全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第3期
收稿日期:2008-01-24
作者简介:金元昌(1969-),博士,讲师,研究方向:基因工程
促性腺激素释放激素 (gonadotropinreleasinghormone,GnRH),又称黄体生成素释放激素(luteinizing
homone,LHRH),为下丘脑神经元分泌的十肽激素,其化学结构为:(焦)谷-组-色-丝-落-甘-亮-精-脯-
甘-NH2[1~2]。迄今还未发现哺乳类动物 GnRH的结构有什么不同[3]。下丘脑分泌的 GnRH由垂体门脉系统到
达垂体前叶,作用于垂体前叶的促性腺激素释放激素细胞膜上的 GnRH受体,通过磷脂酰肌醇系统导致胞
内钙离子浓度增加,促进垂体前叶分泌促卵泡素(foliclestimulatinghormone,FSH)和黄体生成素(luteinizing
hormoneLH)。FSH促进卵巢的卵泡生长发育,而在 FSH和 LH共同作用下,使成熟的卵泡分泌雌激素和孕
激素。下丘脑的 GnRH分泌呈典型的脉冲式释放,这是成熟动物的特征,对于性周期的形成是至关重要的。
如果 GnRH分泌无脉冲性,或其脉冲频率降低,幅度降低,均可引起低促性腺激素释放激素性功能减退综
合征[4~5]。近年来,在国内外许多地方均有发病的报道。为确保哺乳动物生殖机能健康发展,对该病进行深
重组人促性腺激素释放激素及导肽的分离纯化与活性分析
金元昌 1 向育君 1 李景鹏 2
(1湖南科技大学生命科学学院,湘潭 411201;2东北农业大学生命科学学院,哈尔滨 150030)
摘 要: 对含重组人促性腺激素释放激素(GnRH)及导肽(LEP)的工程菌株进行诱导表达,分离纯化 GnRH/LEP
并进行生物学活性分析。工程菌IPTG诱导,收获的菌体经超声破碎后,裂解液用Glutathione-Sepharose4B亲和层析纯化
GST-GnRH/LEP融合蛋白,经CNBr裂解、SephadexG-25柱脱盐、QAE-SepharoseFF阴离子交换柱层析和RP-C18柱脱
盐,得到纯度大于98%的重组GnRH/LEP。Westernblot表明表达产物均具有GnRH抗原特异性。生物学活性分析表明:
该表达产物可促进小鼠次级卵泡向成熟卵泡发育,可提高其血清中E2含量。
关键词: 促性腺激素释放激素 导肽 分离纯化
PurificationandActivityAnalysisofRecombinantHuman
GnRHandLeaderPeptide
JinYuanchang1 XiangYujun1 LiJingpeng2
(1ColegeofLifeScience,HunanUniversityofScienceandTechnology,Xiangtan411201;2ColegeofLifeScience,
NorthwestAgriculturalUniversity,Harbin150030)
Abstract: TopurifyrecombinantHumanGnRH andleaderpeptide(GnRH/LEP)andstudyitsbiologicalactivity
from fusionproteinGST-GnRH/LEPexpresedinE.coliBL21(DE3)PpGEX-6p-1-GnRH/LEP.E.coliBL21(DE3)
PpGEX-6p-1-GnRH/LEPwereabductedbyIPTG,GST-GnRH/LEPfusionproteinwaspreparedfrom sonicationof
bacteriabyglutathione-Sepharose4B afinitychromatography.FolowingcleavageofGST-GnRH/LEP bycyanogen
bromide,therecombinantGnRH/LEP wasreleased from fusion protein,and purified using Sephadex G-25,QAE-
SepharoseFFandRP-C18 columnchromatography.ThepurityofrecombinantGnRH/LEPwasmorethan98% by
HPLC analysis.Afterpurification,WesternblotprovedGnRH antigenicspecificityofexpresedproduct.Thebiological
activitywasexaminedbyintraperitonealinjectionofGnRH/LEPintomice,ascomparedwithH2O-injectioncontrol
group,TherecombinantGnRH/LEPstimulatedthegrowthofmouse’sfolicle.Andstimulatedthesecondaryfolicleto
maturefolicleItraisedthecontentofE2inmouse’sserum,butithaddiferentefectondiferentbody.
