全 文 ：2008年第2期
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·综述与专论·
收稿日期:2007-09-30
作者简介:邢树礼(1983-),男,山东临沂人,硕士,研究方向:药物剂型研究
通讯作者:赵帅(1983-),男,硕士研究生;E-mail:qustzhaoshuai@163.com
序言
Mt化学名为金属硫组氨酸三甲基内盐,广泛
存在于生物中的低分子量,富含半胱氨酸,并能被
金属诱导的金属结合蛋白[1]。由于它具有高的金属
容量和特殊的生物结构,在金属蛋白中,它的作用
比较显著。近年来,人们对它的研究日益深入,实验
证明,Mt与体内微量元素的储存,转运和代谢,机
体的生长发育,衰老及某些疾病有关。此外,它还可
以清除自由基,拮抗电离辐射,解毒重金属。目前,
人们发现在生长的哺乳细胞中含有大量的 Mt,它
可能与致癌基因的产物相似,例如 a-胎蛋白[2]。
1 Mt的分类和性质
它在哺乳动物中有 4种 Mt异构体即 Mt-1,
Mt-2,Mt-3,Mt-4。其中,Mt-1和 Mt-2存在于所有
器官中,Mt-3存在于脑组织中,Mt-4仅发现在鳞状
上皮组织中。Mt是有一组基因编码构成的,它包括
10个官能团亚型[3]。Mt-2A基因编码 Mt-2蛋白,而
Mt-1蛋白是由一系列 Mt-1基因编码而成。Mt在细
胞的生长和分化过程中发挥着重要的作用,在生长
的组织和赘生细胞中它的含量较高[4]。
Mt与二价金属离子具有高亲和性,它的分子
量都为 6~7kDa,比一般蛋白质分子量低,Pi为 3.9~
4.6,哺乳动物的 Mt一般为 61~62个氨基酸残基,
组成的多肽链中含有 20个 Cys,约占全部氨基酸的
1/3,有 6~8个 Lys,7~10个 Ser[5]。它含有巯基,可以
结合一定量的重金属,保护细胞和组织免受重金属
金属硫蛋白的功能及应用前景
邢树礼 王洪光 赵帅
(青岛科技大学化工学院,青岛 266042)
摘 要: 金属硫蛋白(Mt)是科学家margoshes和valee发现的,它是一种低分子量,富含半胱氨酸可结合重金属的
蛋白质,与调节细胞生长与增殖的金属调节蛋白有关,分布在哺乳动物组织器官中。人们为了能清肿瘤产生的过程,尝试
了各种生物标记物,例如,癌基因、p53抑癌基因、waf1蛋白质、多育细胞核抗原、端粒转移酶、小随体标记物。人们发现在
人类各种肿瘤中都有分泌Mt,因此它也可以作为生物标记物。人们对Mt的检测是利用免疫组织化学的方法,将肝切片
放置在用石蜡密封的冷丙酮中保藏,用抗生物素蛋白链菌素免疫过氧化物酶的方法进行检测。
关键词: 金属硫蛋白 癌基因 免疫组织化学检测法 金属调节蛋白
FunctionsandAppliedProspectsofMetalothionein
XingShuliWangHongguang ZhaoShuai
(ColegeofChemicalEngineering,QingdaoUniversityofScienceandTechnology,Qingdao266042)
Abstract: Metalothioneins (MTs)werediscoveredin1957byMargoshesandValeeandidentifiedaslow-
molecularweightandsulphydrylrichproteins.Itisnotsurprisingthatmostmammaliantisuescontainagerelatedbasal
levelsofMTssincetheyareinvolvedinmetaloregulatoryprocesesthatincludecelgrowthandmultiplication.Inan
eforttounderstandthebiologyofthisintriguingtumor,variousbiomarkerssuchasoncogenes,p53tumorsuppresor
gene,waf1protein,proliferatingcelnuclearantigen,telomerase,andmicrosatelitemarkersandhavebeenexamined.
Metalothioneins (MTs)whichhasrecentlyshowntobeexpresedinvarioushumantumors.Immunohistochemical
detectionofMT proteinsincoldacetone-fixedparafinembeddedliversectionswasperformedbythestreptavidin-
avidin-biotinimmunoperoxidasecomplexmethod.
