全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第1期
收稿日期:2007-06-22
基金项目:黑龙江省科技计划攻关项目(编号:2005J0201)
作者简介:姬妍茹(1971-),女,高级农艺师,主要从事亚麻生物技术研究;E-mail:yanruji2003@yahoo.com.cn
亚麻是重要的油料和纤维作物,它在纺织原料业有着举足轻重的地位。近年来随着对绿色环保意识的
加强,人们对麻类织品更为青睐。科技工作者将转基因技术运用于亚麻育种工作中,以期培养出高产、优
质、抗逆性强的品种以满足纺织原料业的需求。利用农杆菌介导进行亚麻遗传转化的研究一直是亚麻生物
技术育种的重点,也是开展研究较多,技术比较成熟的转化方法。此转化技术中所采用的基因转化受体系
统大多为愈伤组织再生系统,少数为原生质体再生系统。采用直接分化再生系统进行转化的国内外未见有
相关的报道。采用根癌农杆菌介导 GUS基因转化亚麻下胚轴,获得转基因再生植株。并初步筛选出适合亚
麻转化的菌液(AGL1菌株)浓度及抑菌抗生素的使用浓度。从外植体接种到亚麻转化植株的获得仅需不到
两个月的时间,大大缩短了亚麻转基因的育种进程,为亚麻转基因育种工作的开展提供了一条快捷的途
径。
1 材料与方法
1.1 植物材料
受体亚麻品种为双亚五号、双亚七号,为黑龙江省亚麻原料工业研究所育种室育成并提供。
1.2 农杆菌菌株和质粒
农杆菌菌株为 AGL1,植物表达载体 PDM805(携带 GUS基因),由中国农科院生物技术研究所赵军研
应用直接分化再生系统进行亚麻转基因技术的研究
姬妍茹 1 赵军 2 刘伟伟 1 关向军 1
(1黑龙江省科学院亚麻综合利用研究所,双城 150111;2中国农业科学院生物技术研究所,北京 100081)
摘 要: 采用直接分化再生系统为转化受体系统,通过农杆菌介导将GUS基因导入亚麻品种双亚五号和双亚七
号的下胚轴段中,经过不到两个月的时间即获得再生苗。GUS检测显示,转化率分别达到9.1%(双亚五号)和4.45%(双亚
七号),大大缩短遗传转化所需时间,为亚麻转基因育种提供了一条快捷的途径。
关键词: 亚麻 直接分化 再生 受体系统
StudyonFlaxTransform TechnologybySystem ofShoot
DiferentiateDirectlyfrom Explant
JiYanru1 ZhaoJun2 LiuWeiwei1 GuanXiangjun1
(1InstituteofComprehensiveUtilizationofFlax,HeilongjiangProvincialAcademyofSciences,Shuangcheng150111;
2BiotechnologyResearchCentreofChineseAcademyofAgriculturalScience,Beijing100081)
Abstract: A Transformation System ofshootdferentiate directly from blastostyle wasdeveloped using
Agrobacterium tumefaciens-mediatedgenedelivery.Thegusgenewastransformedintoflaxblastostyle(includingvariety
Shuangya5andShuangYa7),andtransgenicplantwasobtainedinnotenoughtwomonths.Theresultsconfirmedthatthe
gusgenewasexpresedsuccesfulyintheleavesofregenerationplant.Thefrequencytransformationwasseparately9.1%
(ShuangYa5)and4.45%(ShuangYa7).Thetransgenicacceptorsystemwilshortenthelengthoftransformationtime,provide
afastwayforflaxtransgenicbreeding.
