全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-05-30
基金项目：863 探索类项目（2006AA10Z449），江苏省六大人才高峰计划
作者简介：陈其亮（1981-），男，硕士研究生，研究方向：蛋白质的分离纯化；E-mail:cqiliang@126.com
通讯作者：金坚,男，博导，教授，研究方向:细胞与分子药理学;Tel:0510-85918219，E-mail:jinjian31@126.com
胰高血糖素样肽（GLP-1）属于肠肽激素，主要由末端空肠、回肠和结肠的朗罕氏细胞所分泌，是胰高血
糖素原基因翻译后的加工产物， 酶解去掉 N 端的 6 肽和 C 端酰胺化后即生成具有高度活性的 GLP-1（7-
36）NH[1~3]。 GLP-1 对胰岛 β 细胞的分化、增殖均起重要作用，包括抑制 β 细胞凋亡、刺激 β 细胞增生和诱
导干细胞分化为胰腺内分泌细胞，从而使被破坏的胰岛细胞恢复分泌胰岛素的功能，对糖尿病的治疗产生
作用 [4，5]。 但研究发现在体内存在一种二肽基肽酶（dipeptidy1 protease Ⅳ，DPP-Ⅳ）对 GLP-1 有很强的水解
作用，使得 GLP-1 在体内的半衰期不足 5min，其新陈代谢的速率仅为 12～13min[6，7]。故可以利用基因工程手
段改变其结构并与人血清白蛋白（HSA）融合表达，从而延长 GLP-1 在体内的半衰期 [8，9]。
为了延长胰高血糖素样肽-1（GLP-1）在体内的半衰期 ，前期构建了基因工程重组菌株 Pichia Pastoris
重组胰高糖素样肽-1融合蛋白的纯化及其活性测定
陈其亮 窦文芳 雷楗勇 王一君 张立操 张文婷 陈蕴 张莲芬 金坚
（江南大学医药学院分子药理研究室，无锡 214122）
摘 要： 主要探讨了发酵液中融合蛋白rh（GLP-1A2G）2-HSA的分离纯化过程。发酵上清液经超滤浓缩、离子交换层
析、凝胶过滤分离得高纯度的rh（GLP-1A2G）2-HSA。纯化样品经SDS-PAGE检测为单一条带，HPLC分析纯度达98%，125I标
记后用TCA沉淀法测定放射性纯度达97%，符合药效学和药代动力学研究的需要，整个纯化过程回收率达到48.5%。通
过细胞增殖实验表明纯化后的rh（GLP-1A2G）2-HSA具有类似GLP-1的促胰岛β细胞增殖活性，说明该分离过程保护了
融合蛋白rh（GLP-1A2G）2-HSA的生物活性。通过融合蛋白rh（GLP-1A2G）2-HSA的纯化方法，可获得高纯度的重组融合蛋白
rh（GLP-1A2G）2-HSA，为进一步的药效学和药代动力学研究奠定了基础。
关键词： 胰高糖素样肽-1 融合蛋白 纯化 活性测定
Purification and Identification of Recombinant
Protein rh（GLP-1A2G）2-HSA
Chen Qiliang Dou Wenfang Lei jianyong Wang Yijun Zhang Licao
Zhang Wenting Chen Yun Zhang Lianfen Jin Jian
（Laboratory of Molecular Pharmacology，School of Medicine and Pharmaceutics，Jiangnan University，Wuxi 214122）
Abstract： This research mainly dealt with purification of recombinant protein rh（GLP-1A2G）2-HSA from ermentation
broth. Highly purified rh （GLP-1A2G）2-HSA was separated from fermentation broth by ultrafiltration concentration，ion
exchange chromatography and gel filtration. The purified product was conformed as one single band by SDS-PAGE and
the purity was identified as 98% by HPLC while radioactive purity was identified as 97% by TCA deposition method
after marked with125I. The purity of rh（GLP-1A2G）2-HSA met the requirement of drug activity and drug metabolism
research. The total recovery yield reached to 48.5%. Cell proliferative assay showed that the activity of rh（GLP-1A2G）2-
HSA remained well during the process of purification，while the purified product had similar proliferative activity of islet
β-cell with GLP-1. Highly purified rh （GLP-1A2G）2-HSA could be gained by this purification method and layed a
foundation for advanced drug activity and drug metabolism research.
