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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
病毒负性调节因子在内皮细胞稳定表达细胞株的建立
杨凡 1, 2  刘朝奇 2  覃晓琳2  李斌2  韩钰2
( 1 宜昌市第二人民医院,宜昌 443000; 2三峡大学分子生物学研究所,宜昌 443002)
  摘  要:  建立 H IV
1的调节基因 Ne f基因在内皮细胞稳定表达的细胞株 ECV304
Ne,f为研究 Nef对血管内皮细胞生物
学活性的影响奠定试验基础。构建真核表达载体 pcDNA 3. 1( + )
Ne ,f将其质粒和 pcDNA 3. 1( + )质粒 (阴性对照 )分别转染
血管内皮细胞 ECV304, G418筛选。通过 RT
PCR检测 Ne fmRNA在细胞中的表达;细胞免疫荧光法检测 Nef蛋白的表达及定
位; W este rn b lo tting检测 N ef蛋白的特异性表达, 获得稳定表达的细胞株。构建的重组质粒 pcDNA3. 1( + )
Ne f经 BamH I和
EcoR I双酶切鉴定,得到的片段大小与理论值相符, 分别为载体的 5 400 bp和目的基因的 621 bp。测序结果显示碱基序列与
GenBank(登录号: K03455)序列相同。转染细胞经 G418筛选后获得稳定表达 Nef的 ECV304细胞株, RT
PCR显示转染 pcD

NA 3. 1( + )
Nef质粒的 ECV304细胞出现 621 bp条带, 对照组无目的条带出现; 荧光显微镜下观察转染 pcDNA 3. 1( + )
Nef
质粒的 ECV304细胞表达的 Ne f蛋白主要定位于细胞质中。W estern b lo tting结果显示, 转染 pcDNA 3. 1( + )
N ef质粒的
ECV304细胞约 27 kD处检测到目的条带, 表明 pcDNA3. 1( + )
Nef表达正确。
关键词:  H IV
1 N ef基因  稳定表达  血管内皮细胞
Establishment ofHIV
1 Negative Regulate Factor Stable Expressed
Cell Strain in Human Endothelial Cells
Yang Fan
1, 2  L iu Zhaoqi2  Q in X iaolin2  L iB in2  H an Yu2
(
1
The First RenminH osp ital in Yichang City, Yichang 443000;
2
Institute of M olecular and Biology,
Three Gorges University, Yichang 443002 )
  Abstrac:t  It was to investigate the effects of H IV
1 negative regulate factor( Nef) gene expressed in vascu lar endo the lia l cells.
Eukaryo tic expression vecto r pcDNA 3. 1( + )
Nef and pcDNA 3. 1( + ) w ere constructed, bo th o fw hich w ere stably transfected into en

dothe lia l cell line ECV304 ce lls, respective ly. The expression of Ne f prote in w as de tected w ith RT
PCR, W este rn blot and immuno fluo

rescence assay. Results ind ica ted that the DNA fragm ents of 5400 bp and 621 bp of plasm id pcDNA3. 1( + )
Nef w ere observed on the
agarose ge l by double enzym e dig estion, and the sequences of wh ich we re co inc iden t w ith the expected. RT
PCR product of Nef( 621
bp) cou ld be detected in cDNA from ECV304 cells transfec ted w ith pcDNA3. 1( + )
Ne ;f the red fluorescence was seen m a inly in the
cy top lasm o fN ef expressed ECV304 ce lls under fluo rescence m icro scope; using W estern b lo t a 27 kD strap was displayed in the Nef
positive ce ll blot.
