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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 8 期
A、O型口蹄疫 T /B细胞多抗原表位
融合基因植物表达载体的构建
谭昕1 肖旭倩2 言普2 沈文涛2 王亚2 周鹏1，2
(1中国热带农业科学院热带作物生物技术研究所 农业部热带作物生物技术重点实验室，海口 571101;2海南大学农学院，海口 570228)
摘 要: 通过对(pMD-xsB /xsT /xsBT /xsBTT)4 个克隆载体进行 PCR，在(xsB /xsT /xsBT /xsBTT)目的基因前接入引导肽
序列(用 Y表示) ，克隆中间载体(pMD-xsYB /xsYT /xsYBT /xsYBTT) ，再利用同尾酶的酶切及连接得到 4 个重组植物表达载体
(pBI-xsYB /xsYT /xsYBT /xsYBTT)。经限制性酶切鉴定和测序分析证实表达载体构建正确，为下一步热研 2 号柱花草转基因
植株的获得奠定了基础。
关键词: 口蹄疫病毒 多表位融合基因 引导肽序列 植物表达载体
The Fusion of Synthetized T /B Cell Antigen Epitope Genes of FMDV
Type O /A and Construction of Plant Expression Vectors
Tan Xin1 Xiao Xuqian2 Yan Pu2 Shen Wentao2 Wang Ya2 Zhou Peng1，2
(1Key Laboratory of Tropical Crop Biotechnology，Ministry of Agriculture，Institute of Tropical Bioscience and Biotechnology，
Chinese Academy of Tropical Agricultural Science，Haikou 571101;2College of Agriculture，Hainan University，Haikou 570228)
Abstract: The leader peptide (Y)was introduced upstream of xsB /xsT /xsBT /xsBTT gene by PCR in which plasmid pMD-xsB /
xsT /xsBT /xsBTT acts as template． Then the PCR modified gene xsYB /xsYT /xsYBT /xsYBTT was cloned into intermediate vector． Using
isocaudamer digestion and ligase ligation，four plant expression vector (pBI-xsYB /xsYT /xsYBT /xsYBTT)were constructed and further
identified by restriction enzyme digestion and sequencing analysis，which would lay a foundation for obtaining transgenic S． guianensis
cv． Reyan No． 2．
Key words: Foot-and-mouth disease virus Multi-epitope fused gene Leader peptide Plant expression vector
收稿日期:2011-03-14
作者简介:谭昕，男，硕士研究生，研究方向:作物遗传育种;E-mail:tanxin19@ yahoo． com． cn
口蹄疫是由口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease
virus，FMDV)引起的一种急性、热性、高度接触传染
性和可快速远距离传播的动物疫病［1］，俗称“口
疮”、“蹄癀”。主要感染 30 多种偶蹄动物，世界动
物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物传染
病，我国规定为一类动物疫病。其发病特征是传播
途径多、传播速度快、传染性强、病原变异大及危害
严重等［2，3］。传统防疫方法是使用灭活疫苗及弱
毒疫苗，灭活疫苗的特点是进入机体后，不能生长繁
