 每隔
12 h观察真菌菌落形成情况。若培养基中菌落一旦
出现, 立即将菌落四周的小块琼脂挖出,将平板再放
回 28∀ 培养。平板培养至 10 d,计算各平板上的真
菌菌落总数。挖出的含真菌的小块 PDA立即置于
含 PDA的小试管中培养, 待真菌长出后, 再在 PDA
平板上纯化。
123 内生真菌发酵物对 hTopo I松驰活性抑制能
力的调查 将分离纯化的内生真菌接种到 10 mL
马铃薯葡萄糖 ( PD )液体培养基中, 于 50 mL三角
瓶中 28∀ 摇瓶培养。 10 d后, 将发酵物冷冻干燥,
再用 10 mL甲醇浸泡抽提 1 d。甲醇挥干后, 用
50% DMSO溶解配成 10倍浓缩液, 用于 hTopo I
松驰活力抑制试验。 hTopo I松驰活性抑制试验参
考文献 [ 4] 。
124 两株内生真菌发酵物对 hTopo I抑制能力
的变化规律分析 接种在 PDA斜面上培养 7 d的
内生真菌于 25mL PD液体培养基中,盛于 100 mL
三角瓶中, 28∀ 摇瓶培养。每株内生真菌接种 10
瓶,每隔 24 h取一瓶,观察发酵物的颜色变化、测量
菌丝体的湿重及发酵上清对 hTopo I的抑制能力。
在测定发酵上清对 hTopo I的抑制能力前,须将发酵
上清放于 60∀ 1 h,以消除其中的 DNase活性。
125 两株高 hTopo I抑制活性内生真菌的分子
鉴定 将分离纯化的内生真菌接种到 PD液体培养
基中, 28∀ 摇瓶培养 4 d,收集菌丝体。用 Omega公
司的真菌基因组提取试剂盒提取基因组。用引物
ITS1F ( fungus specific: 5#CTTGGTCATTTAGAG
GAAGTAA3#)和 ITS4 ( un iversa:l 5#TCCTCCGCT
TATTGATATGC3#)扩增真菌 rDNA的间隔序列 (含
ITS1区、58S区、ITS2区 )序列 [ 5]。 PCR反应程序:
94∀ 变性 5 m in, 94∀ 30 s, 55∀ 40 s, 72∀ 1m in进
行 30个循环, 72∀ 延伸 10m in。
将 PCR产物直接送至上海基康测序。所得序
列在 G enB ank中用 B lastn进行相似性分析, 用
C lusta l进行序列比较。
2 结果与分析
21 南方药用植物内生真菌的含量调查
从 7种药用植物中共分离纯化 278株真菌菌
株, 其中从大果安息香、美登木、大青、麻风树中分别
纯化出 51、46、40、36株菌株,而从喜树、海南大风子
和铁冬青中均纯化出 35株菌株。研究发现, 多数药
物植物在叶中内生真菌的含量比茎中多 (麻风树和
海南大风子的叶与茎的含量较接近 ) , 可能是叶片
中气孔较多,有利于真菌利用氧气所致。此外,内生
真菌在同一植物不同的叶片或茎段中,分布并不均
匀, 相差很大。
22 药用植物内生真菌发酵物对 hTopo I抑制活性
的调查
定义发酵原液在未经稀释或浓缩时的相对浓度
为 1。在微量筛选体系中, 发酵物抽提液抑制 hTopo
I松驰活性一半时相对发酵原液的浓度, 定义为该
发酵物的 IC50,值越小表示抑制能力越强。
7种药用植物内生真菌发酵物提取产物对 hTo
po I松驰活性抑制能力的初步调查结果见表 1。从
表 1可看出, 大部分内生真菌发酵物提取产物对
hTopo I松驰活性几乎无抑制能力 ( IC50 > 2)。从大
青的叶中分得一株对 hTopo I松驰活性抑制能力较
高的内生真菌 (图 1, IC50 = 1 /16) , 编号为 LF61L;
从海南大风子的叶中分得二株对 hTopo I松驰活性
抑制能力很高的内生真菌 ( IC50 = 1 /64) , 编号为
LF47L、LF48L (从形态学上分析,此两株内生真菌
几乎完全相同, 故下面更深入的研究时, 作者仅以
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2010年第 9期 杨国武等:两株高 DNA拓扑异构酶 I抑制活性的药用植物内生真菌筛选
LF47L为研究对象 )。
