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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 7 期
大豆种皮过氧化物酶的制备及其在 ELISA中的应用
江均平1 王金静1 张涛2 温栾1 韩志琴1
(1中国农业科学院农产品加工研究所，北京 100094;2中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081)
摘 要: 对大豆种皮过氧化物酶(SBP)进行了部分纯化，并对其标记的抗体的效价和稳定性进行了初步测定。大豆种
皮用自来水提取，提取液经 pH4. 5 沉淀去杂蛋白、DEAE-cellulose 离子交换柱层析以及 Sephadex G-75 分子筛柱层析，最后冻
干得 SBP制品。用 SBP冻干品标记羊抗人 IgG，于 － 20℃和室温保存 2 周，前者稀释 8 000 倍、后者稀释 2 000 倍可产生较强
的信号。结果表明 SBP可以用于酶联免疫检测。
关键词: 过氧化物酶 酶联免疫检测 大豆
Preparation of Thermostable Soybean Coat Peroxidase and
Its Application in ELISA
Jiang Junping1 Wang Jinjing1 Zhang Tao2 Wen Luan1 Han Zhiqin1
(1 Institute of Agro-Food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100094;
2 Institute of Crop Science，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081)
Abstract: Soybean coat peroxidase(SBP)was prepared from soybean coat，the activity and thermostablility of sheep anti-human
IgG linked with SBP have been tested． SBP was extracted from soybean coat with tap water and purified by treatment at pH4. 5，DEAE-
cellulose and Sephadex G-75 chromatography． The specific activity of the purified SBP was about 1 500 U /mg with 56. 0% recovery．
The purified SBP was used to label sheep anti-human IgG，the activity of SBP-IgG was tested by Double-antibody Sandwich ELISA． IgG
conjugated with SBP yielded detectable signal in ELISA at 8 000 folds-dilution after 2 weeks-storage at － 20℃and at 2 000 folds-dilu-
tion at room temperature． The results demonstrated that SBP preparation from Chinese soybean was available in ELISA．
Key words: Peroxidase ELISA Soybean
收稿日期:2009-12-29
基金项目:云南省科技计划项目(2007AD003)
作者简介:江均平，理学博士，副研究员，硕士生导师，E-mail:jiangjunping@ yahoo. com. cn
酶是酶联免疫检测的必需组成部分［1］，目前
90%以上的酶联免疫试剂盒所使用的酶是辣根过氧
化物酶(HRP) ，但 HRP来源有限、价格贵，并且高温
条件下不稳定［2］。
大豆种皮含有大量过氧化物酶(soybean seed
coat peroxidase，SBP)［3］，该酶具有如下特点:热稳定
性好［4 － 6］，在 pH2. 5 － 12. 0 之间都较稳定，失活温
度达 90. 5℃;作用 pH范围宽，从 pH2. 5 － 10. 0 均具
有催化活性［7］;豆皮中 SBP 含量占总可溶性蛋白的
5% －10%，作为一种同工酶占绝对优势［3，8，9］，容易
纯化、质量容易保持稳定;大豆原料丰富、贮运方便，
存放 3 年仍保持较高的 SBP 酶活力［8］。美国印第
安那州作物改良委员会于 1996 年特许 Enzymol In-
ternational Inc． 和 American Qualex 两家公司将其用
于医药诊断试剂盒的生产。但是到目前为止国内外
还未见 SBP用于 ELISA的研究报道。
前期研究报道了我国大豆 SBP 的酶活力、热稳
定性及同工酶等特性［10］，本研究旨在对其中一种热
稳定性较好的 SBP 进行了部分纯化并成功用于酶
联免疫检测。
1 材料与方法
1. 1 材料
大豆材料由辽宁省农科院作物所王文斌研究员
