全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
大豆 GmPDS基因的克隆及 VIGS表达载体构建和鉴定
吕山花1 樊颖伦1 吕福堂 1 刘立科 2 孙亚梅 1 马姗姗 1
( 1聊城大学农学院,聊城 252059; 2聊城大学生命科学院,聊城 252059)
摘 要: 病毒诱导的基因沉默 ( virus induced gene silencing, V IGS)技术是近年来发展起来的一种反向遗传学快速研究
基因功能的方法, 对于植物特别是难于转化的大豆而言尤其适用。本研究采用 PCR技术从大豆 (G ly cine m ax )基因组中克隆
了八氢番茄红素去饱和酶 ( phytoene desaturase, PDS)基因的部分序列,命名为 GmPDS(Glycinem ax PDS )。该片段长 430 bp,序
列分析表明, 该基因与大豆八氢番茄红素去饱和酶 ( GenB ank登录号: M 64704) cDNA序列同源性为 99%。双酶切 GmPDS片
段和烟草脆裂病毒载体 ( pTRV2) ,构建了重组载体 pTRV2GmPDS, 并将该重组载体分别转化农杆菌 C58C1 /pMP90、GV3101
和 LBA4404, 为分析 pTRV载体是否可以浸染大豆奠定了基础。
关键词: 大豆 Gm PDS基因 VIGS 载体构建
Construction and Identification of VIGS Expression Vector
CarryingGmPDS Gene Cloned from G lycine max
Lv Shanhua
1
Fan Y ing lun
1
Lv Futang
1
L iu L ike
2
Sun Yame i
1
M a Shanshan
1
(
1
Schoo l of Agriculture, Liaocheng University, Liaocheng 252059;
2
School of Life Science, Liaocheng University, Liaocheng 252059 )
Abstrac:t V irus induced gene silenc ing ( V IGS) is increasing ly be ing used as a reverse genetics too l to study functions of spec ific
p lant genes in a short tim e. It is especially useful for plants, especially soybean tha t is recalc itrant to transform ation. A partial se
quence o f phy toene desaturase ( PDS) w as cloned from G lycine max using PCR m e thod and term ed as GmPDS ( G lyc ine m ax PDS ).
GmPDS ind ica tes 430 bp length, and exh ib its 99% identity to the cDNA sequences that PDS w as obtained from GenBank database
( GenBank accession numberM 64704) at nuc leotide acids leve.l TheGmPDS and tobacco ra ttle v irus vector ( pTRV2) we re digested by
double restriction enzym es and recom binant pTRV2GmPDS vector was constructed, wh ich w as transform ed intoAgrobacter ium C58C1 /
pMP90, GV3101and LBA4404, respective ly.
Key words: Glycine max GmPDS gene V IGS Vecto r construction
收稿日期: 20091208
