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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
江苏海域几种绿潮藻类
rDNA ITS序列分析
陈淑吟1 胡传明1 陆勤勤1 孙中响1，2 许广平1 丁亚平1
(1江苏省海洋水产研究所，南通 226007;2苏州大学医学部基础医学与生物科学学院，苏州 215123)
摘 要: 于 2009 年 5 － 7 月定点采集了江苏海域绿潮藻类，测定、分析了这些藻类核糖体 rDNA ITS序列，并进行分类鉴
定。研究结果显示，ITS + 5． 8S序列片段长度为 552 － 578 bp，其中 ITS1 序列部分长度为 179 － 182 bp，5． 8S 序列全长为 155 －
158 bp，ITS2 序列全长为 180 － 196 bp，序列的平均 GC含量(contents)为 61． 6% － 63． 3%，不同 ITS序列存在不同的插入 /缺失
位点。扩增得到 27 个序列中有 7 个不同序列，依据 NCBI数据库相似性查找、系统进化关系及遗传距离等分析结果，确定有 4
个种类:浒苔(Ulva prolifeya) ，缘管浒苔(U． linza) ，石莼属(Ulva sp．)1 种及盘苔属(Blidingia sp．)1 种。分析表明，ITS序列可
作为石莼科种类鉴定的标记。
关键词: 绿潮藻类 浒苔 石莼 盘苔 ITS 序列 分类鉴定
Analysis on rDNA ITS Sequence of the Green-tides in the
Coast Areas of Jiangsu Province
Chen Shuyin1 Hu Chuanming1 Lu Qinqin1 Sun Zhongxiang1，2 Xu Guangping1 Ding Yaping1
(1Marine Fisheries Research Institute of Jiangsu Province，Nantong 226007;
2School of Preclinical Medicine and Biological Science，Soochow University Medical Department，Suzhou 215123)
Abstract: In order to investigate the green-tides composition and dominant algae in the coastal waters of Jiangsu province，from
May to July in 2009，algae samples were collected from the costal regions(119°32 － 122°00E，32°25 － 36°49N) ，and sequenced the
rDNA internal transcribed spacer(ITS)fragments． The results showed that，the length of ITS + 5． 8S rDNA sequences were 552 － 578
bp，partial sequence of ITS1 was 179 － 182 bp，complete sequences of 5． 8S and ITS2 were 155 － 158 bp and 180 － 196 bp，respective-
ly，the average GC contents of the sequence was 61． 6% － 63． 3% ． 27 samples were sequenced and 7 sequences were found different，
which were identified as 4 species，including:Ulva prolifeya，U． linza，U． sp． and Blidingia sp． ． Sequences were compared and used to
construct the phylogenetic trees and showed that the ITS sequence would be a useful tool for identification in Ulvaceae family algae．
Key words: Green-tides Ulva Enterornorpha Blidingia ITS region Phylogenetic relationship
收稿日期:2010-07-19
基金项目:江苏省海洋与渔业局渔业重点项目
作者简介:陈淑吟，女，博士，研究员，研究方向:海洋生物遗传资源与增养殖;E-mail:shuyinchen89@ 163． com
由石莼科(Ulvaceae)的大型藻类过量增殖形
成的绿潮(green tide)已成为全球常态发生的生
态现象之一［1］。绿潮发生与超营养的海洋水文
环境条件相关［2］。中国近年来在东海、黄海沿岸
也频繁发生了由浒苔(Ulva prolifera)等大型海藻
引起的异常增殖和聚集的现象，对沿岸景观、海洋
环境等产生较大影响。相关部门针对绿潮生物种
类组成、发生过程及防控方法等已展开了大量研
究［3］。为了解黄海南部近岸水域绿潮生物组成，
2009 年春季开始对江苏沿岸绿潮种类的分布及
生长情况进行了定点定期调查。为分析鉴定采集