殖，对机体刺激时间短，产生免疫力不高，要想得到
较高而持久的免疫力，必需多次重复注射。弱毒疫
苗特点是接种量小，接种次数少，免疫效果较好，维
持免疫时间较长;但弱毒疫苗保存条件较严格，运输
不便。因此研制安全性高、生产成本低、包含同种病
毒或不同病毒的多个成分的新型基因工程疫苗成为
热点。在各种新型基因工程疫苗中，转基因植物疫
苗的可饲性及生产储存简单、安全方便等特点最具
优势。目前对 FMDV抗原表位的研究较多，但主要
集中在一个病毒类型的 B 细胞抗原表位和 T 细胞
抗原表位上［3 － 5］，现已证实口蹄疫多表位基因疫苗
的免疫原性较单表位的强。而同型与异型 FMDV
之间多表位基因组合以及何种组合免疫效果最佳，
目前尚未有明确、一致的报道。
本课题组前期选择 FMDV 上两个 B 细胞表位
(O 型 VP1 上 137 － 160 aa 及 A、O 型 3C 上保守
196 － 210 aa)和 5 个 T细胞表位(A型 3A上 21 － 35
2011 年第 8 期 谭昕等:A、O型口蹄疫 T /B细胞多抗原表位融合基因植物表达载体的构建
aa、VP1 上 138 － 160 aa，O型 VP2 上 49 － 68 aa、VP3
上 81 － 101 aa、VP4 上 20 － 40 aa) ，根据豆科植物偏
爱密码子分别合成其基因序列，再将 2 个 B 细胞表
位基因和 5 个 T 细胞表位基因分别融合为 B 和 T
两个片段，构建 4 个中间载体 pBI-xsB、pBI-xsT及双
联体 pBI-xsBT 和三联体 pBI-xsBTT。以此为基础，
本研究在目的基因前引入引导肽序列，提高某些基
因的表达水平，使表达产物进行特异空间的积累，减
少细胞内大量蛋白酶的降解作用而提高目的蛋白的
含量，进而增强转基因植物疫苗的粘膜反应，提高疫
苗的免疫效果［6，7］。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 菌株与质粒 常规克隆宿主菌 DH5α、农杆
菌 EHA105 及质粒 pBI121 为本实验室保存;pMD18-
T Vector购自 TaKaRa 公司。
1． 1． 2 主要试剂 Klenow 酶、T4 DNA 连接酶为
TaKaRa 公司产品;High Fidelity PCR Enzyme Mix、限
制性内切酶 XbaⅠ、SacⅠ为 Fermentas 公司产品;
Marker(2000、1000、750、500、250和100 bp，共6条带)
为天根生化科技有限公司产品;E． Z． N． A． Gel Ex-
traction Kit、Plasmid Mini Kit 为 OMEGA 公司产品;
所有基因合成及载体测序由宝生物(大连)公司
完成。
1． 1． 3 主要仪器 PCR 仪(PEKIN ELMER 公司的
DNA Thermal Cycler 2400型和德国 Bio-metra T1型) ，
高速冷冻离心机(BECKMAN J2-21M 型和 HITACHI
型) ，超纯水仪(MILLIPORE 型) ，制冰机(SANYO 公
司) ，－20℃冰箱(SANYO公司) ，琼脂糖凝胶水平电
泳槽及电泳仪(北京六一仪器厂) ，高压蒸馏灭菌锅、
干热灭菌电热烘箱，凝胶成像系统(Bio-Rad 公司) ，
－80℃冰箱(FORMA SCIENTIFIC公司)。
1． 2 方法
1． 2． 1 中间载体构建
1． 2． 1． 1 T细胞表位基因序列和 B细胞表位基因序
列 5个 T细胞表位基因序列 BW1:5-GCAGCAATT-
GAGTTCTTTGAGGGCATGGTGCATGATAGCATTAAG-
3，编码 A型 FMDV 3A蛋白上 21 － 35 氨基酸序列;
BW2:5-AGGAGCATGCTTCTTAAAATGAAGGCACA-
TATTGATCCAGAGCCA-3，编码 A、O 型 FMDV 3C
蛋白上保守 196 － 210 氨基酸序列;BW4:5-AGCG-
GCCTTGAGACCAGAGTGGTGCAGGCAGAGAGATTC-
TTCAAGACCCATTGCTACGAT-3，编码 O 型 FMDV
VP2蛋白上 49 － 68 氨基酸序列;BW5:5-CTTGCAG-
CAAAGCATATGAGCAACACCTTCCTTGCAGGCCTTG-
CACAGTACTACACCCAGTAC-3，编码 O 型 FMDV
VP3 蛋白上 81 － 101 氨基酸序列;BW6:5-AC-
