全 文 ：生物技术通银
技术与方法 石叮口2万口孙心 乙口 G Y B U L L E TJ W 2 (X 为 年 增 刊
微生物发酵过程的多种培养技术
王媛 范栋 2 陈有容 3 蔡友琼
( 中国水产科学研究院东海水产研究所,上海 2仪盯扣;2黄岛出人境检验检疫局,青岛 2肠555;
,上海海洋大学食品学院 ,上海 20 13肠 )
摘 奥: 徽生物发醉是一种很复杂的生化过程 ,除了与蔺种的生产性能有关 ,还与培养基的配比 原料的质1 灭菌条
件 发眯条件和过租拉制等有密切关系传统的徽生物发醉过程主要有分批 丰连续 分批补料 连续发岭等几种方式 ,不同的
培养技术各有其优缺点 了解生产菌种在不同的生产工艺条件下的细胞生长 代谢和产物合成的变化规律将有助于发眯过租
的拉制
关扭词: 徽生物 发眯 培养技术 优缺点
M ul ti Ple C ul tivation Te chn0lo梦es of F erm enta ti on P丫OC es of
M ICro be S
W an g Y uan , Fan D o赌 C hen Y ouro 峪 C滋Y ouqi o吃
(石. t ch 俪 反a 几 he 成: Re , , h 加公. cA 朽 , S加喇城 20(X) 叨; Z H帅呼加 E形甲一Ex . 加尸ec 白n 田以 Q山叮口材u岭习叭二,
e心甲油 26 555 , . 3 5加叼城 oc e. 汤e, 勿, s加喇城 20130 6)
A 如目I a Ct : Th e fe rme n o don of 而 ero b es is : v ery eom P卜cate d biOC he而 司 proees . It inv olves in th e rati o of , 山um , th o q 山ty
of raw mate ri als , the condi tio ns o f steri五Za tio n an d 丘rme n 叻 on , contro ls of the p ro cedur es bo i此 th e pro du 咖 e 呷 ab 山ty of b ~
田不比. Th e 的山don 习 fe rm 即 don Pro ceS of 而 cro 比 功画川y eon 七幻比 ha tC h cul tu re , s~ 一eontin u ous eul 姗 , fe d一batcb a目t叮e ,
co nonuous cul 姗 . 改. D 政 re nt culti v咖 n te chn olo gi es have the ir own advan 娜卿 翻d 山dvan 叫笋 . To le arn mo 二 .场ut th e
Pro ces in g rul es of eeli grD w tb , 二 . 加石协 胡d Prod u ct s th es is o f b ac 沈ri um str 田幻 un de r van ous P ro du ct co ndi d ons 15 ben efi蒯 to th e
con tr o o f 企rm en助 on Pro ces .
K 6y we rds : 肠 ero be Ferm en如 on C ulti 灿 on teehn o logy A d van 钾罗5 D ISa dvan t利乒s
狭义的发醉是指在厌氧条件下葡萄糖通过醉
解途径生成乳酸或乙醇的分解代谢过程 广义则将
发醉看作是徽生物把一些原料养分在合适的发醉
条件下经特定的代谢途径转变成所需产物的过程