到的样品种类，在应用藻类形态特征等鉴定方法
的同时，利用核糖体 rDNA内部转录间隔区(inter-
nal transcribed spacer，ITS)序列，对一些样品进行
序列测定及相似性分析，以期为进一步研究提供
依据。
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
1 材料与方法
1． 1 材料
于 2009 年 5 － 7 月，采集了江苏的连云港
(LYG)、盐城射阳(SY)及南通如东(RD)沿岸的池塘
及岸基等定点站位的漂浮及定生绿潮藻类样品(表
1)。藻体清洗去泥沙和附着物，用无菌水中洗净、凉
干，依藻体形态差异进行分装、标识保存。
取单株藻体样品约 0． 1 g，按 DNA 提取试剂盒
(TaKaRa，DV811A)说明书要求提取样品基因组总
DNA，最后洗脱定溶于 TE(100 ng /μL)溶液，4℃保
存备用。
1． 2 PCR扩增与测序
PCR 扩增引物:ITS-F:5-TCGTAACAAGGTT-
TCCGTAGG-3，ITS-R:5-TTCCTTCCGCCTATTGAT-
ATGC-3［4］。引物由上海生工合成。
PCR反应总体积为 25 μL，含有 DNA 模板约
50 ng，浓度为 5 pmol 引物各 1 μL，12． 5 μL Premix
Taq 聚合酶混合液(TaKaRa，D332A)。PCR 扩增程
序:94℃预处理 6 min;进行 35 个循环:94℃ 1 min，
56℃ 1 min，72℃ 1min;最后 72℃ 条件下延伸
10 min。PCR产物在 1． 5%琼脂糖凝胶中电泳，EB
染色，凝胶成像系统检测。产物经试剂盒(TaKaRa，
DV807A)切胶纯化后送上海生工，用 PCR反应引物
进行双向测序。
1． 3 序列与数据分析
用 Clustal X1． 81 软件［5］进行序列比对、校正，
并经 NCBI数据库 Blast 确认;用 MEGA3． 1 软件［6］
计算序列碱基组成(nucleotide composition)、基于
Kimura-2-P法计算序列间的遗传距离、构建 Neigh-
bor-joining(NJ)与 unweighted pair-group method with
arithmetic mean(UPGMA)系统进化关系树(bootstrap
重复 1 000 次)。DNAsp 4． 10． 9 软件［7］中分析序列
核苷酸差异位点(Variable sites)等。
序列于 NCBI数据库 BlastN中进行序列相似性
(similarity)查找，以 E-Value = 0 的最高相似性(Max
ident)物种进行比较。本研究物种名称比照 NCBI
用 Ulva代替 Enterornorpha。为进行序列长度及石莼
科系统进化分析，从 GenBank 下载了部分序列:U．
linza(HM031163)、U． prolifer(HM047553)、U． flexuo-
sa(AB097647)、Blidingia dawsonii (DQ001139)、
B． chadefaudii (AJ012309)、Umbraulva amamiensis
(AB097640)及 Gayralia oxysperma(AY16306) (外
群，Outgroup)。
表 1 绿潮藻类样品及扩增序列信息
序列号 序列数 采样地点 采样时间 类型
H1 4 SY1 5 月 14 日 F
1 LYG1 6 月 25 日 F
1 RD1 5 月 19 日 F
H2 3 LYG2 5 月 13 日，6 月 25 日 F、A
H3 2 LYG3 5 月 13 日，7 月 12 日 F
4 SY2 5 月 14 日，5 月 26 日 F、A
H4 1 SY3 5 月 13 日，6 月 19 日 F、A
1 LYG4 6 月 26 日，7 月 25 日 F
H5 4 SY4 5 月 14 日，6 月 28 日 F
H6 3 SY5 7 月 12 日，31 日 F、A
1 RD2 5 月 19 日 F
H7 2 RD3 5 月 19 日 F
F．漂浮;A．定生
2 结果与分析
2． 1 序列变异与相似性比较
经优化 PCR反应条件及试剂用量，最终扩增出
单一目的条带，测序、校正获得 27个序列，比对得到 7
个不同序列，序列位点差异见图 1，不同序列频率见
表 2。序列长度范围在 552 － 578 bp 之间，共有 151
个变异位点，其中有 137 个简约信息位点。有 61 个
插入 /缺失位点(insertions /deletions) ，分布在 10 －
178 bp及 345 －415 bp之间，分属于 ITS1 及 ITS2 区;
在 179 －268 bp间没有变异位点，为 5． 8S的保守区序
列。H7与其他序列差异最大，在除 H7外的 6个序列
中，在 170 －346 bp的长达 176 bp片段完全相同。
序列间碱基组成比例存在一定差异，C 含量
(Content)为 32． 6% － 33． 2%，G 含量为 29． 0% －
30． 1%，GC含量范围在 61． 2% － 63． 3%之间，存在
明显的碱基偏倚性，碱基组成差异程度也为物种鉴
别提供了依据(表 2)。
把这些序列进行 BlastN 相似性查找比对，得出
最大相似性结果分别为:序列 H1 与浒苔 U． prolifera
(FJ026732)相似性在 99% － 100%之间，同时与 Ulva
