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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010 年第 6 期
青藏高原药用植物内生细菌多样性研究
马芸1 谢占玲1 李德英1 马志杰2
(1青海大学生物系，西宁 810016;2青海大学畜牧兽医科学院，西宁 810016)
摘 要: 采用传统的分离方法和分子生物学的技术，对我国青藏高原药用植物党参、黄芪、连翘的内生细菌进行遗传多
样性的研究，共分离到 42 株内生细菌，分属于 9 个属，其中微球菌属(Micrococcus sp.)为此类群的优势菌群。所分离到的所有
菌株均属于兼性嗜碱菌和耐盐菌，这也反映了青藏高原高盐碱性的土壤性质。所分离到的 3 种药用植物内生细菌均对抗生素
有一定的抗性，也证明了药用植物内生细菌与药用植物本身一样，具有某些抗药活性。
关键词: 青藏高原 药用植物 内生细菌 多样性研究
The Research on the Diversity of Endophytic Bacteria in
Qinghai － tibet Plateau Medicinal Plant
Ma Yun1 Xie Zhanling1 Li Deying1 Ma Zhijie2
(1Deparement of Biological Science，Qinghai University，Xining 810016;
2Academy of Animal and Veterinary Science Medicine，Qinghai University，Xining 810016)
Abstract: The endophytic bacteria from Qinghai-Tibet plateau medicinal plant，Codonopisis pilosula，Astragalus membranaceus，
Forsythia suspcnsa were isolated and identified by using traditional cultural methods combined with molecular biotechnology to explore
bacterial community diversity. A total of 42 endophytic bacteria were isolated，which belongs to 9 genera，where Micrococcus is the most
prevalent genera. All of the strains isolated belong to the facultative alkalophilic bacteria and salt-tolerant bacteria，which also reflects
high salinity of Qinghai-Tibet plateau soil properties. All of the strains have a certain degree of resistance to antibiotics，also proved
that the medicinal plants of endophytic bacteria as the medicinal plant itself has some resistance activity.
Key words: Qinghai-tibet plateau Medicinal plant Endophytic bacteria Community diversity
收稿日期:2010-01-19
基金项目:国家自然基金项目(30960014)
作者简介:马芸，女，助教，研究方向:环境微生物学;E-mail:homon_1982@ yahoo. com. cn
青藏高原是世界上最高的高原，有“世界屋脊”
和“第三极”之称，较强的太阳辐射，氧气不足，低温
和干旱的天气使动植物很难在这里生长。本研究所
涉及的 3 种药用植物党参、黄芪、连翘均喜凉爽气
候，有较强的抗寒、抗旱能力。它们发达的地下根系
能够防风、固沙固土，是优良的生态先锋植物。长期
以来，我国对党参、黄芪、连翘这 3 种药用植物的研
究主要集中在化学成分、药理作用、临床应用等方
面，取得了显著成果。随着人们对药用植物需求量