Key words:  H IV
1 Nef gene Stable expression V ascu lar endothelial ce lls
收稿日期: 2009
12
10
基金项目:宜昌市科技发展计划项目 (A2007108
02B02)
作者简介:杨凡,女,硕士,研究方向: H IV分子学; E
m ai:l yangf823@ 126. com
通讯作者:刘朝奇, E
m ai:l chaoq i@l yahoo. com
高活性抗逆转录病毒疗法大大减少机会性感
染死亡风险和延长 H IV
1感染者的寿命。然而许
多并发症和器官损害在 H IV
1感染者中出现, 其
中心血管疾病如冠状动脉疾病已经成为一个令人
关注的问题。H IV
1感染后引起内皮细胞功能障
碍可能是动脉粥样硬化等心血管疾病发生的原
因。研究表明人的血管内皮细胞能以 H IV
1的调
节蛋白病毒负性调节因子 ( N ega tive regula te fac

tor, N ef )依赖的方式促进 CD4+ T的 H IV
1病毒
复制, 具体的机制并不清楚 [ 1]。说明了 Ne f蛋白会
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 4期
特异性影响内皮细胞的生物学活性。考虑 N ef蛋
白在血管内皮细胞存在的可能性与事实 [ 2 - 4 ] , 本
试验旨在构建真核表达载体 cDNA3. 1( + )
N ef稳
定转染人血管内皮细胞 ECV304细胞, 以期进一步
研究 N ef蛋白对内皮细胞生物学活性的影响。
1 材料与方法
1. 1 菌株及试剂
E. coli DH5
、H IV
1HXB2基因组质粒、真核表
达载体 pcDNA3. 1( + )由本研究所保存。限制性内
切酶 BamH I和 E coR I、RNA酶、DNA酶、Taq DNA
聚合酶、T4DNA连接酶,反转录试剂为 Fermentas公
司产品。辣根过氧化物酶标记山羊抗兔 IgG和罗丹
明标记山羊抗兔 IgG抗体购自北京中杉金桥生物技
术有限公司, 兔抗 N ef多克隆抗体由本实验室自
制 [ 5]。RPM I
1640、胎牛血清、胰蛋白酶、G418、脂质
体、T rizo l购于 Invitrogen公司。蛋白酶抑制剂 Cock

tails由美国 AMRESCO公司提供。人血管内皮细胞
ECV304购自武汉中国典藏物培养中心。
1. 2 pcDNA3. 1 ( + )
N ef重组表达质粒的构建与
鉴定
H IV
1N ef基因以 H IV
1HXB2基因为模板,应
用 DNAMEN软件进行引物设计。引物由上海生工
生物公司合成,序列如下:上游为 5
CAGGATCCAT

GGGTGGCAAGTGGTCA
3 (引入限制性核酸内切酶
BamH ! 酶切位点 ) , 下游为 5
GGAATTCTCAG

CAGTTCTTGAAGTACTC
3 (引入限制性核酸内切酶
E coR!酶切位点 )。 PCR扩增条件为 94∀ 变性 2
m in;然后 94∀ 30 s, 55∀ 30 s, 72∀ 45 s, 30个循
环; 72∀ 10 m in结束扩增。胶回收 PCR 产物,
BamH!和 E coR!分别双酶切 PCR回收产物 H IV
1
N ef和 pcDNA3. 1( + )真核表达载体。纯化试剂盒
纯化酶切产物; H IV
1 N ef酶切产物与 pcDNA3. 1
( + )酶切产物经 T4 DNA连接酶连接, 16∀ 恒温连
接过夜 ( 16 h)。将连接产物转入大肠杆菌 DH5
中
培养, 挑取单克隆提取质粒进行酶切和测序鉴定。
1. 3 真核细胞转染与筛选 
在六孔板接种 ECV 304细胞 , 培养至对数生
长期, 约铺满该孔 80%。 10 L脂质体用 250 L
优化液稀释,轻弹离心管管壁混匀, 室温下孵育 5
m in。取离心管, 各加入 250 L优化液, 分别加
入质粒 pcDNA 3. 1 ( + )和 pcDNA 3. 1 ( + )
N ef
各 4 g, 轻弹管壁混匀。将 DNA加入脂质体稀
释液中, 混匀, 室温下孵育 20 m in, 使脂质体充分