Key words： Human serum albumin Purification Glucagon-like peptide-1 B oactivity assay
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
KM71/（GLP-1A2G）2-HSA，并实现了融合蛋白 rh（GLP-1A2G）2-HSA 在胞外高表达；为了进一步研究其药效学和
药代动力学， 需要建立一个完善的分离纯化的工艺。 主要研究了毕赤酵母高效表达的 rh（GLP-1A2G）2-HSA
的分离纯化和其对胰岛 β 细胞的促增殖试验，为进一步的药效研究和实现 rh（GLP-1A2G）2-HSA 的大规模制
备奠定了基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 试剂 Q-Sepharose 和 Sephacryl S-200 （16mm×60cm） 预装柱均为 Pharmacia 公司产品 ，Bradford
reagent 购于上海生工生物工程有限公司，尿微量白蛋白试剂盒为上海名典生物工程有限公司产品，其它试
剂均为国产分析纯。
1.1.2 仪器 冷冻离心机为 LABCONCO 公司产品，电泳仪为 BIO-RAD 公司产品，超滤设备为 Millipore 公
司产品、分光光度计为美国尤尼柯公司产品，放射性检测仪器为苏州大学提供，放射性 NaI125 中国原子能研
究院提供，AKTA 蛋白纯化分析系统为美国安玛西亚公司产品。
1.1.3 菌种与细胞株 重组 Pichia Pastoris KM71/（GLP-1A2G）2-HSA 由江南大学医药学院分子与药理实验
室保存。 胰岛 β 细胞由复旦大学卢大儒教授馈赠。
1.2 方法
1.2.1 超滤浓缩 发酵液经过 10 000r/min，15min 离心除菌后取上清液 500ml 一次性加入超滤杯中，超滤
膜截留分子量为 10 000kD。待超滤至 25ml 时，加入 25ml 无菌水继续超滤至 25ml，重复 2 次后收集截流液。
1.2.2 Q-Sepharose 离子交换层析 样品以 50mmol/L（pH6.5）磷酸盐缓冲液透析后上以同样缓冲液平衡后
的 Q-Sepharose 柱，上样流速为 3ml/min，洗脱流速为 5ml/min。 分别用含 0.1、0.2mol/L NaCl 的平衡缓冲液进
行阶段洗脱，收集在紫外 280nm 下蛋白吸收峰。将 Q-Sepharose 洗脱下来的目标蛋白活性峰冷冻干燥，最后
采用 1mol/L NaCl 溶液洗脱吸附于柱上的残留蛋白和色素。
1.2.3 Sephacryl S-200 凝胶过滤 复溶洗脱干燥组分上 Sephacryl S-200 柱（16mm×60cm）凝胶过滤 ，上样
液蛋白浓度为 25mg/ml，上样量为 2.0ml，流速为 0.8ml/min，复溶和过滤缓冲液同为 20mmol/L（pH7.0）磷酸
盐。
1.2.4 蛋白纯度分析 （1）SDS-PAGE 电泳分析： 蛋白纯化过程中的样品纯度用 12％ SDS-PAGE 电泳分
析。 （2）HPLC 分析：色谱柱 TSK-GELG3000SWXL（30cm×7.8mm），流动相为含 0.15mol/L NaCl 的 0.02mol/L
（pH7.0）磷酸盐缓冲液，流速为 0.8ml/min，SPD-10AV 紫外检测器，检查波长为 280 nm。（3）放射性化学纯度
测定：纯化的最终样品以氯氨-T（Chloramine-T）法标记 125I 测定放射性纯度，rh（GLP-1A2G）2-HSA 5μg，0.1mol/
L（pH7.5）PB 10μl 和 NaI 125100μCi/μl 3μl 混合后，加入 10μl 新配置的氯氨-T 5μg/μl（0.1mol/L PB，pH8.0）
后迅速振荡混匀，室温下反应 40s；加入 100μl 偏重亚硫酸钠 20μg/μl（0.1mol/L PBS，pH7.5），以终止碘化反
应；将碘化反应混合液上 Sephadex G-25（10mm×50mm）柱，洗脱液为含 2%牛血清白蛋白的 PBS（pH7.5）缓
冲液，每 0.5ml 分步收集。 测定各收集管的放射性，取蛋白峰中放射计数最高峰前二管，加入 2.5ml 30%三
氯乙酸振荡混匀后 4 000r/min，离心 20min，吸去上清并测定沉淀的放射性计数。
1.2.5 rh（GLP-1A2G）2-HSA 的 western blot 鉴定 以鼠抗人 GLP-1 抗体和兔抗人 HSA 抗体为一抗进行 western
blot 分析，试验方法见参考文献[9]。
1.2.6 rh（GLP-1A2G）2-HSA 的活性测定 目标蛋白的活性测定采用胰岛 β 细胞增殖试验。 方法如下：新鲜