基金项目:聊城大学博士科研启动基金 ( 31805 )
作者简介:吕山花,女,博士,副教授,研究方向:植物发育分子生物学; Em ai:l lvshanhua@ yahoo. com. cn
病毒诱导的基因沉默 ( v irus induced gene silen
cing, V IGS)是一种瞬时、快速鉴定植物基因功能的反
向遗传学 (Reverse genetics)技术。V IGS是通过抑制基
因转录水平来研究基因功能的方法。携带植物基因片
段的病毒侵染植物后, 该基因片段作为病毒的一部分
同病毒一起复制并扩散到整株植物,通过一种依赖于
同源 RNA降解机制而导致植物同源基因的 mRNA降
解,从而诱导了 VIGS[ 1- 3]。与其它的研究基因功能的
方法相比 (转座子插入突变、TDNA插入突变、反义抑
制等 ), V IGS具有以下优点:周期短,通常侵染 1- 2周
即可观察表型;不需要遗传转化即可获得转基因植株;
在转基因当代即可观察到基因突变表型;可在不同的
遗传背景下生效;可以快速的在不同的物种间开展比
较功能基因组学研究等。因此, VIGS技术正在发展成
为一种简单、快速、有效、高通量的分析基因功能的方
法 [ 1, 2, 4- 6]。迄今为止,已有烟草脆裂病毒 ( tobacco rat
tle virus, TRV )
[ 7, 8]、烟草花叶病毒 ( tobacco mosaic vi
rus, TMV )
[ 9]、马铃薯 X病毒 ( potato virusX, PVX) [ 10- 11]、
番茄金色花叶病毒 ( tomato go lden mosa ic virus, TG
MV )、卫星病毒诱导的沉默系统 ( satellite v irusinduced
2010年第 4期 吕山花等: 大豆 GmPDS基因的克隆及 VIGS表达载体构建和鉴定
silenc ing system, SV ISS)、大麦条状花叶病毒 ( barley
stripe mosa ic v irus, BSMV)
[ 12]、苹果潜隐病毒 ( apple la
tent spherica l v irus, ALSV )等载体报道 [ 13, 14]。但由于
V IGS载体存在一定的宿主范围,限制了其应用范围。
另外,许多病毒不能侵染宿主植物的生长点,而使这些
分生组织的目标基因无法有效沉默,如 TMV、PVX和
TGMV病毒载体 [ 15]。相比较而言, TRV载体能侵染分
生组织和花,己广泛用于研究烟草、番茄与马铃薯等多
个基因的功能 [ 7, 8, 16], 但其是否能够应用于大豆,目前
尚不清楚。
在 VIGS中,通常以八氢番茄红素去饱和酶 ( phy
toene desaturase, PDS)基因作为报告基因, 探索病毒
载体在不同种植物上应用的可能性。 PDS表达受到
抑制后,影响类胡萝卜素的合成,植物出现光漂白现
象。PDS抑制表型容易观察, 因此 PDS基因成为
V IGS体系评价的参照基因 [ 9, 17 ]。
本研究以大豆为材料,克隆了大豆 PDS基因的
片段, 构建了携带大豆 PDS报告基因的重组 TRV病
毒载体,用于侵染大豆。旨在探讨 TRV载体能否应
用于大豆,为下一步大豆功能基因组学研究提供技
术平台。
1 材料与方法
1. 1 供试材料
大豆品种晋豆 16为本实验室保存种子;病毒载
体 ( pTRV1和 pTRV2)由清华大学刘玉乐教授惠赠;
大肠杆菌 DH10B以及农杆菌 C58C1 /pMP90、GV3101
和 LBA4404为本实验是保存菌种。
1. 2 大豆八氢番茄红素去饱和酶基因 ( GmPDS )片
段的克隆
以幼嫩大豆叶片为材料,参照 Sharp等 [ 18]的方
法提取总 DNA。根据 GenBank数据库中公布的大
豆 PDS cDNA序列 ( GenBank登录号: M 64704)并参
考大豆基因组序列设计引物。上游引物 GmPDSF:
5 CGCTGCAAGCTTGGTACTCTC3 ,下游引物 GmP
DSR: 5 ACGCGGAGAAGCACGAAAG3 。以 DNA
为模板, 进行 PCR扩增。扩增体系如下: 9. 0 L
ddH 2O, 1. 5 L 10 ! buffer, 1. 25 L 2. 5 M dNTP,
0. 3 L 10 M GmPDSF, 0. 3 L 10 M GmPDSR, 2.