的日益扩大，发展人工种植药用植物成为解决野生
药用植物资源不足，保护环境的惟一出路。目前，
人们已在药用植物的育种，栽培技术等多方面开展
了研究，而涉及到微生物与药用植物之间的研究却
开展得不多。
植物内生细菌是指能定殖在健康植物组织内，
并与植物建立了和谐联合关系的一类微生物。内生
菌对宿主是有益的，可以产生一系列自然物质，在医
药、农业和工业生产中都有巨大的应用潜力［1］。现
在已研究的植物微生态系统涉及植物约 30 种，其中
包括小麦、高梁、水稻、棉花、土豆、番茄、黄瓜、甜菜
和柠檬等，但对中草药内生细菌的研究并不多
见［2］。为此，本试验室采用微生物和分子生物学手
段对党参、黄芪、连翘 3 种药用植物内生细菌进行了
分离和鉴定，对微生物类群及理化性质作了初步的
研究，也进一步探讨了植物所生长的环境对植物内
生细菌的影响。
2010 年第 6 期 马芸等:青藏高原药用植物内生细菌多样性研究
1 材料和方法
1. 1 供试植物
试验用栽培的党参(Codonopisis pilosula) ，黄芪
(Astagalus membranaceus) ，连翘(Forsythia suspcnsa)
组织材料均采自青海西宁二十里铺植物园(36°34′
N，101°49′E，海拔 2 350 m)。采样时选择无病害症
状、无虫孔的材料，并与根际土一同带回实验室。
1. 2 内生细菌的分离与纯化
取党参，黄芪，连翘的植物叶片 1 g，用无菌水
冲洗，滤纸吸收水分。依次用 70%的酒精表面消毒
30 － 60 s，无菌水冲洗;1‰的升汞浸泡 8 － 10 min
(彻底消毒) ，无菌水冲洗;同时取最后一次冲洗叶
片的无菌水 200 μL 涂于 LB 固体培养基平板上，
28℃培养 72 h，检测表面灭菌效果。
将表面灭菌处理后的植物叶片研磨后，按逐级
稀释法稀释，最终稀释浓度为 105倍。取不同稀释
浓度的匀浆液 200 μL 涂布于 LB 培养基上。不同
浓度做 3 个重复，于 28℃培养 48 h。记录每个平板
上菌落的数量，同时根据菌落形态(大小、形状、颜
色、表面光泽等) ，挑取有差异的菌落在相同培养基
的平板上进行划线纯化培养，纯化后的细菌接种于
相应培养基斜面上，4℃ 保存备用。
1. 3 内生细菌 DNA的制备及 16S rDNA 的扩增
采用 SDS法提取细菌 DNA［3］。扩增采用细菌通
用 引 物 27f 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ 和
1492r 5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′。PCR 体
系(25 μL) :细菌模板 DNA 2 μL，10 × Buffer 2. 5 μL，
2. 5 mmol /L MgCl2 2. 5 μL，0. 2 mmol /L dNTP 0. 5 μL，
正反向引物各 10 pmol /L 2μL，1 U Taq DNA 聚合酶
(MBI)0. 2 μL，加水补足 25 μL。PCR扩增:94℃预变
性 2 min后，94℃变性 40 s，50℃复性 45 s，72℃延伸
90 s，进行 30个循环，72℃延伸 10 min，结束反应。
1. 4 扩增片段的限制性酶切分析
分别用 Hae Ⅲ和 Hin 6I 两种限制性内切酶对
16S rDNA所有菌株的 PCR 产物进行限制性内切酶
片段长度多态性分析(RFLP) ，并筛选出酶切图谱清
晰，差异明显的菌株进行 16S rDNA 基因扩增和测
序。酶切反应总体积为 15 μL ，含 10 μL PCR 反应
产物，0. 3 μL 内切酶和 1. 5 μL 10 ×反应缓冲液。
37 ℃水浴 4 h 后，取 10 μL 酶切产物在 2. 5%的琼
脂糖凝胶上进行电泳检测。
1. 5 内生细菌 16S rDNA 序列测定与同源性比对
将筛选出的具有典型 RFLP带型的菌株进行 16S
rDNA基因测序，序列长度为 1 500 bp，送上海生物工
程技术服务有限公司，测序引物为 27f，517f，907f。
将序列提交到 GenBank 登记，收录号为 FJ948277-
FJ948288。在 GenBank 中用 BLAST 进行比对分析，
寻找具有较高同源性的 16S rDNA 序列。用 CLUST-
AL X作多序列比对，MEGA(version 3. 1)软件作系
统发育及分子进化分析。
1. 6 内生细菌最适 PH值的测定
取 100 μL培养至对数生长期的各菌原液，加入