Keywords: Gonadotropinreleasinghormone Leaderpeptide Purification
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
入研究具有重要的实践意义。
1972年 Fujino等首先研制出第 1个 GnRH类似物:脯 9-乙酰胺 GnRH(9肽)[5],其作用是天然 GnRH的
5倍,因天然的 GnRH第 9位脯氨酸由脯乙酰胺替代后,不易被酶所降解。目前问世的 GnRH-A已超过
2000余种。尽管如此,GnRH-A抗酶解及穿透生物膜的能力仍不完善。根据文献[6,7],9个精氨酸作为导肽
(leaderpeptide,LEP)的多肽不但有强大的抗酶解能力,还有很强的穿透生物膜和组织的能力。为此,我们
在已完成 GnRH及 LEP基因人工合成、克隆及原核表达载体构建[8,9]的基础上,对重组 GnRH/LEP进行分
离纯化及活性分析,为开发高效的低促性腺激素释放激素性功能减退综合征治疗药物奠定基础。
1 材料和方法
1.1 材料
1.1.1 菌株和质粒 表达载体 pGEX-6p-1购自 PharmaciaBiotech公司;宿主大肠杆菌 BL21(DE3)由本室
保藏;重组质粒 pGEX-6p-1-GnRH/LEP和工程菌株 E.coliBL21(DE3)PpGEX-6p-1-GnRH/LEP由金元昌构
建。
1.1.2 主要试剂 低分子量蛋白标准、IPTG购自大连宝生物工程有限公司;酵母提取物、胰蛋白胨、低熔
点琼脂糖等购自北京原平皓生物工程公司;蛋白纯化单元(Glu-tathioneSepharose4B)、QAE-SepharoseFast
Flow、SephadexG-25购自 PharmaciaBiotech公司;RP-C18、溴化氢、乙腈(色谱纯),三氟乙酸(色谱纯)购自
Merk公司;HPLC色谱柱为 Waters公司产品;其他试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 融合蛋白 GST-GnRH/LEP的诱导表达及分离纯化 按金元昌等建立的方法[9]进行。
1.2.2 融合蛋白的 CNBr裂解 纯化的 GST-GnRH/LEP融合蛋白液中加入尿素至 8mol/L,浓 HCl至 200
mmol/L,再加入融合蛋白 8倍量的 CNBr混匀,置通风橱中避光反应 4.2h,加水稀释 12倍,冷冻干燥,之后
溶解,再次冷冻干燥。
1.2.3 重组 GnRH/LEP的分离纯化 用 50mmol/LTris-HCl(pH8.5)溶解冻干样品,SephadexG-25柱脱盐,
在 250nm处检测收集吸收峰。上样于 QAE-SepharoseFF阴离子层析柱,50mmol/LTris-HCl(pH8.5)洗至
A250<0.02,用含有 0～400mmol/LNaCl的 50mmol/LTris-HCl(pH8.5)缓冲液梯度洗脱,收集 A250吸收峰。
HPLC进行分析,色谱条件:流动相 A(20%CNCH3,80%H2O,0.1%TFA),流动相 B(100%CNCH3,0.1%TFA),
14min线性梯度洗脱,流动相 B至 80%。收集液进一步用 RP-C18柱脱盐浓缩,20%CNCH3,80%H2O,0.1%
TFA洗至 A250<0.02,90%CNCH3,10%H2O,0.1%TFA洗脱,收集洗脱液冷冻干燥。HPLC分析纯度,色谱条
件同上。
1.2.4 重组 GnRH/LEP的 Western印迹分析 将纯化后的重组 GnRH/LEP在 12%SDS-PAGE上进行分离
后,电转移至硝酸纤维薄膜上。5%BSA封闭 30min后,将薄膜与兔抗 GnRH抗体室温孵育 1h。用 50mmol/L
Tris-Cl/1%Tween-20洗膜 3次后,与生物素标记的抗兔 IgG抗体室温孵育 1h。洗膜后,再加入亲和素和生物
素化辣根过氧化物酶进行室温孵育 1h。最后用 ECL试剂盒检测结果,并曝光于 X光片上。
1.2.5 重组体的生物学活性测定 (1)利用光镜与电镜进行形态学观察 实验用雌性昆明小白鼠出生 19d,
体重约 13g左右,性未成熟。实验分为 3组:A组(对照组,注射蒸馏水);B组(注射人源 GnRH标准品,
0.1ng/μl);C组(注射重组 GnRH/LEP0.1ng/μl)。每天肌肉注射 50μl,注射前称量体重,分别于 24h、48h、
