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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 11 期
重组人胰激肽原酶在大肠杆菌中的表达
侯乐锋 陈劲春 卢嘉宝
(北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029)
摘 要: 根据人胰激肽原酶的氨基酸序列，采用大肠杆菌偏爱密码子，设计合成目的基因片段约 750 bp。将设计得到的
片段连接到 pET-22b(+)表达载体中并测序，将重组质粒转化到大肠杆菌 Rosetta中进行诱导表达。将 IPTG诱导表达的菌体
进行 SDS-PAGE电泳，在相对分子质量 24 kD处可明显观察到高表达带，主要以包涵体形式存在，质量分数可达 21. 6%，进一
步测得蛋白活性为 2. 27 nmol /s。利用 MALDI串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS /MS)鉴定蛋白，蛋白得分 106，大于可信得
分 83(P ＜ 0. 05) ，确定了蛋白一级结构的正确性。
关键词: 大肠杆菌 人胰激肽原酶 表达
Expression of Human Pancreatic Kininogenase in Escherichia coli
Hou Lefeng Chen Jinchun Lu Jiabao
(College of Life Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing 100029)
Abstract: In this research project，based on the amino acid sequence of human pancreatic kininogenase，a 750 bp DNA was de-
signed and synthesized according to preferred codons in E． coli． Then the fragment was subcloned into the pET-22b(+)vector and con-
firmed by sequencing． E． coli cell with this constructed plasmid was induced with IPTG for target protein expression． Lysate of bacteria
was detected by SDS-PAGE and a distinct band could be seen at 24 kD compared with control． The results showed that the gene was ex-
pressed successfully with a content of 21. 6% and the activity of 2. 27 nmol /s． The proposed primary structure of the expressed protein
was verified by MALDI-TOF-MS /MS． The identification score for the protein was 106，which was greater than 83 (P ＜ 0. 05) ，and sig-
nificant．
Key words: Escherichia coli Human pancreatic kininogenase Expression
收稿日期:2011-03-01
作者简介:侯乐峰，男，硕士，研究方向:分子生物学;E-mail:houlefeng0401@ 163. com
通讯作者:陈劲春，博士，教授，博士生导师，研究方向:药物技术和纳米生物技术;E-mail:jingchunchen@ hotmail. com
激肽原酶(kininogenase)是人体激肽体系的重
要成员，在体内起着重要生理作用［1］，并与多种疾