Keywords: MetalothioneinsOncogenesImmunohistochemicaldetection Metaloregulatoryprotein
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第2期
的毒害。此外,Mts含有大量细胞必需的重金属,如
锌,铜。Mt中巯基可以与金属离子可逆结合,便于
金属离子在机体组织的交换。它存在与不同类型的
真核生物中,可以作为抗氧化剂清除自由基,降低
自由基对细胞的毒害。
2 Mt与肿瘤
癌变的过程是一个动态的过程,在此过程中基
因的功能也发生了改变,时间是一个关键的因素,
癌变的潜伏期几年甚至几十年,细胞中的遗传物质
遭到癌变部分的持续进攻,当癌变部分积累到一定
的程度时,基因的功能发生变化,导致突变的细胞
无限繁殖。然而,大部分癌变的部分在前期并不会
进一步恶化,反而会自动消失,这可能说明肿瘤的
产生还与其它因素有关[6]。
Mt与二价金属离子具有高的亲和力,多项研
究表明,在正常增殖的细胞和癌细胞中,Mt的含量
显著增加。Mt的高表达与癌细胞的生长有关。Mt的
亲核性可以降低抗癌药物产生的亲电性对细胞的
毒性效应,而 Mt与细胞之间并不是通过简单的共
价键结合的[7]。
研究表明,将细胞暴露在抗癌药物中,提高 Mt
的表达量可以诱导细胞产生抗凋亡作用,而在缺乏
Mt的细胞中,细胞的死亡率明显提高。在人乳腺癌
细胞系细胞中,降低 Mt的量,发现不仅可以抑制细
胞的生长,还能诱发细胞的凋亡[8]。
在正常的细胞中,Mt的表达量与对重金属离
子的解毒量,细胞内微量元素的含量,自由基的清
除量有关。Tridip和 Thirumoorthy研究发现肝中微
量元素的变化,ki-67和 Mt的表达量都可以作为癌
症产生的先导标记物,0.5mg/kg的钒可以抑制 2-AAF
诱发肿瘤。Mt蛋白质和 ki-67蛋白质的过量表达也
与致癌的过程有关。在无癌变的大鼠肝脏中,钒可
以抑制 ki-67和 Mt的表达量。人们已经开始对 P53
表达过程中钒的作用以及肿瘤的诱导过程进行重
点研究[9]。此外,Mt可以作为浸润性导管癌,皮肤
癌,乳腺癌的检测标记物。
3 Mt与人类病理生理学过程的关系
3.1 Mt的解毒作用
Mt有稳定细胞内环境和对重金属的解毒作
用。研究表明,Mt可以清除活性氧的代谢物,特别
是羟基。当细胞中的抗氧化剂代谢失衡时,需氧代
谢产生的有毒物质,可能会诱发 DNA的突变,脂质
的过氧化,酶的失活等,从而导致细胞结构的破坏,
染色体的畸变,最终导致癌症的产生[3]。不过,人们
也会采用电辐射,化学治疗以及光学治疗等方法治
疗癌症。
3.2 Mt的双重作用
Mt对肿瘤细胞的生长、分化、修复都起着重要
的作用,同时,通过氧化应激来保护细胞免受吞噬
作用。它可以被内源性和外源性刺激物诱导产生,
例如,糖皮质激素,干扰素,白细胞介素,黄体激素,
血清因子,重金属离子等。
3.3 Mt对抗癌药物的反应
人们发现,Mt的表达与抗癌药物诱导和肿瘤
增殖有关。人们利用免疫组织化学的方法在组织中
检测出 Mt-1和 Mt-2亚基。Mt的过量表达可能与恶
性肿瘤和一些高度分化的轻度肿瘤有关[10]。
3.4 Mt的过度表达
在实验中发现,Mt的过量表达可以使卵巢癌
产生耐药性。这可能是因为药物的多价鳌合和代谢
产物影响了药物与细胞特定靶位的结合,降低了抗
癌药物的药效。这可能就是为什么开始对化疗敏感
的肿瘤由于某些蛋白过量表达慢慢产生了抗药性。
另一种原因可能是生长因子激活控制耐药性的酶
和蛋白质的表达,从而使肿瘤产生耐药性。但是,他
们都没有找到肿瘤的耐药性与细胞中某些蛋白过
度表达的必然联系[1]。
3.5 遗传和非遗传毒性
人们容易受致癌化学物质遗传和非遗传毒性
的影响。干细胞突变株和克隆突变扩增株可以作为
癌症的替代品进行环境的安全评估。我们可以选择
内生标记突变基因,如利用结肠小窝干细胞分泌的
葡萄糖六磷酸脱氢酶,可以使小窝限制型发生显形
转变[11]。
3.6 Mt作为抗氧化剂
Mt具有抗氧化剂的作用,细胞中的氧化剂在
抗肿瘤药物中扮演重要的角色,它可以介导癌细胞
的死亡,Mt的表达量可以被周围的氧原子的含量
所控制。Mt可以作为诱导抗细胞凋亡的蛋白。Mt在
癌变过程中发挥着重要的角色,涉及肿瘤细胞病理
46
2008年第2期
学和抗药性,人们还发现在肠癌和胃癌中,锰离子
(Mn-SOD)的含量明显增高[3]。此外,人们发现在
MT含量较少的细胞里,DNA容易受到损害,将它
们暴露在诱导刺激物中,细胞的凋亡率明显提高,