包裹 DNA。转染前 1 h, 将细胞培养液换成不含
抗生素的培养液。将上述 DNA
脂质体混合物分
别加入 6孔细胞培养板中, 轻摇培养板 , 使之充
分混匀。 37∀ , 体积分数为 5% CO2培养箱中孵
育 6 h。弃培养液, 换含 100 g /L血清的 RPM I

1640培养基继续培养 24 h。弃培养液, 2. 5 g /L
胰蛋白酶消化, 将细胞以 1#8的比例传代。 24 h
后加入 G418, 筛选浓度定为 0. 4 g /L进行筛选 ,
定期更换培养液。 7 d左右, 正常细胞死亡后, 继
续对转染细胞进行筛选至第 12 - 14 d。挑取单
克隆细胞株进行扩大培养, 以后用 0. 2 g /L的
G418培养液维持。
1. 4 RT
PCR检测 N efmRNA在细胞中的表达
取对数生长期的细胞, 提取细胞总 RNA, DN ase
I处理 RNA, 测定核酸浓度。 37∀ 孵育 0. 5 h。加入
25 mM EDTA 1 L, 65∀ 孵育 10 m in。处理好的
RNA即可用于反转录。取 DN ase I处理的 RNA 2
g, O ligo( dT ) 0. 5 g, 加双蒸水至 12. 5 L。混匀后
75∀ 孵育 5 m in, 立即置冰上。加入反应缓冲液 4
L, dNTP 2 L, RNA酶抑制剂 0. 5 L及 DEPC处
理水至 19 L。混匀后 37∀ 孵育 5m in,再加入逆转
录酶 1 L。混匀后 42∀ 孵育 1 h, 70∀ 孵育 10 m in
终止反应后置冰上。以上述获得的 cDNA为模板进
行 PCR。
1. 5 细胞免疫荧光法检测 Nef蛋白的表达及定位
在 96孔板低密度接种分别转染 pcD
NA 3. 1
( + ) , pcDNA3. 1( + )
Nef的 ECV 304细胞, 16 h后
处理细胞。弃上清, PBS漂洗细胞 1遍。弃 PBS, 加
入新鲜配置的 4%多聚甲醛, 每孔 50 L,室温固定
20m in。弃多聚甲醛, 用 150 L PBS漂洗细胞 3
遍, 每次 5m in。弃 PBS, 每孔加入 150 L含 100 g /
L山羊血清和 1 g /LBSA 的封闭液, 室温轻摇 90
m in。弃封闭液,每孔加入 50 L兔 Ne f抗体 ( 20 g /
LBSA 1#1 000稀释 ) , 4∀ 孵化过夜。弃上清, 150
L PBST (体积分数为 0. 5%的 Tw een20)漂洗 3遍,
每次 5 m in。弃上清,每孔加入 50 L罗丹明标记山
羊抗兔 IgG抗体 ( 20 g /LBSA 1#3 000稀释 )。室温
162
2010年第 4期 杨凡等: 病毒负性调节因子在内皮细胞稳定表达细胞株的建立
避光孵化 60m in。弃上清, 150 L PBST漂洗 3遍,
每次 5m in。荧光显微镜观察。
1. 6 W estern blot tiy检测 N ef蛋白的表达
细胞扩大培养至对数生长期, 提取各组细胞的
总蛋白质,收集细胞上清液,分光光度仪测定蛋白浓
度, - 80∀ 冰箱保存。制备 SDS
聚丙烯酰氨凝胶,
向待分离的蛋白质溶液中加入等量 2 ∃ SDS凝胶加
样缓冲液,混匀后 100∀ 加热 5 m in,使蛋白变性,每
个加样孔加 45 L样品, 120 g /L SDS
PAGE电泳分
析,电泳条件浓缩胶 80 V,分离胶 120 V。将电转移
装置上, 60 V恒压转膜转膜 1. 5 h。转膜完毕后,将
膜完整揭下, 50 g /L牛奶封闭液室温摇床上缓摇封
闭 2 h。用含 20 g /L牛奶的 PBST液以 200#1的比
例稀释一抗 (即兔 Nef抗体 ) , 膜置一抗中于 4∀ 冰
箱中平放过夜。用 PBST流动洗膜 1次, 摇床上洗
膜 5 m in ∃ 3次。将二抗 (即辣根过氧化物酶标记山
羊抗兔 IgG)用 PBST按 1#5 000的比例稀释, 膜在
二抗中于室温平放温育 1 h, 用 PBST流动洗膜 1
次,摇床上洗膜 5 m in ∃ 3次。ECL显色: A液 B液
按 1#1混合, 加到膜上。暗室压片 1 - 10 m in, 显影