病的发生密切相关［2］，同时作为癌症生物效应标记
物，也引起人们极大的关注［3］。目前，猪胰激肽原
酶的药物在临床上应用得比较广泛，在防治有关微
循环障碍病方面已经取得了较好的疗效［4 － 6］。但是
从猪胰脏中提取猪胰激肽原酶效果并非很理想，因
此基因重组表达方面的工作由此展开。袁新清［7］
用毕赤酵母表达重组人胰激肽原酶，由于存在糖基
化效应，活性不高。杜珙等［8］用 pET-20b(+)表达
系统表达重组胰激肽原酶，融合蛋白产量不高，占菌
体总蛋白 10%左右，且未能进一步鉴定其结构的正
确性。目前，国内外均没有对重组人胰激肽原酶进
行大规模工业化生产的报道，在其活性和产量方面
需要克服的困难还有很多。大肠杆菌表达系统作为
目前应用最为广泛的蛋白质表达系统具有较多的优
点:能够在短时间内表达蛋白，所需成本较低等。但
同时存在产物活性较低的缺点，因此还需要进一步
地探索研究。
本研究根据大肠杆菌偏爱的密码子设计人胰激
肽原酶基因，并于前端添加了肠激酶的位点，用
pET-22b(+)表达系统诱导表达目的蛋白，并验证
粗蛋白的活性。经过 SDS-PAGE 初步鉴定，再由
MALDI串联飞行时间质谱分析结构，确定其结构的
正确性。
2011 年第 11 期 侯乐锋等:重组人胰激肽原酶在大肠杆菌中的表达
1 材料与方法
1. 1 材料
大肠杆菌 DH5α，Rosetta 为实验室保存;pET-
22b(+ )由实验室构建并保存。限制性内切酶
EcoRⅠ，HindⅢ，pfu 高保真酶购自 TaKaRa 公司。
引物由上海 Invitrogen 公司设计合成。其他化学试
剂均为进口或者国产分析纯。
DYY25 型稳压稳流电泳仪，北京六一仪器厂;
TC-3000 基本型基因扩增仪，英国 Techne;GL-20G-
Ⅱ型冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂;JY9823D超
声波细胞破碎仪，宁波新芝科器研究所。
1. 2 方法
1. 2. 1 引物设计及合成 由 NCBI 数据库检索人胰
激肽原酶的序列，设计合成目的基因，并于前端加入
肠激酶位点 D4K，便于蛋白分离纯化时将融合蛋白切
下。在目的基因 5和 3端添加限制性内切酶 Eco RⅠ
和 HindⅢ，两端加上保护碱基。设计上下游引物用
于扩增目的基因，上游引物:5-GATTCGGAATTC
GGATGAT-3，下游引物:5-GATTGCAAGCTTCGAGGT-
TAGG-3(下划线为酶切位点)。
1. 2. 2 目的片段的 PCR扩增 设计 20 μL 反应体
系，利用 PCR扩增目的基因。94℃预变性 5 min 后
加入 pfu 酶 0. 2 μL，扩增程序:94℃ 1 min，36℃ 1
min，72℃ 1 min，25 个循环;72℃10 min;4℃保存。
反应结束后用 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，
检验扩增片段大小正确性，并用琼脂糖凝胶回收试
剂盒回收纯化目的片段。
1. 2. 3 目的片段与载体的连接 设计 50 μL 反应
体系，将连有目的基因的 pGEM-T 载体与 pET-22b
(+)空载体同时进行双酶切，37℃酶切 2 h，反应结
束后用 1. 5%的琼脂糖凝胶电泳鉴定，并用琼脂糖
凝胶回收试剂盒回收目的基因片段及载体片段。
将回收的目的基因片段和载体片段用 T4连接
酶进行连接，设计 10 μL 反应体系:目的基因片段
4 μL;pET-22b(+)载体片段 1 μL;10 × T4 DNA 连
接酶 buffer 1 μL;T4DNA连接酶 1 μL;ddH2O 3 μL ;
16℃连接过夜。连接产物转入 CaCl2法制备的感受
态大肠杆菌 Rosetta中，涂在含有氨苄青霉素的平板
上，筛选阳性克隆，PCR 及电泳鉴定，能够扩增出目
的片段的即为阳性克隆。
1. 2. 4 蛋白表达 挑取在平板上生长成熟的阳性
克隆接种于 LB 培养基中，37℃200 r /min 震荡培养
12 h 至对数生长期，按 1%的接种量转接到 2 × YT
培养基中继续培养 3. 5 h，加入 IPTG 至终浓度