胰岛 β 细胞培养过夜后，铺于 96 孔板中（6.0×104 cells/ml），每孔加 200μl RPMI1640 培养基（含 10%胎牛血
清、100U/ml 青霉素、100μg 链霉素、2.0mmol/L 谷氨酰胺），5% CO2，37℃，饱和湿度恒温培养箱中常规培养。
24h 后换成含不同浓度 （10nmol/L、20nmol/L、30nmol/L 、40nmol/L、50nmol/L）GLP-1 标准品和 rh（GLP-1A2G）2-
HSA 的 RPMI1640 培养基， 每个药物浓度设 6 孔重复， 并设不含细胞的空白调零和不含药物的 RPMI1640
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培养基作为空白对照组。培养 48h 后小心吸出培养基，每孔加入 0.5%（W/V）MTT 100μl，37℃ 孵育 4h，吸弃
培养基，每孔加入 100μl DMSO，振荡溶解，测 A490，并计算细胞增殖率 PR=（A-A0）/A0×100%（A 为药物孔的
吸光度值，A0 为空白对照孔的吸光度值）。
2 结果
2.1 超滤浓缩
采用 Millipore 公司截留分子量为 10 000kD 的超滤膜， 在纯化过程中计算得出白蛋白回收率达 79%。
经过 2 次重复加水超滤脱色，测定 OD600 可知过程中去除色素达 50%，整个过程浓缩倍数为 20 倍。
2.2 Q-Sepharose 离子交换层析
样品经平衡缓冲液透析后上样，在上样条件下目标蛋白能较好的吸附于 Q-Sepharose，在流穿峰Ⅰ中没
有检测出目标蛋白，用 0.lmol/L NaCl 洗脱得到目的蛋白峰（图 1 中的峰Ⅱ），0.2mol/L NaCl 洗脱得到杂蛋白
峰（图 1 中的峰Ⅲ），1mol/L NaCl 洗脱出结合在柱上的色素（图 1 中的峰Ⅳ）。 收集融合蛋白活性峰，去离子
水透析后冷冻干燥，-20℃保存备用。
2.3 Sephacryl S-200 凝胶层析
采用 Pharmacia 公司的 Sephacryl S-200 预装柱进行分离， 结果在紫外 280nm 下出现 3 个蛋白吸收峰，
经检测目标蛋白在Ⅲ峰中（图 2）。 收集目标蛋白峰冷冻干燥，-20℃保存备用。
图 1 The ion exchange chromatography of rh
（GLP-1A2G）2-HSA on Q-Sepharose
图 2 The gel filtration of rh （GLP-1A2G）2-HSA
on Sephacryl S-200
2.4 rh（GLP-1A2G）2–HSA 纯化过程及纯度测定
整个纯化过程以 Bradford 法测定总蛋白含量，以尿微量白蛋白试剂盒测定白蛋白含量。 在所有条件最
优化的条件下，整个纯化过程中 rh（GLP-1A2G）2-HSA 浓度和回收率等变化如表 1 所示。
表 1 rh(GLP-1A2G)2-HSA 纯化过程
对纯化的样品采用 SDS-PAGE 电泳和 HPLC 检测，SDS-PAGE 电泳检测纯化后的 rh（GLP-1A2G）2-HSA 为
单一条带（图 3）。 HPLC 分析主峰纯度高于 98%（图 4）。 用 125I 放射性标记测定放射性纯度达 97%。 表明发
酵液中的 rh（GLP-1A2G）2-HSA 采用上述分离方法进行纯化取得了比较理想的分离效果，符合进一步药效学
和药代动力学的要求。

(mg/L) rh(GLP-1A2G)2-HSA(mg/L)  (%)  (ml)   (%)

 328.1 210.0 64 1.0 500 100 100
 237.0 165.9 70 1.1 25 79 79
Q-sepharose 135.3 121.8 90 1.4 18 74 58.5
Sephacryl S-200 104.0 101.9 98 1.5 25 83 48.5

陈其亮等：重组胰高糖素样肽-1融合蛋白的纯化及其活性测定 149
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图 4 HPLC analysis of the purified
rh（GLP-1A2G）2-HSA
图 3 SDS-PAGE analysis for fusion protein rh （GLP-
1A2G）2-HSA in its purification process
2.5 rh（GLP-1A2G）2-HSA 的 western blot 鉴定
rh（GLP-1A2G）2-HSA 同时含有 GLP-1 和 HSA 肽序列，这使得它可以和 GLP-1 和 HSA 两种抗体发生交
叉反应，故可以使用 Western-blot 来鉴定表达产物是否为杂合分子。图 5 所示，泳道 2 使用 GLP-1 的单抗进
行杂交，泳道 3 用 HSA 的抗体进行杂交。 此外，在约 73kD 的地方出现与 GLP-1 和 HSA 抗体发生特异性反