1 m in,定影 1 m in,凝胶成像系统拍照,保存图片。
2 结果
2. 1 酶切和测序鉴定目的基因的正确插入
应用 PCR方法获得 H IV
1 Nef基因片段,经过
酶切、连接和转化,获得 pcDNA 3. 1( + )
N ef的重组
质粒。构建的重组质粒 pcDNA3. 1 ( + )
Ne f经
BamH I和 E coR I双酶切鉴定,得到 620 bp左右的
目的条带, 10 g /L琼脂糖凝胶电泳结果与预期大小
相同 (图 1)。将构建好的真核表达质粒 pcDNA3. 1
( + )
Nef送到上海生工生物工程有限公司测序,测
两个连接位点的序列, pcDNA3. 1 ( + )
Nef测序结
果与理论结果吻合。进一步表明真核表达载体
pcDNA3. 1( + )
Nef构建正确。
2. 2 RT
PCR方法鉴定转录水平目的基因的正确性
提总分别转染 pcDNA 3. 1 ( + ) , pcDNA3. 1
( + )
Nef的 ECV304细胞的 RNA,经分光光度仪检
测其 A260 /A280,比值均介于 1. 8- 2. 0之间, RNA琼
脂糖凝胶电泳 28S、18S和 5S条带清晰可见,表明抽
提的 RNA较完整, 未见明显降解。提取的 RNA经
DN ase I处理,经逆转录合成 cDNA第一链, 以合成
1. DNA分子量标准; 2.重组质粒 p cDNA3. 1( + )
N ef双酶切产物
图 1 琼脂糖凝胶电泳分析 Bam H!和 EcoR I双酶
切重组质粒 pcDNA3. 1( + )
N ef
的 cDNA为模板,以 Ne f引物进行 PCR反应,在电泳
下可见转染 pcDNA 3. 1( + )
N ef的 ECV304细胞出
现 621 bp条带 ( N ef mRNA的表达 ) ; 转染空载的
细胞无目的条带出现; 转染 pcDNA 3. 1( + )
Nef的
ECV 304细胞的 RNA经 DNase I处理后直接进行
PCR检测相应的基因无 Nef基因的 PCR产物出现
(图 2)。说明 pcDNA 3. 1( + )
Ne f载体成功导入
ECV 304细胞,并在 mRNA水平获得表达。
1. DNA分子量标准; 2. N ef基因; 3. RNA; 4.对照组
图 2 RT
PCR鉴定 pcDNA3. 1( + )
N ef在 ECV304
细胞中 Nef基因的转录
2. 3 细胞免疫荧光法观察 N ef蛋白在细胞中
的表达及定位
应用免疫荧光的方法, 二抗为罗丹明标记的
163
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 4期
IgG抗体,在荧光显微镜下观察阳性细胞呈红色荧
光。转染空载 pcDNA 3. 1( + )的 ECV304细胞未见
红色荧光; 而转染 pcDNA 3. 1( + )
Ne f的 ECV304
细胞显示胞浆与膜可见红色荧光 (图 3)。说明转染
pcDNA 3. 1( + )
N ef的 ECV 304细胞表达的 Ne f蛋
白主要定位于细胞质中,部分定位于细胞膜,这与天
然 N ef蛋白的细胞内定位结果是一致的。
图 3 细胞免疫荧光法观察 N ef蛋白在 ECV304
细胞中的定位
2. 4 W estern b lo tting分析 pcDNA 3. 1 ( + )
Ne f在
ECV 304细胞的表达
分别收集两株转染 pcDNA 3. 1 ( + )
Nef的
ECV304细胞和两株转染 pcDNA 3. 1( + )的 ECV304细
胞进行Western blotting分析, 结果显示转染 pcDNA
3. 1( + )
Nef的 ECV 304细胞组对照 Marker 27 kD
处可检测到目的条带, 而转染 pcDNA 3. 1 ( + )的
ECV304细胞组无目的条带 (图 4)。表明 Nef特异
性表达在相应的细胞。
图 4 W estern b lotting检测 N ef蛋白在 ECV304
细胞的表达
3 讨论
H IV
1的调节蛋白病毒负性调节因子 ( Negat ive