表 1 七种药用植物内生真菌发酵物对 hTopo I松驰活性抑制能力
药用植物
各 IC50所占百分率及菌株数
> 2 2 1 1 /2 1 /4 1 /8 1 /16 1 /64
合计
大果安
息香
608%
( 31株 )
98%
( 5株 )
39%
( 2株 )
98%
( 5株 )
98%
( 5株 )
59%
( 3株 )
100%
( 51株 )
美登木 783%
( 36株 )
87%
( 4株 )
43%
( 2株 )
43%
( 2株 )
43%
( 2株 )
100%
( 46株 )
大青 825%
( 33株 )
25%
( 1株 )
5%
( 2株 )
5%
( 2株 )
25%
( 1株 )
25%
( 1株 )
100%
( 40株 )
麻风树 75%
( 27株 )
56%
( 2株 )
83%
( 3株 )
56%
( 2株 )
56%
( 2株 )
100%
( 36株 )
喜树 60%
( 21株 )
286%
( 10株 )
86%
( 3株 )
28%
( 1株 )
100%
( 35株 )
海南大
风子
80%
( 28株 )
86%
( 3株 )
57%
( 2株 )
57%
( 2株 )
100%
( 35株 )
铁冬青 628%
( 22株 )
143%
( 5株 )
57%
( 2株 )
114%
( 4株 )
57%
( 2株 )
100%
( 35株 )
共计 278株
1.仅加入超螺旋构型的 pBR322质粒的 20 L hTopo I
反应体系; 2.与泳道 1类似,但加入了 1U hT opo I; 38.
与泳道 2类似,但分别各自加入浓度为 1 /2, 1 /4, 1 /8, 1 /
16, 1 /32, 1 /64的发酵产物
图 1 内生真菌 LF61L发酵物对
hTopo I松驰活性抑制能力
23 内生真菌发酵物对 hTopo I抑制能力的变化规
律
内生真菌 LF47L、LF61L发酵物所产生的 hTo
po I抑制能力基本上在其发酵上清中, 其菌丝体提
取物对 hTopo I的抑制能力十分有限。因此,研究发
酵物 hTopo I抑制能力的变化规律时,直接取其发酵
上清来分析。
试验结果 (图 2)表明, LF47L生物量的增加与
其发酵上清对 hTopo I的抑制能力增加并不一致。
LF47L生物量在 2- 5 d快速增加,而其发酵上清对
hTopo I的抑制能力在 5- 7 d才快速增加并达到最
高。发酵上清的颜色在第 5天由浅色变为黄色, 在
5- 7 d则迅速变为黑色。可以看到, 发酵上清的颜
色由黄变黑的时间与其对 hTopo I的抑制能力增加
相一致; 而当第 5天发酵上清中出现对 hTopo I的抑
制成分时, LF47L生物量增加则停止, 当第 7天发
酵上清的抑制活性达到高峰时, LF47L菌丝由球状
聚集变为全部发散。由此推测,发酵上清中 hTopo I
抑制物质的产生对 LF47L本身的生长有些关联, 可
能是 hTopo I与真菌的 DNA topoisomerase I在结构
上相似,对人 hTopo I有抑制能力的物质对 LF47L
本身的 DNA topo isomerase I也可能有抑制作用, 而
LF47L本身的 DNA topo isomerase I对其的代谢有重
要作用。
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
图 2 内生真菌 LF47L的生长曲线及其发酵上清的
hTopo I抑制活性变化曲线
从图 3可看到, LF61L生物量的增加与其发酵
上清对 hTopo I的抑制能力增加也不一致。LF61L
生物量在前 2 d快速增加并达到最高, 而其发酵上
清对 hTopo I的抑制能力在 6- 8 d才快速增加并达
到最高 ( IC50达到 1 /16)。发酵上清的颜色在第 4天
由浅色变为浅红色, 在 5- 7 d则逐渐变为红棕色。
可以看到,发酵上清的颜色由红变为红棕色的时间
与其对 hTopo I的抑制能力增加基本一致。发酵上