5 L DNA模板 (约 50 ng ), 0. 2 L TaqDNA Po ly
merase。扩增条件为 96∀ 预变性 3 m in后进行 35
个循环, 每个循环 94∀ 变性 1 m in, 56∀ 退火 30 s,
72∀ 延伸 40 s后, 72∀ 终延伸 10 m in。取 PCR扩增
产物 5 L, 1. 0%琼脂糖凝胶电泳检测 (含溴化乙
锭 ) , 用 DL2000 marker做参照, 判断扩增产物的分
子量大小, 5 V / cm 电泳 30 m in, 紫外灯下观察
照相。
1. 3 目的基因片段与 pMD19T载体的连接与鉴定
切胶回收 PCR 获得的目的基因片段, 按照
pMD19T载体试剂盒 ( TaKaR a)操作说明书将目的
基因片段与 pMD19T 载体连接, 转化大肠杆菌
DH10B (本实验室保存 )涂板过夜,蓝白斑筛选阳性
克隆,经菌液 PCR鉴定为重组子后送至北京均尧伟
业生物技术公司进行测序。
1. 4 重组 pTRV2GmPDS载体的构建及农杆菌
转化
将 GmPDS基因用 BamH I和 Sal I从携带有
GmPDS片段的 pMD19T载体切下来后, 与经 BamH
I和 Xho I双酶切的 pTRV 2载体连接,转化大肠杆
菌,经 PCR以及用 BamH I和 Sma I双酶切鉴定重组
质粒,将其命名为 pTRV2GmPDS。然后通过冻融法
转化农杆菌菌株 C58C1 /pM P90、GV3101和 LBA4404。
2 结果分析
2. 1 大豆八氢番茄红素去饱和酶基因片段的克隆
利用 PCR方法扩增大豆八氢番茄红素去饱和
酶基因的部分序列,琼脂糖凝胶电泳检测结果表明,
在约 430 bp左右扩增出清晰的扩增带 (图 1)。将
该扩增片段回收并克隆入 pMD l9T载体后进行测
序。测序结果表明,扩增的大豆 PDS基因片段长度
为 430 bp, 与预期片段大小一致。将该片段在 Gen
Bank数据库中进行 blast分析, 结果表明该基因片
段与已知大豆 PDS cDNA序列 ( GenBank登录号
M64704)同源性为 99%。表明已克隆出 GmPDS基
因部分片段。
2. 2 重组 pTRV2GmPDS载体的构建及农杆菌
转化
将构建的重组质粒 pTRV2GmPDS转化大肠杆
菌, 经菌液 PCR进行初步鉴定为阳性的克隆, 然后
摇菌提取质粒后进行双酶切鉴定。结果表明,
BamH I和 Sma I双酶切质粒切出与预期大小一致
的条带,约 430 bp左右 (图 2) , 表明基因沉默载体
123
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
1. GmPDS基因片段的 PCR产物; 2.分子量标准 DL2000
图 1 GmPDS基因片段的 PCR扩增结果
pTRV2GmPDS构建正确。将重组载体 pTRV2
GmPDS 转化 农杆菌 C58C1 /pMP90、GV 3101 和
LBA4404,利用菌液 PCR鉴定 pTRV2GmPDS质粒
已转化进上述农杆菌菌株中 (结果未显示 )。
1. 分子量标准 DL2000; 2.双酶切重组质粒 pTRV2GmPDS
图 2 重组 pTRV2GmPDS质粒
BamH I/Sma I双酶切检
3 讨论
本研究利用 PCR方法从晋豆 16大豆中克隆了
GmPDS基因的部分序列, 该基因片段与已知大豆
PDS cDNA序列 ( GenBank登录号: M 64704)同源性
为 99%。这可能是由于不同品种之间基因存在多
态性引起的。将克隆的 GmPDS克隆入 pTRV2载
体, 并转化入农杆菌, 目前正在用这些携带有
pTRV2GmPDS和 pTRV1载体的农杆菌分别侵染不
同品种的大豆,正在进行表型观察中。
随着大豆基因组序列测定的完成,其研究重点由
结构基因组学转向功能基因组学研究。功能基因组
学的开展迫切需要一种快速、高通量的分析基因功能
方法,而 V IGS可以在较短时间内鉴定基因序列的生
物学功能,有望成为功能基因组学研究潜在的有效方
法。迄今为止,虽然已有几个可以在大豆上应用的病
毒载体报道,但存在沉默效率低、稳定性差或引起宿
主症状较严重等缺点 [ 13, 14, 19]。本研究采用的 pTRV
载体诱导基因沉默的效率高、持久性长,稳定性好、能
侵染花和分生组织, 以及引起宿主温和的病症等优
点。通过本研究为分析 pTRV载体是否可以浸染大
豆奠定了基础。
致谢:感谢清华大学刘玉乐教授提供 pTRV载体。
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2010年第 4期 傅立元等:虾夷扇贝 actin基因的克隆和序列分析
图 4 内含子序列
图 5 A ctin氨基酸序列系统树
参 考 文 献
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