川徽生物发醉是许多用于医药 食品和化学工业
的生物产品的重要来源 , 过程中受诸多因素影响 ,
并且各种因素相互制约 , 所以要比较其优缺点 ,选
择适合试验菌种的发醉工业条件
1 分批培养
分批发醉是一种封闭培养系统 ,含有初始限制
量的基质的发醉方式 ,菌体接种到培养基后除了气
体流通外发醉液始终留在生物反应器内 分批培养
过程中微生物生长一般可以分为四个阶段 : 延滞
期 对数生长期 衰减期 稳定期 在接种后一段时
间 ,细胞数目和菌体量不变 ,因菌体对新的生长环
境有一个适应过程 ,所以工业生产从发醉产率和发
醉指数以及避免染菌考虑 , 应尽量缩小延滞期 扩
大生长期 延滞期过后进人对数生长期 ,如果条件
收稿 日期:2(X 为一03 一10
作者简介 :王搜 (1981 一),女 ,研究实习员;E一m :wan .川助81 @ 163 .~
通讯作者:蔡友琼 ,男 ,副研究员;E一画 I: youqio爬闷163 .~
2 X为 年 增 刊 王媛等:微生物发酵过程的多种培养技术 123
良好 ,营养充分 ,微生物会以最大生长速率生长I2]
经过一段时间 ,由于养分的消耗和微生物产物的分
泌 ,生长速率逐渐减速直到停止 从对数生长期到
稳定期有一个过渡 ,称为衰减期 ,衰减期的长短取
决于菌对限制性基质的亲和力 ,例如对基质的亲和
力高 (具有低 Ks 值 ) ,则衰减期很短 ,反之 ,则长13
当生长率下降为零时 , 便进人稳定期 , 但是正如
Bul ll]所指出的 , 稳定期 不是一个恰当的说法 ,因
为这一时期菌体代谢仍然十分活跃 ,有许多次级代
谢产物在此时合成
分批培养的产物大概可以分为两种 :(l) 与生
长联动的产物 ;(2 )与生长不联动的产物 前者相当
于初级代谢产物 , 由正在生长的细胞合成 ,后者相
当于次级代谢产物 ,多在稳定期中合成l5] 若所需
产物不同 ,要选择不同的分批发酵工艺 对产物是
细胞本身 , 可采用能支持最高生长量的培养条件 ;
对产物是初级代谢产物 ,可设法延长与产物关联的
对数生长期 ;对次级代谢产物 ,可缩短对数生长期 ,
延长稳定期 ,或降低对数生长期的生长速率 ,从而
使次级代谢产物更早形成
分批培养的优势有操作简便 ,周期短 ,染菌的
机会减少和生产过程 产品质量较易掌握 ,并且分
批发酵在优势条件下对数生长期会以最大生长率
生长 分批发酵在工业生产中仍然具有重要的地
位 ,但是也有其局限性 :(l) 培养过程中存在基质抑
制问题 ,生长受到限制 ,包含有底物限制和毒素限
制两种 ,如果对基质浓度敏感或是对毒素累积敏感
的产物 ,采用分批培养不合适一,产率较低 (2) 进行
分批操作时 ,每次工作前都要进行设备 材料 培养
基等的灭菌 ,消耗较多的人力和时间等
2 分批补料培养
在发醉开始时投人一定量的基础培养基 ,到发
酵过程的适 当时期 , 开始连续补加碳一 能源或
(和)氮源或(和 )其他必需基质 ,直至发酵液体积达
到发酵罐最大操作容积后 , 将发酵液一次全部放
出 ,这种操作方式称为分批补料发酵16 分批补料
培养 ,最初以分批方式建立 ,因为简单分批发醉不
能维持一定的菌体浓度 ,当基质消耗后菌体将加速
死亡 ,使活细胞数量迅速下降 ,分批补料由于持续
供给菌体维持和生长所需的营养 ,故能保持发醉液
中有较高的活菌体浓度 ,从而克服上述缺点 另外 ,
不断的补料稀释 ,对降低发酵液的粘度 ,改善流变
学性质 ,强化好氧发醉的供氧 ,也是十分有利的 分
批补料发酵目前已广泛应用于各种发酵产品的工
业生产中 ,与传统的分批发酵相比 ,优点在于使发