清中抑制物质的产生对 LF61L本身的生长是否产
生影响表现不明显。当第 8天发酵上清的抑制活性
达到高峰时, LF61L菌丝也没有像 LF47L那样由
球状聚集变为发散。
图 3 内生真菌 LF61L的生长曲线及其发酵上清的
hTopo I抑制活性变化曲线
24 高 hTopo I抑制能力内生真菌的分子鉴定
利用引物 ITS1F和 ITS4扩增了 LF47L和 LF6
1L rDNA的 ITS区,扩增结果见图 4, 真菌 LF47L扩
增出了约 900 bp的片段, 真菌 LF61L扩增出了约
600 bp的片段。测序及序列比对结果 (图 5, 图 6)
显示, LF47L 与 Hypoxylon stygium (阴炭团菌 )的
ITS区序列相似性高达 997% ,因此认为 LF47L可
能是阴炭团菌。而 LF61L与 Arthrinium phaeosper
mum (毛竹基腐病菌 )最相近,相似性为 84%。
1.阴性对照; 2. DNA 标记; 3.对 LF47L菌株的 PCR扩
增产物; 4.对 LF61L菌株的 PCR扩增产物
图 4 内生真菌 LF47L和 LF61L rDNA ITS区
PCR产物电泳结果
图 5 内生真菌 LF47L rDNA ITS区碱基序列
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2010年第 9期 杨国武等:两株高 DNA拓扑异构酶 I抑制活性的药用植物内生真菌筛选
. !表示相同的碱基, - !表示碱基缺失; GenBank收录号 AJ279456是 Arth rin ium phaeosperm um isolate A3, GenBank收录号
A J279447是 Arthrin ium phaeosperm um stra in CBS
图 6 内生真菌 LF61L和 Arth rin ium phaeospermum rDNA ITS区序列的比较分析
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 9期
3 讨论
因植物内生真菌长期生活在植物组织的特殊环
境中, 与植物体交换代谢产物, 形成互惠共生的关
系。因此,培养药用植物内生真菌时,把植物组织研
磨成浆,将植物组织的浆液一并加在培养基中,浆液
可提供特殊的营养, 可能将某些在普通分离培养基
上不能生长的内生真菌培养出来。因植物中内生真
菌具有多样性,有些真菌生长较快,而有些真菌生长
很慢。生长较快的真菌,气生菌丝发达,能优先生长
并很快铺满整个平板, 使生长缓慢的内生真菌得不
到分离。因此,本研究分离药用植物内生真菌时,每
隔 12 h将先生长出来的真菌菌落挖出来分开培养,
可将 7至 10 d以后才能长出的内生真菌分离出来。
而这些生长缓慢的内生真菌,可能就是长期生活在
植物组织内、代谢缓慢、菌丝严重退化的真菌新品
种。在本研究中,具备这种生长特点的内生真菌数
量的确不少。
本研究从分离的 278株内生真菌中筛选出了 3
株高 hTopo I抑制力的菌株, 对其中 2株进行了分子
鉴定。LF47L分离自药用植物海南大风子, 属于子
囊菌阴炭团菌 (H ypoxy lon styg ium )。目前, 还未见
到对阴炭团菌代谢产物进行研究的报道, 对炭团属
内其它真菌次生代谢产物的研究也很少。有报道从
Hypoxylon croceum、Hypoxylon oceanicum 发酵物中分
离到了抗真菌的物质 [ 6 - 8 ]。本研究首次发现阴炭团
菌次级代谢产物具有高 hTopo I抑制活性,具体的活
性物质还需深入研究。 LF61L分离自药用植物大
青, 与毛竹基腐病菌 ( Arthrin ium phaeosp ermum )有
84%的相似性,推测 LF61L可能是一个真菌新种,
该菌株发酵液具有比较高的 hTopo I抑制活性,开展
此菌株代谢产物的研究具有重要意义。
参 考 文 献
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