72h、96h进行采集血样,离心制取血清,-20℃保存备用。将小鼠处死后立即取出卵巢。然后将卵巢分别放到
戊二醛固定液(电镜切片用)、含 10%甲醛的 PBS缓冲液中固定(光镜切片用)备用,用 H.E染色法制备卵
巢光镜切片。(2)放免法测定血清中 E2含量 采用医用商品放免全套试剂盒,检测程序按药盒说明书进行,
E2药盒系碘标抗原试剂。检测仪器采用液体闪烁计数器(BeckmanLS9800),检测数据均经仪器自动分析
处理。
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2008年第3期
2 结果
2.1 重组 GnRH/LEP的分离纯化
融合蛋白 GST-GnRH/LEP经 CNBr裂解 4.2h,冻干样品用 50mmol/LTris-HCl(pH8.5)缓冲液溶解,
SephadexG-25柱脱盐后,上样于 QAESepharoseFF阴离子交换层析柱,用含有 0~400mmol/LNaCl的 Tris-
HCl缓冲液梯度洗脱进行收集。收集液用 HPLC进行分析,以 250nm检测到 2个主要吸收峰(图 1),分别进
行收集。在相同的溶剂系统中,与 GnRH标准品进行比较分析,确定 7.240min吸收峰为目标蛋白峰。
2.2 重组 GnRH/LEP的纯度鉴定
目标峰收集液进一步用 RP-C18柱脱盐浓缩,90%CNCH3洗脱,收集洗脱液冷冻干燥后进一步鉴定。
HPLC纯度分析结果见图 2,经软件分析其主峰纯度大于 98%。
图 1 CNBr裂解后 GnRH/LEP的 HPLC分析 图 2 GnRH/LEP纯化后的 HPLC分析
2.3 重组 GnRH/LEP的 Westernblot鉴定
用天然的 GnRH蛋白免疫家兔,得到兔抗 GnRH抗体,并用 Westernblot对
GnRH/LEP融合蛋白进行特异性鉴定。结果表明,表达产物具有 GnRH特异抗原
性(图 3)。
2.4 重组 GnRH/LEP的活性测定
2.4.1利用光镜与电镜进行形态学观察 重组 GnRH/LEP对小鼠卵巢影响的光
镜组织学观察如下:A组(A124h,A248h,A372h,A496h)为对照组,注射蒸馏水;
B组 (B124h,B248h,B372h,B496h)注射人源 GnRH标准品,0.1ng/μl;C组(C1
24h,C248h,C372h,C496h)注射重组 GnRH/LEP0.1ng/μl),以上均为 H.E染色,
通过光学显微镜(400×)可以看出(图 4),GnRH标准品及重组 GnRH/LEP对小
鼠卵巢有明显的影响。
重组 GnRH/LEP对小鼠卵巢影响的电镜观察如下:A
组(A172h30000×,A248h8000×)为对照组,注射蒸馏水;
B组(B172h20000×,B296h20000×)注射人源 GnRH标
准品,0.1ng/μl;C组(C172h10000×,C296h20000×)注射
重组 GnRH/LEP0.1ng/μl)。通过电子显微镜可以看出(图
5),A组中有许多线粒体,嵴不呈管状或泡状,说明处于次
级卵泡阶段;B组中线粒体变长,有的呈哑铃形,基质致
密,嵴呈管状或泡状;C组可见一些脂滴及粗面内质网丰
富。
2.4.2 重组 GnRH/LEP对小鼠血清中 E2的影响处理方法
图 3 纯化的 GnRH/LEP
Westernblot鉴定
图 4 重组 GnRH/LEP对小鼠卵巢影响的光镜观察
金元昌等:重组人促性腺激素释放激素及导肽的分离纯化与活性分析 89
生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
同上,分别于 24、72、120、168h采取血清,按试剂盒说明测定血清中 E2浓度。从结果(图 6)来看,GnRH标
准品对小鼠血清中 E2含量提高效果最好,GnRH/LEP的效果一般。
图 6 小鼠血清中 E2含量的数据分析
图 5 重组 GnRH/LEP对小鼠卵巢影响的电镜观察
3 讨论
由下丘脑神经分泌细胞所释放的 GnRH经垂体门脉系统直接进入垂体前叶,它不经周身循环或肝肾
对 GnRH的失活作用。GnRH的氨端和羧端并非游离,可免受外端蛋白水解酶如氨肽酶或羧肽酶的作用,
但其它肽键很易被酶所降解。有关 GnRH降解作用主要来自下丘脑和垂体的研究,表明 GnRH分子被内切
酶从分子内断裂为 GnRH1-6和 GnRH7-102个片断,这可能是 GnRH的主要灭活机制。人工合成的 GnRH