Keywords: Flax Diferentiatedirectly Regeneration Acceptorsystem
2008年第1期
究员提供。
1.3 培养基
预(共)培养基[1] B5+IAA(0.5mg/L)+6-BA(2.0mg/L)+活性炭 0.5g/LpH5.5
分化培养基 B5+IAA(0.5mg/L)+6-BA(2.0mg/L)+活性炭 0.5g/L+头孢曲松钠(200mg/L)pH5.5
壮苗培养基 B5+IAA(0.1mg/L)pH5.5
生根培养基 B5+IAA(0.1mg/L)+NAA(0.1mg/L)+多效唑(0.0004mg/L)+H3BO3(15mg/L)}+NaMoO4.H2O
(0.5mg/L)+头孢曲松钠(200mg/L)pH5.8
YEB培养基 牛肉膏(5g/L)+蛋白胨(5g/L)+蔗糖(5g/L)+酵母浸膏(10g/L)+MgSO4(0.5g/L)pH5.5
1.4 试验方法
1.4.1 外植体的制备[2] 选择饱满度好,有光泽的亚麻种子,用 75%乙醇浸 30min,0.1%HgCl2浸 10min,然
后用无菌水冲洗 3遍,接种到不含激素的 B5培养基上,在 25℃黑暗条件下培养 5~7d,使用前两天使其置
于 22℃,每天 16h光照条件下备用。
1.4.2 外植体的预培养[3] 将亚麻无菌苗的下胚轴切成 0.5cm左右的小段,接种于分化培养基上,25℃光
周期 16h条件下预培养 2d。
1.4.3 农杆菌菌液的制备[2,3] 挑取农杆菌单菌落,接种在附加利福平 50mg/L,四环素 20mg/L的 20mlYEB
液体培养基中,在 28℃黑暗条件下 200r/min的摇床上振荡培养 2d达到菌液的对数生长期,倒入离心管中,
经 3000r/min离心 10min,收集农杆菌,加入适量的 B5无激素培养基重新悬浮测 OD值在 0.5左右备用。
1.4.4 共培养 将菌液倒在经过预培养的外植体上,浸泡 3~5min,然后用无菌滤纸吸干多余的菌液,置于
原来的预培养基上 28℃黑暗条件下共培养 3d,随后用无菌水或 B5液体培养基清洗掉下胚轴段上生长的农
杆菌菌液,并转至含有抑菌抗生素的 B5培养基上进行脱菌培养,15~20d转移一次直至产生再生芽。
1.4.5 壮苗培养 当再生芽长至 1.0cm以上时,切下转入壮苗培养基中进行壮苗培养,长至 3.0cm左右
时转入生根培养基中进行生根培养。
1.4.6 GUS基因检测 GUS活性的组织化学检测参考王关林等《植物基因工程原理与技术》中的方法[4]。
瞬时表达检测 受体与根癌农杆菌共培养 3d后,立即检测。
稳定表达检测 切取再生芽的下部叶片放入 X-GLUC色染液中,37℃过夜后,用 FAA固定脱色液脱色
后进行观察,被染成蓝色的即为转化植株。
瞬间表达率=有 GUS基因瞬间表达的受体组织/与根癌农杆菌共培养基的总受体组织×100%
稳定表达率=有 GUS基因表达的再生植株/参试的再生植株(转化率)
2 结果与分析
2.1 外植体的选择
对侵染 3d后的亚麻下胚轴段、子叶及茎尖进行瞬时表达检测,结果见表 1、图 1及图 3、图 4和图 5。
对于外植体茎尖而言,是否进行预培养,其 GUS表达率均为 100%,只是受体的一周成活率随着预培
养时间增加呈上升的趋势。较 0预培比较,外植体下胚轴和子叶的 GUS瞬时表达率在预培养 2d开始出现
下降趋势,总体来看外植体一周成活率呈上升趋势。不进行预培养虽然有 100%的 GUS瞬时表达,但外植
体生长状态不佳,成活率低,难于进行再分化。三种外植体比较虽然子叶和茎尖的 GUS瞬时表达率较高,
培养一周成活率的高低顺序为子叶块、下胚轴段、茎尖。子叶块虽然有着最高的瞬时表达率和成活率,但经
农杆菌处理后其分化频率极低;茎尖的分化率也较低,而下胚轴分化频率较高,因此后序试验中以下胚轴
作为转化的外植体。
2.2 抑菌药物的种类及适宜浓度的筛选
将农杆菌菌液 AGL1,分别涂在含有不同浓度的头孢唑林钠、头孢曲松钠、羧苄青霉素及 AgNO3的下胚
姬妍茹等:应用直接分化再生系统进行亚麻转基因技术的研究 129
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