CCAGCTTGGCGATAACGCAATTAGCGGCGGCAGCA-
ACGAGGGCAGCACCGATACCACCAGC-3，编码 O 型
FMDV VP4蛋白上 20 －40氨基酸序列。
两个 B细胞表位基因序列:BW3:5-ACCGATG-
GCCCAAGAAGAGGCGATATGGGCAGCCTTACCGCA-
AGGGCAGCAAAGCAGCTTCCAGCAAGC-3，编码 A
型 FMDV VP1蛋白上 138 －160氨基酸序列;BW7:5-
GGCGAGAGCCCAGTGACCAACGTGAGAGGCGATCT-
TCAGGTGCTTGCACAGAAGGCAGCAAGAACCCTTC-
CA-3，编码 O型 FMDV VP1 蛋白上 137 － 160 氨基
酸序列。
1． 2． 1． 2 构建克隆载体 5 个 T 细胞表位基因融
合和 2 个 B 细胞表位基因融合，构建不同组合的克
隆载体:pMD-B /pMD-T /pMD-BT、pMD-BTT。
1． 2． 1． 3 替换各个克隆载体上酶切位点引物设计
W1:5-ACTCTAGTAGCTCATCTTTTCTAATGTC-
CGGAACCGATGGCCCAAG-3(XbaⅠ) ;W2:5-CG-
GAGCTCTCATTATCCATTTGGAAGGGTTCTTG-3，5-
CAAGAACCCTTCCAAATGGATAATGAGAGCTCCG-
3(SacⅠ) ;W3:5-ACTCTAGATAGCTCATCTTTTC-
TATGTCCGGAGCAGCAATTGAGT-3 (XbaⅠ) ;W4:
5-CGGAGCTCTCATTATCCATTGCTGGTGGTATCG-3，
5-CGATACCACCAGCAATGGATAATGAGAGCTCcg-3。
1． 2． 1． 4 pBI121 载体引物设计 p1211:5-GACG-
CACAATCCCACTATCC-3，p1212:5-GTAAAACGAC-
GGCCAGTG-3。
1． 2． 1． 5 目的基因加入酶切位点 以质粒 pMD-
B /pMD-T /pMD-BT、pMD-BTT 为模板，分别用引物
对 W1-W2 /W3-W4 /W1-W4 扩增并回收相应片段，
命名为 xsYB /xsYT /xsYBT /xsYBTT。按下列组分配
制 PCR反应液:10 × PCR Buffer(Mg2 + Plus)2． 5 μL，
dNTP 混合物(2． 5 mmol /L)2． 0 μL，引物 P1 0． 5 μL，
引物 P2 0． 5 μL，模板 DNA 0． 5 μL，Taq DNA聚合酶
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 8 期
0． 3 μL，加水补足到 25 μL。扩增程序:95℃预变性
5 min;94℃变性 30 s，52℃退火 30 s，72℃延伸 45 s，
进行 30 个循环;72 延伸 10 min。将 PCR 产物作
1． 0%的琼脂糖电泳。
1． 2． 1． 6 T 载体与 xsYB /xsYT /xsYBT /xsYBTT 基
因片段的连接 将回收产物 xsYB、xsYT、xsYBT、
xsYBTT与 pMD18-T Vector 连接，转化 DH5 的感受
态细胞，得到重组子分别命名 pMD-xsYB、pMD-
xsYT、pMD-xsYBT、pMD-xsYBTT。按下列组分配制
连接反应液:Ligation Mix Buffer 1 μL，pMD18-T Vec-
tor 1 μL，回收产物 6 μL，加水补足到 10 μL。反应
条件:16℃连接过夜。
1． 2． 2 植物表达载体构建
1． 2． 2． 1 pMD-xsYB、pMD-xsYT、pMD-xsYBT、pMD-
xsYBTT质粒酶切及载体质粒 PBI121 线性化 配制
酶切反应液Ⅰ:10 × MΜLTI-CORETM Buffer 5． 0 μL，
XbaⅠ(10 U /μL)1． 0 μL，SacⅠ(10 U /μL)1． 0 μL，
pMD-xsYB等 30． 0 μL，加水补足到 50 μL。配制酶
切反应液Ⅱ:10 × MΜLTI-CORETM Buffer 5． 0 μL，
Xba Ⅰ(10 U /μL)1． 0 μL，SacⅠ(10 U /μL)1． 0 μL，
PBI121 30． 0 μL，加水补足到 50 μL。反应条件:
37℃酶切反应 16 － 18 h。使用 Boehringer Manheim
公司的 High Pure PCR Product Purification Kit 分