其化学结构和生理作用与天然 GnRH完全相同。由于下丘脑分泌的 GnRH生物半衰期只有 2～4min,有必要
生产出作用时间持久和生物作用更强的类似物以满足临床工作的需求。1972年 Fujino等首先研制出第 1
个 GnRH类似物(GnRH-A)即脯 9-乙酰胺 GnRH(9肽),其作用是天然 GnRH的 5倍,因天然的 GnRH第 9
位脯胺酸由脯乙酰胺替代后不易被酶所降解。目前问世的 GnRH-A已超过 2000余种。虽然如此,GnRH-A
抗酶解及穿透生物膜的能力还很是不够,而且,由天然的 10肽变成 9肽肯定会影响 GnRH的自然活性。
1988年,Green和 Frankel各自独立地发现 HIV-1TAT蛋白在一定培养基中能够进入细胞,而且转入的
TAT蛋白能够进入正常的生理位置上,并反式激活病毒的 LTR起动子[10,11]。此后,另外两种能进入细胞的
蛋白相继被发现。2000年,Wender发现 TAT49-57是 TAT蛋白进入细胞的最基本的区域。后来他又发现由
9个右旋精氨酸组成的小肽进入细胞的效率是 TAT49-57的 20多倍,由 9个左旋精氨酸组成的小肽进入细
胞的效率是 TAT49-57的 100多倍[6]。
根据人促性腺激素释放激素及 9个精氨酸核苷酸序列设计了一对寡核苷酸引物,以其 3′末端的一个
短互补序列退火形成小段双链,从而互为模板和引物,通过引导合成长达 90bp的 GnRH/LEP序列,克隆到
pMD-T载体上,然后亚克隆到表达载体 pGEX-6p-1上,并转化到大肠杆菌 BL21(ED3)plyS进行原核表达。
对含人 GnRH及导肽的工程菌株进行诱导表达,并分离纯化重组的 GnRH/LEP表达产物,该表达产物生物
学活性分析表明:该产物能加速小鼠卵巢中的卵泡发育,促进小鼠性早熟、促进排卵,可提高小鼠血清中 E2
含量。
参考 文献
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生物技术通报Biotechnology Buletin 2008年第3期
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基因表达的影响可以由加有 bFGF培养基的培养时间来调节。这些结果提示 bFGF是牙周膜中 I型胶原有
效重构的重要调节因子之一,也可能对其他结缔组织来说同样如此。
3.3 bFGF对核心蛋白多糖(decorin)的影响
decorin是牙周组织中的一种主要的蛋白多糖,分布在牙龈上皮基底膜区以及牙龈和牙周连接组织的
胶原纤维束中,在牙龈上皮下区域比牙周深部区域有更强的免疫表达。decorin的核心蛋白呈马蹄形,可以
通过核心蛋白结合不同类型的胶原纤维,比如 I型胶原和 VI型胶原[8]。因此,它被认为影响胶原的合成和
胶原纤维最终的直径。
实验表明,加入 bFGF的牙周膜细胞内 decorin的 mRNA表达水平明显下降了,而且随着 bFGF浓度的
增加,抑制作用逐渐减弱,在 0.1ng/ml时抑制作用最强,在 10ng/ml时抑制作用最弱。现通过以下几点来讨
论其意义:①bFGF对 decorin的抑制作用改变了细胞外基质的内环境稳定,使得 I型胶原的合成下降了。
decorin还是调节胶原降解的重要因子,bFGF也可能通过这个途径来调节胶原的合成。②在牙和牙周组织
中,小的间质蛋白多糖表达于牙本质和牙骨质的非矿化区,特别是软硬组织交界处插入牙骨质、牙槽骨的
胶原纤维以及牙槽骨内侧的成骨细胞显示强阳性免疫特性,表明小的间质蛋白多糖可能影响牙本质、牙骨
质及牙槽骨的矿化。③decorin调解细胞的增殖,在细胞休眠期它的表达升高,而在细胞活跃增殖的时候它
的表达水平却很低。④decorin在生长、发育和损伤修复过程中发挥重要作用,还参与组织的自身稳定和损
伤修复。bFGF对 decorin的抑制作用提示我们 bFGF也很可能参与牙周病的炎症过程。这表明 bFGF对牙周
膜细胞内 decorin基因表达具有较大影响,为牙周膜细胞在牙周组织再生中更好地发挥其多能细胞的功
能,促进牙周组织再生提供了一定的理论基础。
总之,牙周组织再生是一个十分复杂的过程,而 bFGF抑制 decorin的合成是 bFGF促进牙周膜细胞增
殖的重要调节因素之一。应用 bFGF能有效诱导牙周组织再生,不仅诱导结缔组织再生,还能诱导骨质再
生和牙槽骨再生,其应用前景是很广泛的。
参考 文献
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