5 mL pH值分别为 4. 0，5. 0，6. 0，7. 0，8. 0，9. 0，10. 0，
11. 0的 LB液体培养基中。置于 28. 0℃，121 r /min摇
床培养 24 h后观察细菌的生长情况。
1. 7 内生细菌耐盐性的测定
取 100 μL 培养至对数生长期的各菌原液加入
5 mL不同 NaCl浓度(终浓度分别为 5%、7%、9%、
11%)的 LB液体培养基中，置于 28℃，121 r /min 摇
床培养 24 h，观察其浑浊度或测 OD值。
1. 8 内生细菌天然抗药性的测定
羧苄青霉素(Carbenicillin，Car)、四环素(Tetra-
cycline，Tc)、卡那霉素(Kanamycin，Km)、链霉素
(Streptomycin，Sm)、利福平(Rifampicin，Rf)、庆大
霉素(Gentamicin，Gm)的抗生物纸片(购自杭州天
和生物公司)。将摇培至对数期的的菌液 200 μL加
入 LB固体培养基中涂布均匀，而后将抗生素纸片
丢入固体培养基中。28. 0℃培养 3 d，每个浓度 3 个
重复，观察菌株的生长状况及抑菌圈的大小。表 1
为各抗生素纸片的浓度。
表 1 各抗生素纸片的浓度
抗生素 Car Gm Km Tc Rf Sm
浓度(μg /片) 100 120 30 30 5 300
1. 9 土壤理化性质的测定
1. 9. 1 土壤含水量的测定 称取约 30 g 土装于已
经称好重量的铝盒中，于 105℃烘烤 8 h，再称量烘
烤后的铝盒和土壤的总质量，按照下面的公式计算
出土壤的含水量:Sm =(M1-M2)/(M1-M0)× 100%。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
其中，Sm 为土壤含水量，M0为空铝盒质量;M1为铝
盒质量 + 湿土样质量;M2为铝盒质量 + 干土样
质量。
1. 9. 2 土壤 pH 值的测定 根据国标法测得土壤
的 pH值［4］:称取 1 g风干过筛(60 mesh)的土壤，浸
泡于 5 mL饱和的 NaCl 溶液中，摇床上震荡 30 min
后，放到酸度计中测得其 pH 值。每个样测量 3 个
平行，取平均值。
1. 9. 3 土壤含盐量的测定 称取土样 10. 00 g，放入
100 mL小烧杯内，加入无 CO2的蒸馏水 5 mL，搅拌
3 min，静置 1 h，用电导仪测定其电导度，记录数
值［5］。同时利用已知浓度的 NaCl溶液作标准曲线:
y = 1. 977x + 0. 1298，R2 = 0. 999。将已测得的数据
代入上述标准曲线方程，即可得到配好的土壤溶液
的可溶性盐浓度;将上述浓度折算成土壤的含盐量。
2 结果
2. 1 内生细菌的分离结果
将采集的党参、黄芪、连翘的叶片表面消毒后进
行组织内部内生细菌的分离。结果发现培养基中长
出大量菌落，菌落形态存在明显的差异，说明 3 种药
用植物叶片组织内不仅存在大量的内生细菌，而且
内生细菌的类群丰富，共获得内生细菌 42 株。依据
菌落的形态进行归类，在单菌落的颜色、大小、突起
特征、边缘特征、表面光滑与否和透明度等任意一个
方面存在有差异，就归为不同的类群。在已分离出
的内生细菌中有 83. 33%的菌株可产黄色、橘红或
肉红色色素。
2. 2 16S rDNA 扩增和限制性酶切结果
以 27f和 1492r为引物，特异性地对部分 16S
rDNA区段进行扩增，所有供试菌株均可获得 PCR
产物，扩增片段大小约为 1. 5 kb 左右。将扩增的
PCR 产物用 Hae III和 Hin 6I 两种内切酶进行酶切
分型(图 1) ，将 2 个酶切图谱类型完全相同的细菌
划分为一个操作分类单元(operational taxonomy u-
nit，OTU)。
2. 3 可培养内生细菌的遗传多样性研究
由图 2可以看到，虽然所分离出来的内生细菌来
自 3种不同的植物，但 3种药用植物内生细菌的亲缘
关系较近。药用植物内生细菌共形成 β-proteobacte-
ria，高 G + C 含量的革兰氏阳性细菌(HGC)、Firmi-
cutes(厚壁菌门)和嗜纤维菌 /黄杆菌 /拟杆菌群
(CFB)4 大类群，其种属类型丰富，其中 HGC(革兰
氏阳性细菌)所占比例较高为 58. 33%，而微球菌属
(Micrococcus sp.)为此类群的优势菌群。其次为
Firmicutes(厚壁菌门)和 CFB 类群，均占总分离物的