相反,对细胞进行适当的 Mt诱导,在上面同样的条
件下,可以减少细胞的死亡率。
4 影响 Mt合成的因素
多型基因控制 Mt的合成,此外,金属,药物,激
素,氧化应激等因素也可以诱导它的产生。肿瘤中
Mt的水平还与耐药性有关。Mt可以调节细胞内锌
和其它金属的浓度。Mt过度表达能够影响 DNA的
转录,翻译和蛋白质的合成[11,12]。
5 Mt的免疫染色
5.1 阳性对照
Mt蛋白免疫组织化学检测方法是将用石蜡密
封冷丙酮储存的肝脏切片与抗生蛋白链菌素—卵
白素-生物素-免疫过氧化物酶进行一系列的反应
来实现的。将 5μm的切片放在用聚左旋赖氨酸包
裹的载波片上,去石蜡和再水合。将内源性过氧化
物在含有 1%双氧水的 0.1mol/L喹啉盐(pH值7.6)
放置30min使其失去活性。然后,加5%山羊血清在
37℃放置1h,将切片中加入用1%BSA按1:50稀释
的家兔抗大鼠Mt-1抗体并在40℃过夜,再加二次抗
体-山羊抗兔免疫球蛋白在 37℃放置 30min并按 1:
200稀释。在抗生蛋白链菌素过氧化物酶(1:100)中
放置1h,随后用以含0.33%双氧水的0.5mol/L喹啉氯
化钠底物,0.5%+3,3-二氨基二苯胺四盐酸进行染
色,然后用哈里斯苏木紫复染 ,然后脱水,展开,并
进行阳性对照[9]。
5.2 阴性对照
阴性对照试验与上面的阳性对照试验步骤是
一样的,只是没有添加主要的抗体。当肝脏中的细
胞核和细胞质被染色时,Mt免疫染色是成阳性的,
Mt免疫反应性是根据免疫阳性细胞的百分比来衡
量的。从 10个高倍率领域随机挑选,阳性细胞量与
这一区域的细胞总量有关[9]。
6 展望
Mt的研究已有 40多年的历史,对其结构、特
性、基因调控及生物学功能的研究日趋深入,研究
成果已涉及医学、毒理学、环境科学、营养学、生物
工程、美容护肤等各个领域,应用前景十分广阔,随
着研究方法的不断改进和完善,Mt的研究将不断
深化发展。
Mt制备的药物具有高活性的抗衰保健作用,
可用作超氧化物歧化酶的替代产品,也是极其有效
的自由基清除剂,用作化妆品的生物型添加剂,使
化妆品更具滋润皮肤、防止皱纹、增白防晒和保持
生理活性的综合功能。用于营养保健食品的生产,
具有增强机体应激反应能力、调节微量元素的作
用,适应于高血压、脑血栓、动脉硬化、糖尿病等多
种病人的特殊需求。用作畜禽饲料的生长激素,可
加快牛、羊、猪、鱼的生长发育,降低饲喂成本和提
高养殖效率;与植物基因工程相结合,可培养出具
有高含锌量的转化基因蔬菜和各种营养蔬菜。
Mt作为食品添加剂生产的各种具有特殊生理
调节功能的营养保健食品,将受到市场的青睐,成
为人们食品消费的新热点。作为动物脏器提取物在
化妆品生产中具有明显的优势,其需求量也将呈增
长的态势。此外,在食品、医药、日化、保健和环保等
行业中的总体需求量也将不断增加,市场潜力十分
巨大。
参考 文献
1 DziegielP,JelenM,MuszczynskaB,etal.RoczAkadMedBialymst,
2004,49(1):43~45.
2 TanY,SinniahR,BayBH.Pathol,1999,189:60~65.
3 JanssenAM,vanDuijnW,KubbenF,etal.ClinCancerRes,2002,8:
1889~1896.
4 JinR,BayBH,ChowVT,etal.BrJCancer,2000,83:319~323.
5 安建平,王海娟,韩沛平,等.天水师范学院学报,2005,25(2):
34~38.
6 JinR,ChowVT,TanPH,etal.Carcinogenesis,2002,23:81~86.
7 Abdel-MageedAB,AgrawalKC.CancerRes,1998,58:2335~2338.
8 LewinB,GenesVI.OxfordUniversityPress,1997,849~850.
9 ChakrabortyT,SamantaS,GhoshB,etal.CelBiochem,2005,94:
744~762.
10 KondoY,WooES,LazoJS.CancerRes,1995,55:2021~2023.
11 HishikawaY,KojiT,NagasueN.BrJCancer,1999,81:712~
720.
12 RaleighJA,ChouSC,Calkins-AdamsDP,etal.ClinCancerRes,
2000,6:855~862.
邢树礼等:金属硫蛋白的功能及应用前景 47