酵系统中维持很低的基质浓度 低基质浓度的优
点 :(l) 可以除去快速利用碳源的阻遏效应 ,并维持
适当的菌体浓度 ,使不至于加剧供氧的矛盾 (2) 避
免培养基积累有毒代谢物 与连续发酵相比 ,分批
补料发酵不需要严格的无菌条件 ,也不会产生菌种
老化和变异等问题 ,其应用范围十分广泛 ,包括抗
生素 氨基酸 酶蛋白 核昔酸 有机酸及高聚物等
分批补料培养的方式有变体积 定体积 循环
分批补料培养 变体积一般有两种情况 :加人与用
于构建分批培养同样的培养基导致体积增大 ;加人
与初始培养基浓度相同的限制基质溶液引起体积
增大 如果限制性底物以浓缩的方式加人 ,并且以
较慢的流速 ,那么液体的体积基本保持常数 ,这就
是定体积分批补料 循环的分批补料是变体积分批
补料发醉周期的延长通过放出一部分培养液 ,而残
留的培养液又作为起点开始进行分批补料的过程
循环的分批补料体积上减少能导致稀释率显著增
加 ,也就是生长率增加 ,随后生长率逐步减少 ,导致
半稳态重新建立 ,所以生长速率是周期性的上升有
周期性的下降
3 半连续培养
一部分培养物有规律的间隔收获以及被等体积新鲜培养基替换的培养方式称为半连续培养 半
连续培养在分批补料的基础上 ,间歇放掉部分发酵
液 ,与其他发酵雌的发醉液一起进行提炼 ,通常在
行业中称为带放l] 这种方式可以通过补充养分和
放掉部分发酵液 ,使发酵持续下去 ,因为在发醉中
有害物的积累 ,也会造成合成产物遭到抑制 ,所以
放掉一部分发醉液再补人适当原料 , 使得营养充
分 ,代谢有害物浓度稀释 ,从而有利于产物的继续
合成
但是半连续发醉也有它的不足之处 :(1) 放掉
发酵液的同时也丢失了未利用的养分和处于生长
旺盛的菌体 ;(2) 定期补充和带放使发酵液稀释 ,送
去提炼的发酵液体积更大 ;(3) 发酵液稀释后可能
124 性物技术通稚 忍白翻hno 饭盯 2(X 为 年 增 刊
产生更多的有害代谢物 , 最终限制发酵产物的合
成 ;(4 )一些经代谢产生的前体可能丢失 ;(5) 有利
于非产生菌突变株的生长 因此 ,采用该法时要考
虑到这些限制 ,要具体问题具体分析
半连续发醉在由海洋微藻 Po 印 hyridiu m Cru en -
tu m 产生的藻红素 (又称为藻红蛋白 ,Phyc oe ry -
th rin ) ,外多糖和多不饱和脂肪酸生产上得到应用
目前 ,为了优化这些有价值化合物的生产 ,Feb re gas
等试 验了 Po rPh yridin m cru en tu m 的半连续发酵的
培养基不同更新速率对各种代谢产物合成的影响
I,] Fe bre ga 等也将半连续发酵应用于其他菌种18
4 连续培养
连续培养是发醉过程中一面补人新鲜的料液 ,
一面以相同的流速放料 , 维持发酵液在原来的体
积 连续发醉是一个开放系统 ,通过连续流加新鲜
培养基并以相同的流量连续地排出发醉液 ,可以使
微生物细胞群体保持稳定的生长环境和生长状态 ,
并以发醉中的各个变量都能达到恒定值而区别于
瞬变状态的分批发醉 连续发酵对于微生物典型的
生长曲线实际上是尽量缩短或消除延滞期 ,使菌体
一直处于良好的条件下 ,以最大生长率生长 ,获得
较高的菌体量
连续发酵包括恒化器发酵和恒浊器发酵 前者
以某种必需营养作为生长限制基质 ,通过控制其流
加速率造成适应这种流加条件的生长密度和生长
速率 ;后者控制生长限制基质的流量以维持恒定的
菌体密度Iel 无论恒化器还是恒浊器 ,除了控制进
出口物料流量外 , 许多重要的环境因素如温度
pH 空气流量 压力等也必须加以控制以保持稳