sp．(EU933988)、U． flexuosa qenes(AB097646)相
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2011 年第 3 期 陈淑吟等:江苏海域几种绿潮藻类 rDNA ITS序列分析
似性也有 97% － 100%;序列 H2 最高相似性只有
94%，分别为 EU933988(lva． sp．)与 AB097646(U．
flexuosa qenes) ，H1、H2 均为石莼属(Ulva)种类。序
列 H3、H4、H5和 H6与缘管浒苔(U． linza，AJ000203)
序列相似性均为 99%以上;这些序列在与其他序列
进行比较时，插入 /缺失位点一致，应为同种的不同单
元型;本研究 27 个序列中有 17 个属此种类(表 1)。
序列 H7得到有最高相似性(94%)的是盘苔属(Blid-
ingia)藻类(B． dawsonii，DQ001139)。
表 2 核糖体 rDNA ITS序列的碱基组成与
序列长度比较
序列
编号
碱基组成(%)
T C A G G + C
长度
(bp)
鉴定种属
H1 19． 5 32． 6 18． 9 29． 0 61． 6 555 U． prolifer
H2 18． 7 33． 2 19． 1 29． 0 61． 2 555 U． sp．
H3 18． 3 33． 0 19． 0 29． 7 62． 7 552 U． linza
H4 18． 1 33． 0 19． 2 29． 7 62． 7 552
H5 18． 1 33． 2 19． 2 29． 5 62． 7 552
H6 18． 1 33． 2 19． 2 29． 5 62． 7 552
H7 18． 3 33． 2 18． 0 30． 1 63． 3 578 Blidingia sp．
平均值 18． 5 33． 0 18． 9 29． 5 62． 5 556． 6
利用相近物种比对，分析确定 ITS1 及 ITS2 的长
度，其中 H1 － H2 与 AB097647(U． flexuosa)、H3 － H6
与 HM047553(U． prolifera)相比，得到的 ITS1 部分序
列长度为 179 －182 bp，5． 8S全序列长度 158 bp，ITS2
全序列长度为 180 bp。H7 与 DQ001139(B． dawso-
nii)相比对，得出 ITS1 部分序列长度 179 bp，5． 8S
全序列长度 155 bp，ITS2 全序列长度为 196 bp。
2． 2 遗传距离与系统关系分析
7 个不同序列间的平均遗传距离(D) :0． 115，
石莼科不同序列间的遗传距离见表 3。7 个不同序
列的遗传距离差异可以分为 4 个组:(1)H1 － H2 的
遗传距离为 0． 025;(2)序列 H1 － H2 与 H3 － H6 间
的遗传距离为 0． 057 － 0． 067; (3)H3 至 H6 间遗传
距离范围为 0． 002 － 0． 008;(4)H7 与其它 6 个序列
的遗传距离为 0． 298 － 0． 315。这 4 组级别的差异
在与已知物种比较中，得到更清楚的说明，如 U． pro-
lifera与 H1、H2、H3 － H6 及 H7 的遗传距离分别为
0. 002、0． 026、0． 067 － 0． 072 及 0． 371。U． linza 与
H3 － H6 间的遗传距离为 0． 003 － 0． 008，而与 H7 遗
传距离最小是 0． 378。
表 3 不同 ITS序列间的遗传距离
序列号 H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 B． d U． l U． p Umb
H2 0． 025 *
H3 0． 057 0． 063 *
H4 0． 059 0． 065 0． 002 *
H5 0． 061 0． 067 0． 004 0． 006 *
H6 0． 061 0． 067 0． 004 0． 004 0． 008 *
H7 0． 298 0． 307 0． 312 0． 315 0． 312 0． 312 *
B． d 0． 363 0． 366 0． 366 0． 366 0． 366 0． 357 0． 039 *
U． l 0． 069 0． 073 0． 003 0． 003 0． 008 0． 008 0． 378 0． 370 *
U． p 0． 002 0． 026 0． 067 0． 067 0． 072 0． 072 0． 371 0． 363 0． 069 *
Umb 0． 217 0． 203 0． 203 0． 203 0． 203 0． 210 0． 368 0． 359 0． 207 0． 217 *
Gay 0． 436 0． 421 0． 440 0． 440 0． 436 0． 436 0． 428 0． 414 0． 445 0． 436 0． 460
B． d:B． dawsonii;U． l:U． linza;U． p:U． prolifera;Umb:Umbraulva amamiensis;Gay:Gayralia oxysperma
以 AY016306(Gayralia)为外群构建的 NJ 及
UPGMA进化树的拓扑结构基本一致，且主要分支
聚类节点均有 100 置信值(图 2)。从进化树中进一
步证明，这些序列与最相似物种间的系统分类关系。
3 讨论
3． 1 江苏海域绿潮种类分析