25%，种属分布较为分散。在 β-proteobacteria 中，只
有不动杆菌属(Acinetobacter)。
2. 4 内生细菌的最适 pH值
由表 2 可以看到，3 种药用植物内生细菌在酸
性较强的环境中生长均很弱，在 pH7. 0 － 9. 0 的中
性偏碱性环境中，各菌株长势均较好;在 pH10. 0 －
11. 0 碱性浓度较大的环境中，DS-1、DS-3、HQ-1 和
HQ-4 四株菌较其他菌株生长好。菌株 DS-3 为嗜碱
微生物，该菌株在 pH6. 0 以下均不生长，其他菌株
均为兼性嗜碱微生物，它们既能在 pH > 7，又能在
pH <7 的微酸性环境中生存，反映了 3 种药用植物
内生细菌对当地环境较好的适应性［6］。
图 1 内生细菌部分菌株的 16S rDNA酶切图谱(Hae III和 Hin 6I)
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2010 年第 6 期 马芸等:青藏高原药用植物内生细菌多样性研究
表 2 各菌株在不同 pH下的生长状况
pH 4. 0 5. 0 6. 0 7. 0 8. 0 9. 0 10. 0 11. 0
DS-1 － － + + + + + + + + + + + －
DS-2 － － + + + + + + + + + + + + －
DS-3 － － － + + + + + + + + + +
DS-4 － － + + + + + + + + + + + －
HQ-1 + + + + + + + + + + + + + + + + －
HQ-2 － － + + + + + + + + + －
HQ-3 － － + + + + + + + + + + －
HQ-4 + + + + + + + + + + + + + + + + －
LQ-1 － － + + + + + + + + + + －
LQ-2 － － + + + + + + + + + + －
LQ-3 － － + + + + + + + + + + + －
LQ-4 － + + + + + + + + + + + + －
+ －为生长较为缓慢
图 2 三种药用植物内生细菌 16SrRNA基因序列的系统发育树图
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2010 年第 6 期
2. 5 内生细菌的耐盐性
在 0% －8%以上的 NaCl 浓度的培养基中都能
生长的菌称为耐盐菌。培养基中 NaCl 浓度低于
8%时不能生长或在蒸馏水中细胞发生破裂的是嗜
盐菌［7］。表 3 是各菌株在不同 NaCl 浓度下的生长
状况，所有菌株均在 NaCl 浓度为 0% － 8%的培养
基中生长，说明菌株的耐盐性很强，所有菌株均属于
耐盐菌［7］。
表 3 各菌株在不同 NaCl浓度下的生长状况
菌株
NaCl浓度(%)
5 7 9 11
DS-1 + + + + + + + +
DS-2 + + + + + + + + +
DS-3 + + + + + + + + +
DS-4 + + + + + + + +
HQ-1 + + + + + + + －
HQ-2 + + + + + + + + +
HQ-3 + + + + + + + +
HQ-4 + + + + + + －
LQ-1 + + + + + + + + +
LQ-2 + + + + + + + +
LQ-3 + + + + + + －
LQ-4 + + + + + + + +
2. 6 内生细菌的天然抗药性
相关资料显示，党参，黄芪，连翘均有抗炎抑菌
活性［8］，本试验对 3 种药用植物党参，黄芪，连翘做
了抗药性测定。由表 4 可以看出，从党参中分离出
来的内生细菌对抗生素均有抑菌活性，黄芪和连翘
中只有部分对抗生素有一定的抑菌活性。
3种移栽的药用植物党参，黄芪，连翘中的内生
细菌对抗生素均有一定的抗药性，这在极大程度上丰
富了药用植物内生细菌的生物学作用;也证明了药用
植物内生细菌与药用植物本身一样，也具有某些抗药
活性，如产生抗菌活性物质，抗病毒活性物质等。
2. 7 土壤理化性质分析
表 5为采样地土壤理化性质分析，土壤偏碱性，
pH >7. 5;土壤的含盐量为 1. 3259%，此采样地的土
壤为轻度盐渍土;土壤的含水量也较低仅为
0. 1688% ［9，10］。而由表 2可知，各菌株均能在pH7. 0 －
10. 0的培养基中生长，除 DS-3为嗜碱菌外，所有菌株
均为兼性嗜碱菌;由表 3 可知，各菌株均能在 5% －