提供。
1. 2 试剂
DEAE-celluloseDE-52 为 Whatman 产品;Sepha-
2010 年第 7 期 江均平等:大豆种皮过氧化物酶的制备及其在 ELISA中的应用
dex G-75 为 Pharmacia产品;辣根过氧化物酶(HRP，
RZ值为 3. 0)为 Roche 产品;愈疮木酚为南开大学
精细化学实验厂产品;过氧化氢为北京化工厂产品;
邻苯二胺(OPD)、过碘酸钠、硼氢化钠、碳酸钠均为
分析纯。
1. 3 仪器
紫外可见分光光度为WFZ800-D3A(北京) ;精密
恒温水浴锅为 TU-20DTEMPUNIT(美国 TECHNE)。
1. 4 SBP的制备
豆皮按 1 ∶ 15 加自来水于室温(20 － 25℃)浸
泡 1 h，以 10 000 r /min 匀浆 3 次(30 s /次) ，室温
搅拌 2 h，白棉布过滤;滤液用 2 mol /L 醋酸调至
pH4. 5，静置 2 h 后以 4 000 r /min 离心 30 min;离
心上清液用 2 mol /L 醋酸钠调至 pH6. 0，上 DEAE-
cellulose柱(先用 20 mmol /L、pH6. 0 醋酸缓冲液平
衡) ，分别用 2 倍床体积 pH4. 5、pH4. 2、pH3. 7 醋酸
缓冲液(50 mmol /L)洗柱，最后用 1 mol /L NaCl 溶
液洗脱，分步收集，检测酶活性，合并高酶峰，再上
Sephadex G-75 柱，用 0. 1 mol /L乙酸铵洗脱，合并酶
峰，冻干。
1. 5 酶活力测定
按文献［11］所述方法进行，每分钟产生 1 μmol
4-邻甲氧基苯酚所需要的酶量为 1 个活力单位
(U)。
1. 6 蛋白质含量测定［11］
取 0. 1 mL样品液，加入 5. 0 mL 考马斯亮蓝溶
液，混匀，静置 2 min 后测定 595 nm 吸光值。用牛
血清白蛋白做标准，计算蛋白质含量。
1. 7 改良碘酸钠法标记抗体［12］
IgG粗提液于 4℃下用 0. 2 mol /L、pH9. 5 碳酸盐
缓冲液中透析干净，并将蛋白浓度调整至2 mg /mL。
IgG浓度(mg /mL)= OD280 × 1. 45 － OD260 × 0. 74，或
OD280 ×1. 4。
取 2 mg HRP或 SBP溶于 1 mL 重蒸馏水中，加
入 200 μL 0. 1 mol /L 过碘酸钠，室温避光氧化
20 min(或于 4℃，轻搅 30 min) ，4℃下对 1 mmol /L、
pH4. 4 醋酸钠缓冲液透析过夜，加入 20 μL pH9. 5、
0. 2 mol /L NaCO3缓冲液使溶液 pH提升至约 9 －
9. 5，立即加入 2 mg 待标记 IgG(溶液体积不超过
1 mL) ，室温避光放置 2 h(或 4℃ 过夜) ，加入
100 μL新鲜配制的 NaBH4(4 mg /mL) ，4℃静置 2 h，
4℃下对 0. 01 mol /L PB 0. 15 mol /L NaCl(pH7. 4)
透析 24 h，换液 1 － 2 次(此时若有沉淀可低速离
心除去) ，收集标记抗体，用 PEG8000 浓缩，加入
0. 5%免疫组化级 BSA、0. 05%的硫柳汞，取 10 μL
分装于 50 μL 容量的离心管中，分别于 － 20℃和
室温(20 － 28℃)放置 2 周，用于测定 SBP-IgG 的
稳定性。
1. 8 双抗夹心 ELISA法进行酶标抗体效价测定［13 ］
1. 8. 1 抗体包被酶标板 用 pH9. 6、0. 2 mol /L 碳
酸盐缓冲液将羊抗人 IgG 稀释成 1 μg /mL，每孔加
100 μL，4℃过夜;每孔用 200 μL 洗涤液(pH7. 4
0. 01 mol /L PBS + 0. 5 mL /L Tween-20)洗涤 5 次，每
次 3 min，拍干。
1. 8. 2 胎牛血清处理 每孔加 200 μL 5%胎牛血
清(pH7. 4、0. 01 mol /L PBS稀释) ，37℃ 2 h;如上洗
涤、拍干。
1. 8. 3 抗原结合 隔孔加入 100 μL 1∶ 16 稀释人
血清(用 pH7. 4、0. 01 mol /L PBS 稀释) ，37℃ 2 h;
如上洗涤、拍干。
1. 8. 4 酶标抗体处理 酶标抗体(1 mg /mL)用
PBS(pH7. 4、0. 01 mol /L)按 1 ∶ 1 000、1 ∶ 2 000、1∶
4 000、1∶ 8 000、1∶ 10 000 及 1∶ 12 000 稀释，然后加
入酶标板中，100 μL /孔，37℃保温 1 h;如上洗涤、拍
干。
1. 8. 5 显色 每孔加入 100 μL OPD 显色液(4 mg
OPD，4. 86 mL 0. 1 mol /L柠檬酸，5. 14 mL 0. 2 mol /
L Na2HPO4，50 μL 30%H2O2) ，37℃ 保温 10 min，然
后加入 200 μL 2 mol /L H2SO4终止反应。
2 结果与分析
2. 1 SBP的制备
10 g大豆种皮经浸泡提取、pH4. 5 去杂、DEAE-
cellulose及 Sephadex G-75 柱层析，最终得到 3. 7 mg
SBP。SBP 纯化 18. 0 倍，回收率 56%，比活达到
1 508. 1 U /mg(表 1) ，RZ(A403 /A280)值约为 1. 8，比