0. 5 mmol /L，诱导 6 h后停止发酵。
1. 2. 5 融合蛋白在 E. coli 中分布 对发酵菌液进
行发酵液上清、总细胞蛋白、细胞周质、细胞质可溶、
细胞质不溶等各组分进行小规模分析。发酵液离
心，沉淀为总细胞蛋白，上清通过 TCA沉淀获得培养
基成分;沉淀重溶于溶液Ⅰ(30 mmol /L Tris-HCl，20%
蔗糖，加入 EDTA 至终浓度 1 mmol /L，pH8. 0)中，冰
上磁力搅拌 10 min，4℃冷冻离心去上清，加入溶液Ⅱ(5
mmol /L MgSO4)，冰上轻搅 10 min，此时周质蛋白释放
到缓冲液中，4℃冷冻离心，上清通过 TCA 沉淀获得
细胞周质部分;上一步沉淀用溶液Ⅲ(100 mmol /L
Tris-HCl，10 mmol /L EDTA，pH8. 0)洗涤，超声破碎，
4℃冷冻离心，上清通过 TCA 沉淀获得细胞质可溶
部分;剩余沉淀用溶液Ⅳ(100 mmol /L Tris-HCl，
2 mol /L 尿素，pH8. 0)洗涤，4℃冷冻离心，去上清，
重复 2 次，再用去离子水洗 1 次，冷冻离心去上清，
获得细胞质不溶部分。
对上述步骤收集的各组分通过 SDS-PAGE 凝
胶电泳，分析各组分中目的蛋白条带位置及大致
浓度。
1. 2. 6 目的蛋白的质谱鉴定 将目的蛋白条带切
下，寄由上海复旦大学生物医学研究院蛋白质组研
究中心，用 MALDI串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-
MS /MS)鉴定蛋白一级结构。利用 MASCOT 数据库
检索分析，比对氨基酸序列，验证其正确性。
1. 2. 7 目的蛋白的活性测定 诱导结束后，6 000 r /min
离心 20 min，收集菌体。加入溶液Ⅲ重悬，超声波破
碎，4℃冷冻离心去上清;加入溶液Ⅳ重悬，4℃冷冻
离心重复两次，水洗一次，离心得包涵体。将包涵体
按1∶ 10(W/V)的比例加入溶液Ⅴ(7 mol /L 盐酸胍，
100 mmol /L Tris-HCl，10 mmol /L DTT，pH8. 0)，缓慢搅
拌溶解，4℃离心 30 min，取上清;将上清按照 1∶ 20(V/
V)的稀释比例脉冲式缓慢加入溶液Ⅵ(100 mmol /L
Tris-HCl，1 mol /L 尿素，0. 2 mmol /L GSSG，2 mmol /L
GSH，1 mmol /L CaCl2，pH8. 0)中，4℃复性 16 h。4℃离
心取上清备用。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 11 期
胰激肽原酶对某些人工合成底物，如 Nα-苯甲
酰-L-精氨酸乙酯(BAEE)能起酯解作用。酶促反应
前后，在 283 nm吸光度下的增值 ΔA 与激肽原酶的
浓度在一定范围内呈线性关系。参照文献［9］的方
法测定胰激肽原酶的效价。
2 结果
2. 1 目的片段 PCR扩增
目的片段大小约 750 bp，进行 PCR 扩增，结束
后进行琼脂糖凝胶电泳，结果(图 1)显示，经过 PCR
扩增的目的基因在 700 bp与 800 bp之间，位置与目
的基因 750 bp大小吻合。
M． DNA Marker;1 － 3．目的基因条带
图 1 人胰激肽原酶基因 PCR扩增电泳图谱
2. 2 酶切及质粒的构建
目的基因大小 750 bp，pET-22b(+)空载体大
小 5 493 bp，对两者同时用 EcoRⅠ和 Hind Ⅲ进行双
酶切，使其露出粘性末端，连接后构建成的载体大小
约在 6 200 bp左右。通过琼脂糖凝胶电泳检测(图
2) ，目的基因已经成功插入载体。由图 2 可知，为
pET-22b(+)空载体线性化结果，位置在 5 000 bp
M． DNA Marker;1． pET-22b(+)空载体双酶切;2． 目的
基因双酶切;3．人胰激肽原酶基因重组表达载体
图 2 人胰激肽原酶基因重组载体琼脂糖凝胶电泳图
靠上，与预期结果吻合。泳道 2 为目的基因酶切结
果，大小在 700 bp和 800 bp中间，与 750 bp 大小一
致。泳道 3 为构建完成的重组表达载体，位置在空
质粒载体上方位置，证明构建载体成功。