应的条带，表明表达的融合蛋白同时具有 GLP-1 和 HSA 的抗原性，为 GLP-1 和 HSA 的杂合分子。
2.6 rh（GLP-1A2G）2-HSA 的活性测定
随着 GLP-1 标品浓度的增加，细胞数量也逐步增加，GLP-1 标品浓度 30nmol/L 时其促细胞增殖作用最
强，增殖率达 31%。 rh（GLP-1A2G）2 -HSA 平均增值效率是 GLP-1 标品的 1.12 倍，其对胰岛原代 β 细胞增殖
的影响与 GLP-1 相似，但其浓度在 40nmol/L 时对细胞增殖作用最强，增殖率达 35%（图 6）。
图 5 Western blot analysis of rh（GLP-1A2G）2-HSA 图 6 Different concentrations of GLP-1 and rh（GLP-
1A2G）2-HSA induced β-cell proliferation
3 讨论
GLP-1 的药物研究无疑具有良好的科学价值和潜在的市场前景， 但因 GLP-1 在体内的半衰期仅数分
钟而大大降低了它的临床应用价值。 目前开发重点在抵抗 DPP-Ⅳ水解酶 GLP-1 类似物的研究， 丹麦、美
国、法国等都已有相关药物进入 3 期临床。 在国内已有报道通过构建重组菌株获得 GLP-1/HSA，但是其易
被蛋白酶降解和低活性问题仍没有得到解决。 为了防止 DPP-Ⅳ水解酶的降解和 HSA 对 GLP-1 活性部位
的掩盖，试验中将 DPP-Ⅳ对 GLP-1 的水解部位进行了突变并以串联体的形式与 HSA 进行融合，构建了重
组菌株 Pichia Pastoris KM71/（GLP-1A2G）2-HSA， 该表达系统已在 5L 发酵罐水平成功表达了融合蛋白 rh
（GLP-1A2G）2-HSA，表达量达到 230mg/L。
M：Protein marker；1:Supernatant
of fermentation broth；2：ultrafil-
tration concentration；3：Purified
rh （GLP-1A2G）2-HSA by Q-
Sepharose ion exchange chro-
matography；4：Sample of peak
IV in Q-Sepharose ion exchange
chromatography
1：Protein marker；2：band of GLP-1 antibody；
3：Band of HSA antibody
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（上接第 146页）
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
会产生 RNase 污染问题
综上，最新采用融合绿色荧光蛋白表达 miRNA 以及 RT-PCR 的检测等方法，为 microRNA 功能研究提
供了良好的技术平台。
参考文献
1 Chen CZ，et al.Science，2004，303：83~86.
2 Ambros V.Nature，2004，431：350~355.
3 Lim LP，et al.Nature，2005，433：769~773.
4 Lecellier CH，et al.Science，2005，308：557~560.
为了药物蛋白的进一步研究，对蛋白纯化路线进行了摸索。研究中发现在超滤过程中蛋白损失主要发
生在超滤初期，而且随着总超滤体积的增加蛋白的总回收率呈增加趋势，分析得出超滤膜对蛋白的吸附是
蛋白损失的主要原因。 为了减少超滤膜对目标蛋白的吸附，可先以白蛋白对膜进行饱和处理。 因超滤浓缩
后的发酵液中仍然含有较多色素，使得 Q-Sepharose 离子交换过程中蛋白的吸附量大大降低，如何有效去
除色素提高分离效率是今后研究的一个重点。 经超滤和 Q-Sepharose 两步分离得到纯度为 90%左右的蛋
白，通过进一步的条件优化有望得到符合临床要求的高纯度药用蛋白。 为了进一步的药代研究，需获得放
射化学纯度达 95%的高纯蛋白，采用 Sephacryl S-200 对蛋白进行了精细分离。 研究中发现该步分离能有效
去除 2 个大于目标蛋白分子量的杂蛋白，最终测定得放射化学纯度达 97%，符合药代动力学研究需要。
纯化后的 rh（GLP-1A2G）2-HSA 活性测定结果表明，rh（GLP-1A2G）2-HSA 具有天然 GLP-1 的促胰岛 β 细胞
增殖活性，说明试验中分子设计符合理论预测，在整个分离纯化过程中蛋白的活性得到了较好的保护，为
进一步研究和开发能够用于糖尿病临床治疗的长效 GLP-1 类似物奠定了基础。
参考文献
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