图 1 不同外植体在不同的预培养条件下培养 1周成活率比较
轴分化培养基上连续观察 10d,结果见表 2。
从表 2结果可以看出,几种抗生素的抑菌
能力明显不同(表 2),未加抗生素的平板(对
照)在第 2d即形成菌落,含 100mg/L的头孢噻
肟钠和头孢曲松钠在第 8d才形成菌落,大于或
等于 200mg/L的头孢噻肟钠和头孢曲松钠培养
10d未见菌落形成;头孢唑林钠若在 8d内无菌
落形成,其浓度应大于 750mg/L(羧苄青霉素浓
度达到 750~1000mg/L时 3d内就出现农杆菌
菌落,不宜作为农杆菌菌株 AGL1的抑菌剂)。AgNO3从 2.0~4.5mg/L,第 2d就出现菌落,且生长迅速。可见,
其对 AGL1菌株无抑菌作用,不宜作为抑菌剂。本着经济有效的原则,从连续 10d记录菌落形成的情况来
说,我们认为首选的抗生素应是头孢曲松钠(头孢噻肟钠抑菌效果虽好于曲松钠,但价格较贵)。头孢唑林
钠的用量较大,可能会对外植体分化不利。不是最佳的抑菌药品。综上,头孢曲松钠为首选的 AGL1菌株抑
菌剂,将在后续试验中使用。
2.3 根癌农杆菌用于转化浓度的确定
在本试验中,我们分别进行了OD600
值为 0、0.1、0.3、0.5、0.7五个浓度的转
化处理,结果在 OD600值为 0.5处理中,
双亚五号获得了转化再生植株,在
OD600值为 0.7处理中,双亚七号获得
了转化再生植株,其它处理中均没有
获得转化植株。这说明 OD600为 0.5~
0.7可以作为亚麻转化的适宜浓度,这
与其它相关资料的结果是相符的。(由于只有两个处理有转化植株获得,在此没有列出处理的调查结果表)
2.4 基因型对受体分化效果及转化效果的影响
在试验中我们分别调查了不同基因型的亚麻品种的下胚轴段经农杆菌侵染后的再生植株分化情况
(结果见表 3及图 2)和再生植株叶片的 GUS稳定表达检测情况(结果见表 4及图 6、图 7和图 8)。
从表 3中可以看出,在完全空白对照(CK2)中,亚麻下胚轴的分化率分别高达 89.1%(双七),93.6%
(双五);CK1和处理中分化率明显降低,可见抑菌剂和农杆菌的使用明显抑制亚麻下胚轴的分化率。
在不同基因型的亚麻品种经农杆菌处理后,其分化率表现出较大差异,双亚五号分化率最多可达
23.40%,而双亚七号最多只达到 5.56%。表 4结果显示,双亚七号的 GUS表达情况较双亚五号低一半。这
说明基因型仍然是制约亚麻遗传转化过程中再生植株分化率和转化率的主要因素。
3 讨论
3.1 直接分化再生系统作为受体系统的优势
应用直接分化再生系统为受体系统,通过农杆菌 AGL1菌株介导,将 GUS基因导入亚麻品种双亚五号
表 1 不同预培养时间及不同的外植体的 GUS瞬时表达结果
表 2 不同药品对农杆菌的抑制效应
注:-为未出现菌落 ×为未设该处理浓度 ()内数字为硝酸银浓度
130
2008年第1期
和双亚七号的下胚轴中,并获得分化苗。对侵染后 3d的下胚轴段进行 GUS瞬时表达检测,伤口处有明显
的蓝色反应;对再生无根苗的叶片进行 GUS稳定表达检测,部分植株叶片上有明显的蓝色斑块。GUS稳定
表达率分别达到 9.1%(双亚五号)4.45%(双亚七号)。而且,从外植体接种到再生苗的获得仅需不到 2个月
的时间。与以往亚麻上应用的愈伤组织分化再生系统和原生质体再生系统相比,大大缩短了遗传转化所需
的时间,可以加速亚麻转基因育种的进程,为亚麻转基因育种提供了一条快捷的途径。
3.2 基因型和外植体对转化的影响
作物的基因型和外植体的选择一直是制约再生苗分化率的因素。本试验中同样的菌液浓度(OD600为
0.5左右)情况下,双亚七号的苗分化率明显低于双亚五号。因此,在进行转化时,选择适合的基因型作受体
是转化成功与否及成功率高低的关键。
试验对茎尖、下胚轴和子叶三种外植体为受体的研究表明,茎尖和子叶的 GUS瞬时表达率(预培养
3d)明显高于下胚轴,但由于在直接分化培养基上,二者再生苗的分化率极低,不能用作转化受体。当然也
可能是直接分化培养基的配方不适合茎尖的诱导和分化,(一般认为茎尖是最适合作直接分化系统的外植