活约为商品 HRP的 80%。
111
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 7 期
表 1 大豆种皮过氧化物酶纯化表纯化步骤
纯化步骤
总蛋白质
(mg)
总活力
(U)
比活力
(U /mg)
纯化
倍数
回收率
(%)
pH6. 5 提取液 120. 9 10105. 2 83. 6 1 100
pH4. 5 上清液 8. 5 8354. 9 985. 2 11. 8 82. 7
DEAE-cellulose 5. 5 6663. 3 1192. 0 14. 3 65. 9
Sephadex G-75 3. 7 5663. 8 1508. 2 18. 0 56. 0
2. 2 SBP标记抗体的催化活性及稳定性
用 SBP标记的羊抗人 IgG 抗体的催化活性及
稳定性结果如图 1。SBP 标记的羊抗人 IgG 抗体
分别于 － 20℃和室温下保存两周，前者稀释 8 000
倍、后者稀释 2 000 倍均可见明显的黄色检测信
号，表明 SBP 可以用于酶联免疫检测。用 SBP 标
记的抗体其酶活性比 HRP 标记的抗体约低
1. 5 倍。
图 1 SBP标记 IgG 的活性
3 讨论
本研究结果表明 SBP 用于酶联免疫检测是可
行的，但与 HRP 相比，SBP 标记抗体的酶活性约低
1. 5 倍。酶活性低的原因可能有 3 个:1)SBP 的纯
度低，本研究制备的 SBP 其 RZ 值为 1. 8，而商品
HRP的 RZ值为 3. 0，SBP 相对比活约为商品 HRP
的 80%;2)酶标条件采用的是 HRP的方法，对 SBP
来说可能不是最适条件;3)酶学特性所致。因此，
要进一步提高 SBP 酶联免疫检测水平可以通过提
高酶的纯度、优化酶标条件、筛选高效底物以及优化
酶显色的条件(如提高反应温度)来实现。
参 考 文 献
［1］Tijssen P． Practice and Theory of Enzyme Immunoassay． Elsevier，
Amsterdam，1985，173-219．
［2］Chattopadhyay K，Mazumdar S． Structural and conformational stabili-
ty of horseradish peroxidase:effect of temperature and pH． Biochem-
istry，2000，39:263-270．
［3］Buttery BR，Buzzell RI． Peroxidas activity in seeds of soybean varie-
ties． Crop Science，1968，8:722-725．
［4］刘稳，方靖，高培基．豆壳过氧化物酶的分离纯化及其性质研究．
中国生物化学与分子生物学报，1998，5:577-582．
［5］McEldoon JP，Dordick JS． Unusual thermal stability of soybean per-
oxidase． Biotechnol Prog，1996，12:555-558．
［6］Kamal JK，Behere DV． Activity，stability and conformational flexibil-
ity of seed coat soybean peroxidase． J Inorg Biochem，2003，94(3) :
236-242．
［7］Nissum M，Schiodt CB，Welinder KG． Reactions of soybean peroxi-
dase and hydrogen peroxide pH 2． 4-12． 0，and veratryl alcohol at
pH 2． 4． Biochim Biophys Acta，2001，545(1-2) :339-348．
［8］Gillikin JW，Graham JS． Purification and developmental analysis of
the major anionic peroxidase from the seed coat of Glycine max．
Plant Physiol，1991，96:214-220．
［9］Cijzen M，van Huystee R，Buzzell RI． Soybean seed coat peroxidase a
comparison of high-activity and low-activity genotypes． Plant Physi-
ol，1993，103:1061-1066．
［10］江均平，王金静，段苍风，等．我国大豆种皮过氧化物酶的酶活
性及热稳定性研究．中国粮油学报，2006，5:63-67．
［11］Bradford MM． A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye
binding． Anal Biochem，1976，72:248-254．
［12］巴德年．当代免疫学技术与应用．北京:北京医科大学中国协和
医科大学联合出版社，1998:451-456．
［13 ］朱立平，陈学清． 免疫学常用实验方法． 北京:人民军医出版
社，2000:342-358．
211