2. 3 重组质粒的测序
将酶切鉴定为阳性的重组质粒，由上海英骏公
司进行 Sanger双脱氧终止法测序，结果正确。
2. 4 融合蛋白在 E． coli中分布
对细胞的各组成成分进行 SDS-PAGE 电泳，结
果(图 3)显示，在加诱导剂和不加诱导剂的情况下，
条带变化明显，在靠近 26 kD的下方位置附近，诱导
的菌出现了目标蛋白，而且分子量大小与设计时吻
合。周质中蛋白含量很少，且无目标蛋白出现;细胞
质可溶部分中有部分组分蛋白，但无目标蛋白;发酵
液上清有少量目标蛋白;而包涵体里含有大量目标
蛋白，可初步判断目标蛋白大量以包涵体的形式存
在。经凝胶成像软件 BandScan5. 0 扫描分析，得出
目标蛋白占总蛋白的含量为 21. 6%，经过超声波破
碎和包涵体洗涤后得到纯度为 52%的目标蛋白粗
品，含量如表 1 所示。
M．蛋白质Marker;1．未诱导全菌;2．诱导 10 h后全菌;3．总
细胞蛋白;4．发酵液上清;5．细胞周质;6．细胞质可溶;7．包
涵体
图 3 目标蛋白 SDS-PAGE电泳图
表 1 目标蛋白在大肠杆菌细胞各组分中的含量
组分 组分蛋白a(%) 目标蛋白b(%)目标蛋白c(%)
发酵液 100 21. 6 21. 6
发酵液上清 30 5 1. 5
细胞周质 2 0 0
细胞质可溶 28 0 0
包涵体 40 52 20
a．组分蛋白占总蛋白的质量分数;b．目标蛋白占组分蛋白的质量
分数;c．目标蛋白占总蛋白的质量分数
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2. 5 质谱分析
用 MALDI 串联飞行时间质谱(MALDI-TOF-
MS /MS)分析蛋白的一级结构，并以 MASCOT 数据
库检索比对分析序列，经过分析和运算，有 3 个片段
被检出，结果得分 106 大于可信得分 83 分，进一步
验证了表达蛋白的正确性。表 2 为质谱的检测结
果，全部蛋白理论序列为图 4 所示。
2. 6 目的蛋白的活性测定
利用 BAEE法测定人胰激肽原酶活性。测得未
纯化的人胰激肽原酶粗品，1 mL活性为 2. 27 nmol / s。
IVGGWE CEQHSQPWQA ALYHFSTFQC GGILVHRQWV LTAAHCISDN YQLWLGRHNL
FDDENTAQFV HVSESFPHPG FNMSLLENHT RQADEDYSHD LMLLRLTEPA DTITDAVKVV
ELPTQEPEVG STCLASGWGS IEPENFSFPDDLQCVDLKIL PNDECEKAHV QKVTDFMLCVGH
LEGGKDTC VGDSGGPLMC DGVLQGVTSW GYVPCGTPNK PSVAVRVLSY VKWIEDTIAE NS
图 4 蛋白质理论序列
表 2 蛋白质质谱鉴定结果
序号 检测位置 检出肽段
1 969. 53 M. SLLENHTR. Q
2 1705. 78 R. QADEDYSHDLMLLR. L
3 2374. 15 R. QWVLTAAHCISDNYQLWLGR. H
3 讨论
试验中采用大肠杆菌表达重组人胰激肽原酶，
获得了较高表达量的重组蛋白，但是活性仍然不十
分理想。由于蛋白主要以包涵体形式存在，蛋白复
性长期以来一直是因扰人们的难题，就目前已掌握
的包涵体的分离纯化技术来讲，还没有一套较理想
的工艺方法能使蛋白质同时获得较高的得率和活
性。因此为了获得较多高活性的重组蛋白，在蛋白
复性方面还需要做大量的研究。
4 结论
本研究根据大肠杆菌的偏爱密码子设计合成了
人胰激肽原酶的基因序列，利用 pET-22b(+)载体
表达系统在大肠杆菌 Rosetta 中表达了人胰激肽原
酶，并且产量较前人有进一步的提高，约达 21. 6%，
粗品活性达每毫升 2. 27 nmol / s。通过 SDS-PAGE
电泳和 MALDI串联飞行时间质谱分析，验证了产物
大小和结构的正确性。
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(责任编辑 李楠)
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