体的,而且分化率极高),有待于筛选其它培养基来提高茎尖的分化率,以此达到提高转化率的目的。
表 3 不同基因型受体分化效果情况表
图 2 不同基因型受体被侵染后分化情况比较
表 4 不同基因型受体再生植株叶片的 GUS检测结果
注:此处的再生植株为离体培养的下胚轴近切口处产生的再生植株
姬妍茹等:应用直接分化再生系统进行亚麻转基因技术的研究 131
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第1期
3.3 适宜的菌液浓度、预(共)培养时间及抑菌剂的筛选
菌液浓度的大小对转化是否成功起到至关重要的作用。试验做了不同菌液浓度的处理试验,结果表
明,只在 OD600值为 0.5和 0.7时,分别获得双亚五号和双亚七号的转化苗,转化率分别为 9.1%(双五),
4.45%(双七)。双亚七号的转化率仅为双亚五号的一半。且需在 OD600为 0.7时才有转化苗的出现,这说明
不同基因型所需的菌液侵染浓度可能有所不同。但是,应该尽量降低菌液的使用浓度,因为如果浓度过高
会出现共培养时菌生长旺盛,以后抑菌难且外植体会软腐死亡。认为 OD600值为 0.5左右比较适宜亚麻的
转化,这与以往一些资料报道基本一致。
外植体预培养及共培养以 2～3d为宜。不经过预培养的外植体虽然 GUS瞬时表达率较高,但是由于是
新的创口直接接触菌液,会造成后来培养中外植体的存活率降低,从再影响转化工作。而预培养 2～3d既可
以避免这个弊端,又可以使外植体完成上翘等生理过程,使伤口处可以在侵染后与培养基充分接触,有利
于转化苗的获得。因为只有在创口附近分化的苗才可能是转化苗。
试验中观察到共培养以 2～3d为宜,有资料认为亚麻共培养以 5～7d为宜,本试验研究显示共培养超过
3d会出现菌落过度生长,造成外植体大量软腐死亡且给以后的抑菌工作带来很大的难度。
另外,试验对头孢类抑菌剂,羧苄青霉素及硝酸银做了抑菌效果比较,结果表明头孢曲松钠(200mg/L)
不仅效果好而且价格便宜可以作为 AGL1菌株的抑菌剂。
3.4 存在问题
只应用单一的菌株进行转化研究,不同基因型的亚麻是否存在对不同菌株敏感性的不同影响其转化
率,还有待于研究。另外,受体系统还存在转化率低的问题,主要原因是下胚轴的切口面积较小导致转化部
位小。尝试适当的方法(如对下胚轴剥皮及刻伤处理)提高转化率仍是需要继续研究的问题。
参考 文献
1 苑志辉.兔防御素 NP-1基因在亚麻抗枯萎病方面的研究.硕士学位论文,中国农业大学生物学院,2005年.
2 王玉富,周思君,等.中国麻作,2000,22(3):25～27.
3 姬妍茹,等.生物技术通报,2005,(3):41～46.
4 王关林,方宏筠.植物基因工程原理与技术.北京:科学出版社,1998,585～586.
PRRSV血液抗体间接ELISA检测方法的建立
中国动物卫生与流行病学中心陈义军与扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室彭长凌等科研专家用
亲和层析纯化的猪繁殖与吸入综合征病毒PRRSV重组核衣壳蛋白GST-N作为诊断抗原,建立检测PRRS血清抗
体的间接ELISA方法。抗原最佳包被量为每孔400ng,待检血清最佳稀释度为1∶100,待检血清样品的D490nm≥
0.43DPOS+0.57Dneg判为阳性,反之判为阴性。对采自 14个猪场的 364份猪血清样品进行检测,PRRS阳性率为
51.4%,略高于HerdChekELISA的阳性检出率49.7%。此与HerdChekELISA相比,间接ELISA的敏感性为
94.5%,特异性为91.3%,总符合率为92.9%,Youden指数为0.86。这证明该方法有良好的重复性,它不与猪瘟、猪
伪狂犬病阳性血清发生反应。此方法与美国IDEXX公司的HerdChekELISA试剂盒进行平行检测,其结果与该
国的结果相符。为此他们创造的方法为我国PRRS的防制工作做出了重大贡献,同时此方法的完善和组装将具有
良好的应用前景和推广价值。 秦春圃
·信息交流·
"""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""""
132