定 同时 ,还应具有良好的搅拌混合条件 ,使整个发
醉液中所有物质的分布都达到均一 ,以保证流出液
中各物质的浓度与反应器中的浓度相同 一般多用
恒化器 ,但有时恒化器也会有偏差或异常 ,由于不
完全的搅拌和器壁猫附 ,恒化器的改良可以通过增
加容器的级数 ,将菌体反馈到容器中等手段来实现
12 ,例如 ,多级恒化器 内部反馈系统和外部反馈系
统
连续发醉具有的优点 :(l) 能够维持较低的基
质浓度 ;(2) 可以维持稳定的操作条件 ,连续培养具
有稳态优势 ,从而使产率和产品质量也相应的保持
稳定 ;(3) 便于自动控制 ,有效的实现机械化和自动
化 ,降低劳动强度 ,减少操作人员与病原微生物和
毒性产物接触的机会 ;(4 )减少设备清洗 准备和灭
菌等非生产占用时间 ,提高设备利用率 ,节省劳动
力和工时;(5) 由于灭菌次数少 ,使测量仪器探头的
寿命得以延长 ;(6) 容易对过程进行优化 ,有效的提
高发酵产率
但是连续发醉并未在大规模生产中得到较好
的应用 ,原因在于它也有不足之处 :(l) 对仪器 设
备及控制元件的技术要求较高 , 从而增加投资成
本 ;(2) 连续培养是开放系统 ,并且发醉周期长 ,有
极大的可能性造成菌体染菌 ,这也是生产成败的关
键问题 ;(3) 在长期的发酵过程中 ,微生物容易发生
变异 , 菌株退化问题也限制了大型连续培养生产 ,
生产慢的高产菌株很可能逐渐被生长快的低产变
异菌株取代 ,从而降低生产效率 ;(4 )丝状真菌菌体
容易附着在器壁上生长以及在发酵液内结团 ,给连
续发酵操作带来困难
鉴于以上情况 ,连续发酵目前主要用于研究工
作中 ,如发酵动力学参数的测定 ,过程条件优化的
实验 研究微生物的特性 微生态学研究和微生态
制剂的生产19等 ,已经应用于工业生产的由单细胞
蛋白 醉母 酒精 醋酸 丙酮丁醇溶剂等 ,以及连续
培养中的恒化器可以较好地分离改良微生物 ,筛选
高产菌株 ,运用于污水的生物处理等方面
5 其他, 要技术
5.1 膜分离与发酵的辐合
为解决产物反馈阻遏和代谢有害产物限制的
问题 ,理想的办法是在发酵过程中产物积累时将产
物即使从发酵液中分离与回收 膜分离技术与发酵
的辆合可避免菌体丢失这一缺点 ,可排除有害代谢
物 ,避免或减轻产物的反馈抑制 ,从而使高密度细
胞培养成为可能 , 更合理的利用微生物的生产性
能 ,以提高产率 与膜结合的生物反应器在这方面
最能发挥他的特长
膜生物反应器是一种借助于膜截留住酶 细胞
器 微生物 动物或植物细胞 ,用以生产较为贵重的
物质 ,或进行污水处理Il按 Chan g 等的报道110 ,膜
生物反应器可以分为两类 : 第一类用膜保留培养
物 ,使之悬浮于生物反应器中 ,不会因微滤或透析
2 X )9 年 增 刊 王媛等:微生物发酵过程的多种培养技术 125
作用是细胞流失 ,因而水流和培养物在反应系统中
的持留时间各异;第二类把生物催化剂固定在膜表
面上或网格中或夹持在两张膜的中间 , 因此 ,生物
催化剂是不能运动的
膜技术的优点除了排除有害代谢物 避免反馈
抑制外 , 可以提高发酵中有机酸的产率 , 乙醇 丙
酮 丁醇发酵的反馈抑制 ,在基因工程菌的培养 超
氧歧化酶生产 单克隆抗体生产等方面都能达到较
高的产率
5. 2 高细胞密度培养
代谢产物的合成是靠菌(生产者 )来完成的 菌
量越多 , 自然产量就越大 ,条件是菌的生产力能保
持在最佳状态和具备适当的生产条件 ,包括足够的
产物合成所需的基质 前体 诱导物等和没有有害
代谢物的积累 高细胞密度培养曾成功地应用于各
种代谢产物的生产 , Ri es enberg 对此作过一篇较全