9%的 NaCl 中生长，各菌株均为耐盐性菌。由此可
见，所采集的土壤能在一定程度上反映当地的环境气
候特点，而 3种药用植物内生细菌的理化性质在一定
程度上也反映了当地的环境气候特点。
表 4 各菌株对不同抗生素的抗性
菌株
抗生素浓度(μg /片)
Car Gm Km Tc Rf Sm
100 120 30 30 5 300
DS-1 + + +
DS-2 +
DS-3 +
DS-4 + +
HQ-1 + +
HQ-2
HQ-3 + +
HQ-4
LQ-1
LQ-2
LQ-3 + + +
LQ-4 +
表 5 土壤理化性质实测值(珔x ± s)P <0. 05
土壤理化性质 含水量(%) 含盐量(%) pH值
0. 1688 ±0. 0028 1. 3259 ±0. 0675 7. 9367 ±0. 0410
3 讨论
本研究从 3 种药用植物党参、黄芪、连翘中共分
离到 42 株内生细菌，分属于 9 个属，其中微球菌属
(Micrococcus sp.)为此类群的优势菌群;并且 HGC
(革兰氏阳性细菌)所占比例较高为 58. 33%。在较
温和的环境中，内生细菌的生长温度较高(10 －
48℃) ，多为适温菌;革兰氏阳性细菌所占比例较小，
绝大部分为革兰氏阴性细菌(占 75% －100%)［11］。这
说明地理位置不同而气候条件相似(低温、强辐射)
的环境中所蕴育的微生物的特性也是相似的(耐
冷、抗辐射) ，也是微生物对环境适应性和生存策略
的体现［12］。在已分离出的内生细菌中有 83. 33%的
菌株可产黄色、橘红或肉红色色素;已有研究表明，
胡萝卜素、类胡萝卜素等色素的产生对细菌抗紫外
辐射有较强作用［13］。Fong等［14］还发现类胡萝卜素
的产生与微生物的冷适应性有相关性。可能正是这
些色素的产生才使得青藏高原植物内生细菌能在这
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样恶劣的环境下生存下来，这对植物的抗辐射和耐
冷性也有一定的协同作用。
目前所研究的植物内生细菌多为研究内生细菌
的生理生化特征，没有相关报道将植物内生细菌的
生理生化性质与植物所生长的环境相联系。在植物
与环境之间的动态关系中，植物的根、茎、枝叶都会
影响到植物内生菌的微生物群落结构［15］。以前的
研究表明，微生物的群落结构在不同的植物之间也
不同［16］。本试验就 3 种药用植物内生细菌的生理
生化性质与植物所生长土壤的生理生化性质相结
合，揭示了环境对植物内生细菌的影响。我们从 3
种移栽的青藏高原药用植物党参、黄芪、连翘中所分
离到的内生细菌均可在 pH7. 0 － 10. 0 之间生长，且
所有菌株均为兼性嗜碱菌;由土壤的理化性质可以
看到，土壤的 pH 是 7. 9367 ± 0. 0410，偏碱性，为碱
性土壤。可以揭示土壤的酸碱性在一定程度上对植
物内生细菌的理化性质有一定的影响，且植物内生
细菌的理化性质也在一定程度上反映了当地的环境
气候特点，两者之间具有一定的联系和相关性。
在 0% － 8%以上的 NaCl 浓度的培养基中都
能生长的菌称为耐盐菌。本试验所研究的 3 种移
栽的青藏高原药用植物党参，黄芪，连翘植物内生
细菌均可在 0% － 8%的 NaCl培养基中生长，均为
耐盐菌;由土壤的理化性质可以看到，土壤的含盐
量为(1. 3259 ± 0. 0675)%时，为轻度盐渍化土壤，
这在一定程度上反映了植物内生细菌的耐盐性与
当地的土壤的盐渍化有一定的相关性，也反映了
当地的环境气候特点。土壤的含水量为(0. 1688
± 0. 0028)%，土壤较为干燥，这与土壤的含盐量
和 pH值也具有一定的互作关系。从而可以得出
植物内生细菌的理化性质在一定程度上受到所生
长环境因子的影响，也反映了当地的土壤特点和
环境气候特点。
本试验首次对青藏高原药用植物内生细菌做了
较为全面的研究，采用分子生物学和传统的纯培养的
方法对分离出的植物内生细菌有了较为全面的认识，
揭示了植物内生细菌与环境的关系，较为客观的反映
了植物内生细菌的生理生化特性，从本质上也是对所
处环境的一种适应。也给了我们较新的思路去认识
植物内生细菌，对其机制的探索也有了一定的方向。
所分离到的内生细菌均来自药用植物，因此所做的抗
药性试验，在一定程度上也说明了药用植物内生细菌
与药用植物本身一样，也具有某些抗药活性。
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