regulate factor, N ef )存在于细胞质和细胞膜,是 A IDS
发病过程中起重要作用的辅助蛋白 [ 6] ,其生物学活性
在不同灵长类慢病毒中高度保守。在 SH IV
Ne f( SIV
为骨架重组 H IV
1Nef基因 )感染的猩猩动物模型和
H IV
1感染的人肺组织切片发现肺部血管明显病变,
包括血管内膜破坏,管壁增厚、血栓形成等。多年的
观察发现 H IV
1感染者肺动脉高压的患病率相对普
通人群明显增加, 在损害的血管或者内皮细胞中并
没有直接发现有 H IV
1病毒存在, 表明损伤并不是
由病毒直接造成的。运用免疫组织化学方法检测
内皮细胞 N ef阳性, 而在 SIV感染的及先 d性肺动
脉高压的肺组织中为阴性 [ 2, 3 ]。提示 H IV
1 N ef可
以通过某种机制进入内皮细胞并且在血管病变中
起到关键性作用。有文献报道 H IV
1感染的巨噬
细胞可以将病毒产物转入到 CD4阴性的细胞, 包
括上皮细胞和内皮细胞等, 这一结果预示巨噬细
胞可以直接将 Nef等病毒蛋白转入内皮细胞而产
生相应的生物学作用 [ 4 ]。本试验建立 N ef基因在
内皮细胞稳定表达的细胞株 ECV304
N e,f为研究
H IV
1的调节基因 N ef对内皮细胞生物学活性的
影响提供试验基础。
ECV 304细胞在 1990年第一次被报道, 它是从
日本人的脐静脉内皮细胞 (HUVEC )分离出来的, 经
过自然转化成为永生化的细胞系。尽管 ECV 304和
HUVEC在细胞标记物上有一定的差别,但是与原代
血管内皮细胞相比具有均一性, 便于不同的实验室
的研究比较。 ECV304作为一种稳定的细胞系, 已
经广泛用于体外血管形成、细胞迁移、细胞因子的表
达、信号转导等生物医学和药学研究领域 [ 7]。因此
本试验选择 ECV 304细胞作为研究的工具细胞。
载体 pcDNA3. 1( + )具有 G418抗性位点,可以
对转染的细胞进行筛选,两周以后挑取单克隆,并进
行放大培养。通过 RT
PCR及W estern b lotting方法
在转录水平和翻译水平对这些细胞株进行鉴定, 细
胞免疫荧光法观察 N ef蛋白在内皮细胞的表达及定
位。在进行 RT
PCR试验中, 质粒转染细胞会使细
胞表面非特异性附着 DNA样品,用 DNase I处理提
取的 RNA以去除 DNA污染, 再将其产物直接进行
PCR确认 RNA中不含 DNA, 避免出现 RT
PCR结果
假阳性。免疫荧光的方法用来反映目的蛋白的表达
时, 容易出现假阴性与假阳性,需要对实验条件进行
摸索。与 Western blotting相比,细胞免疫荧光可以
清楚的反映目的蛋白的细胞定位, W estern b lo tting
(下转第 197页 )
164
2010年第 4期    汤鸣强等:米曲霉 F
81菌株产中性蛋白酶的分离纯化
活性。本试验发现,多个洗脱峰都有水解圈的出现,
只是大小有别, 说明该菌株可能拥有多个蛋白酶
组分。
文献 [ 12]提出,该菌固体发酵所产中性蛋白酶
粗酶的最适作用温度为 60∀ , 最适 pH 值为 70。
40∀ 下酶稳定性较好, 60∀ 下处理 20 m in, 粗酶中
几乎检测不到酶活力; Km值为 284mg /mL;最大反
应速度为 032 mg /m in
mL。Mg2+对酶活有激活
作用, Cu2+、Fe3 +、Zn2+、Mn2+不同程度抑制酶活性,
其中 Cu2+、Fe3+强烈抑制酶活性。有关纯酶的酶学
性质与动力学特性有待进一步深入研究, 而在此基
础上对粗酶与纯酶相关特性的比较, 则有利于初步
阐明该菌中性蛋白酶的结构特征。
参 考 文 献
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622.
(上接第 164页 )
检测目的蛋白表达具有更好的敏感性与特异性。多
种方法在不同水平与方面检测证实目的基因在真核
细胞中表达, 为研究 H IV
1 N ef基因对真核细胞生
物学特性改变的影响奠定基础。
参 考 文 献
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