面的综述[川
高细胞密度培养一般指微生物沉没培养时其
细胞浓度达到 lo glL 以上的水平 最早应用于生
产单细胞蛋白 乙醇等 可用于高细胞密度培养的
生物反应器类型有常用的搅拌罐和带有外置式或
内置式细胞持留装置的反应器 , 一般多用于研究 ,
在工业生产中 ,还是采用一般的搅拌罐与补料工艺
进行高细胞密度培养 ,因为它简单 生产潜力高 ,适
合于进行多参数的相关控制
高细胞密度培养的主要问题 :在水溶液中的固
体与气体物质的溶解度 ,基质对生长的限制或抑制
作用 ,基质与产物的不稳定性和挥发性 ,产物或副
产物的积累达到抑制生产的水平 , 肠胃道降解 ,高
的二氧化碳与热的释放速率 ,高的氧需求以及培养
基的猫度不断增加
还有其他有别于传统发酵的培养技术如混合
共培养系统 ,溶剂萃取与发酵藕合 ,膜固定化细胞
反应器 ,挥发性产物的回收 ,保证高活性的 呼吸
膜 等技术由于应用于某一方面的发酵 ,范围较小 ,
就不一一详述了 此外 ,微生物发酵技术结合生物
学技术 基因工程技术等应用于制药业越来越广
泛 ,逐步形成一股新的趋势Il2)
综上 ,对各种培养技术的深人了解有利于了解
生产菌在合成产物过程中的代谢控制机制以及可
能的代谢途径 ,为设计合理的生产工艺提供理论基
础 通过其他学科一化学工程和计算机应用的发展
与菌种培养技术的相互结合为生产中发酵工艺控
制和条件的优化开创一个良好的局面
参考文献
1 储炬 李友荣.现代工业发醉调控学.化学工业出版社 ,2(X) 2 :
2 30- 2 5 0 .
2 PF Stan bury , A Wh itak er , S Hal .Pri nc inl es of Fe rm en ta ion
T ec hn o1 0gy , 19 5 :13~33 .
3 俞俊棠 唐孝宣.生物工艺学(上册 ).华东理工大学出版社 ,
2 (X) 3 : 1 5 0- 16 7 .
4 B ul AT . M iero bial G 门w th . In C om 侧切lon to B i, hem istry . 肠昭 -
m a n , 肠 nd o n , 19 7 4 :4 15 叫4 2 .
5 P in SJ . Pri nc ip e8 Of M icro be an d c el C ultivati on . BI, kw el ,
伪而记 , 197 5.
6 熊宗贵.发醉工艺原理.中国医药科技出版社 , 19 5:17 1一17 8.
7 Fab r叫笋. J , C 毗 ia D , M O司 e8 E , D O而 ngU ez A , ot 的 AJ
B io~ sc ienc& B i. 雌 , 19 8 , 86 (5 ):4 77 .
8 Ot ero A , C 毗 ia D , M 司 es E D , A Zan J , F ab 代吧aS J.B io比 hnol.
A pPI .Bioc hem , 19 7 , 26 (2):171.
9 曹郁生.应用生态学报 , 2仪犯, 13 (5):629 佑31 .
10 c han g H N , Furu 助山1 5 . A dy. B i, hem . E ng. B iot ec hnol ,
!9 1 , 4 :27 64 .
11 凡 ese 司兄rg D , G u止山 e R . A pp M iorob iol B iot ec hnol , 19 5 .5 1
(6 ):422.
12 htP 沼w , , .ist s. sb. c确 .仍 ist. as pid =4 72 .