本研究依据藻体形态差异进行分别扩增，测序
得到的 27 个序列中只有 7 个不同，主要分属于石
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
图 1 不同 ITS序列的位点差异分布
莼、缘管浒苔及浒苔，盘苔属物种只有 2 个序列，反
映了 2009 年江苏沿海分布的绿潮生物中的主要种
类，与大多数有关绿潮藻类组成物种研究相一致。
丁兰平等［8］对 2008 年黄海西部沿海漂浮聚集的绿
藻样品进行了分类学研究，鉴定其为浒苔(Entero-
morpha prolifera) ，其主要分类鉴定特征为藻体暗绿
色或亮绿色、管状扁压、中空、主枝明显、分枝较多、
密集且细长。汪文俊等［9］对来自东海－黄海海区 14
个站位的浒苔样品依据形态学特征，归类分离获得
70 个样品，对其 ITS + 5． 8S rDNA 区进行分析得到
完全相同的序列;本研究进行测序样品中，同样依外
部形态差异分别扩增，结果显示，许多在形态上不同
的样品在 ITS序列上未反映明显的变化。这说明浒
苔形态在不同海水环境中会有一定的变化，但不一
定在 DNA水平上有相应表达。
本研究取自江苏如东样品中，有最高相似性为盘
苔属种类的结果，应成琦等［10］研究的 2008年 6月取自
如东藻类样品 RD-03也与盘苔有最高相似性。连续两
年在如东皆有该种属存在，两者是否为同一种，是否盘
苔属种类为江苏省沿海的常见种，有待进一步研究。
大型绿藻在我国南北不同海域各有其优势种
类，在黄海、东海以浒苔及肠浒苔为多，是当地的主
要分布种类［11］。藻类优势类群的形成不仅决定于
营养、温度等环境条件，还与物种生理特性有关。当
生长条件适宜时，具有竞争优势的物种快速繁殖，大
量利用营养物质，抑制其他藻类的生长而成为优势
类群。许妍等［12］进行共存试验研究结果表明，缘管
浒苔新鲜组织和干粉末对赤潮异弯藻生长均有强烈
的克生效应。王兰刚等［13］以种群密度为变量，采用
试验生态学手段研究表明，条浒苔与三角褐指藻间
存在生存优势竞争关系。夏秋两季环境条件可能适
宜大型绿藻生长，绿藻大量繁殖成为优势类型。而
且，浒苔等藻类可进行营养繁殖，这也是浒苔在自然
海区几乎周年可见的主要原因［14］。
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2011 年第 3 期 陈淑吟等:江苏海域几种绿潮藻类 rDNA ITS序列分析
图 2 基于 ITS序列的石莼科系统进化树
3． 2 ITS序列在石莼属与浒苔属物种分类鉴定中的
应用
rDNA的 ITS1 和 ITS2 为非编码序列，进化速度
快于编码区序列，且该序列在亲缘关系不同时，物种
常有位点和长度上的变异，被认为是种间水平甚至
种内水平比较研究中不错的标记序列，在动物、植物
遗传学研究中该序列被广泛应用。利用该序列进行
系统地位研究，在藻类等植物中得到了较好结果，如
庄丽等［15］对叉角藻 18S 与 ITS 区的分析表明，ITS
区域是良好的分子标记，可用于叉角藻快速鉴定的
专一性核酸分子探针的研制。Leskinen 等［4］用 ITS
研究浒苔的进化，表明浒苔 ITS 序列存在有碱基偏
倚性，在不同物种间表现有明显差异。Leskinen
等［16］以 ITS 调查两种石莼种类 U． intestinalis 与 U．
compressa的地理分布及系统进化情况，研究得出两
种藻类的分布范围与生态条件不同。应成琦等［10］
把 ITS 序列与 18S 序列相比较，ITS 得到较好结果。
孙雪等［17］利用该序列与 RBCL 序列研究进行不同
小球藻类的鉴定分析，两种序列结果虽然一致，但
rbcL偏保守。ITS 序列已得到越来越多研究资料，
分子分类学家正探索把该序列作为 DNA 条形码应
用于植物鉴定。
石莼科藻类大多为海洋性世界性藻类，其外部
形态的变异与环境之间的关系难以撑握，也因此存
在许多变异种，从外形上区分不清导致在分类上争
议较多［11］。依据来自 http:/ /www． algaebase． org 的
资料，Ulva prolifera O． F． Müller 与 Enteromorpha pro-
lifera (O． F． Müller)J． Agardh 1883 为同种(Homo-
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
typic Synonym)。Enteromorpha属的物种最早被归入
Ulva 中(Linnaeus，1753) ，而后又被改回(Link，
1820)。至今，藻类分类学界对于该分类仍存有不
同观点，仍没有一个明确标准能把 Ulva 和 Entero-
morpha完全分开。石莼属与浒苔种类不易区分，一
方面可能由于环境的刺激与植物本身发育等相互作
用所致［18］，另一方面是由于浒苔属与石莼属的一些
种类有较近的亲缘关系［19］，Hayden等［20］对近 30 种
浒苔和石莼的 rDNA ITS和 rbcL基因进行了系统发
生分析，认为这些生物种属间遗传差异不明显，不应
再被看作为两个属。随着分子生物学技术在遗传学
领域的快速应用，DNA水平的鉴定技术将有助于为
这些形态多变的物种的分类鉴定找到新突破。
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(责任编辑 马鑫)
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