别回收酶切反应后的酶切片段，回收的片段分别
命名为 xsYB、xsYT、xsYBT、xsYBTT 和线性 化
载体。
1． 2． 2． 2 线性化载体与 xsYB、xsYT、xsYBT、
xsYBTT基因片段的连接 线性化载体 PBI121 与
xsYB、xsYT、xsYBT 和 xsYBTT 基因片段通过互补
的黏性末端，在 T4连接酶的作用下连接成新的重
组质粒，经 PCR鉴定后送阳性克隆测序。按下列
组分配制连接反应液:2 × T4 连接酶 Buffer 2． 5
μL，线性化载体 pBI121 2． 0 μL，xsYB、xsYT、
xsYBT、xsYBTT 4． 0 μL，T4 连接酶(3 U /μL)1． 0
μL，加水补足到 25 μL。反应条件:混匀后，16℃
连接 18 － 24 h。
2 结果与分析
2． 1 中间载体构建及鉴定
以质粒 pMD-B /pMD-T /pMD-BT及 pMD-BTT为
模板，分别用引物对 W1-W2 /W3-W4 /W1-W4 扩增，
获得大小约 224 bp(xsYB)、375 bp(xsYT)、546 bp
(xsYBT)和 886 bp(xsYBTT)的目的片段，分别回收
后克隆进 pMD18-T 载体，用通用引物 PCR 鉴定出
现预期片段(图 1) ，送阳性克隆测序，结果表明各基
因按预期在 5端引入 Xba I 位点和起始密码子
ATG，3端加入双终止子 TTATGA和 Sac I位点，获得
pMD-xsYB /pMD-xsYT /pMD-xsYBT /pMD-xsYBTT 4种
不同组合的中间载体。
M． DL2000 DNA Marker;1． pMD-xsYB;2． pMD-xsYT;3． pMD-
xsBYT;4． pMD-xsYBTT;5．阴性对照
图 1 PCR鉴定中间载体
2． 2 重组植物表达载体的构建及农杆菌工程菌株的
获得
利用 Xba I、Sac I 切除植物表达载体 pBI121 上
的 GUS基因(约 2． 0 kb) ，同时酶切质粒 pMD-xsYB
/xsYT /xsYBT /xsYBTT，分别回收长约 224、357、546、
886 bp目的片段，在 T4DNA 连接酶的作用下，将线
性化 pBI121 与各目的片段连接成新的重组质粒。
用引物对 pBI-xsYB/pBI-xsYT/pBI-xsYBT/pBI-xsYBTT
PCR鉴定，出现约 578、438、916、1 246 bp 目的片段
(图 2)。利用 Xba I、Sac I 对 pBI-xsYB /pBI-xsYT /
pBI-xsYBT /pBI-xsYBTT进行双酶切鉴定，分别得到
224 bp(xsYB)、375 bp(xsYT)、546 bp(xsYBT)和
886 bp(xsYBTT)的目的片段(图 3)。测序结果表
明，目的片段位于 Xba I、Sac I 之间，起始密码子和
双终止子按预期引入，成功获得 pBI-xsYB /pBI-
xsYT /pBI-xsYBT /pBI-xsYBTT 4 个重组植物表达载
体。利用电激法转化农杆菌株 EHA105，转化重组
的农杆菌株菌落 PCR 鉴定，出现相应目的片段(图
4) ，成功获得了 4 种农杆菌工程菌株。
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2011 年第 8 期 谭昕等:A、O型口蹄疫 T /B细胞多抗原表位融合基因植物表达载体的构建
M． DL2000 DNA Marker;1． pBI-xsYB;2． pBI-xsYT;3． pBI-
xsBYT;4． pBI-xsBYTT;5．阴性对照
图 2 PCR鉴定植物表达载体
M1. DL15000 DNA Maker;M2. DL2000 DNA Marker;
1. pBI-xsYBTT;2. pBI-xsYBT;3. pBI-xsYT;4． pBI-xsYB
图 3 双酶切鉴定植物表达载体
M． DL2000 DNA Marker;1． pBI-xsYB;2． pBI-xsYT;3． pBI-
xsBYT;4． pBI-xsBYTT;5．阴性对照
图 4 PCR鉴定植物表达载体
3 讨论
植物细胞中蛋白的合成一小部分是在线粒体和
叶绿体内进行的，其余是由核基因编码并在核糖体
内合成。在核糖体内合成的蛋白前体要转运到内质
网、高尔基体、溶酶体及质膜等细胞器，并受蛋白前
体中引导序列的调控。此过程中，外源基因的表达产
物会受细胞内蛋白酶的降解，而接入引导肽序列可
以及时对蛋白进行定位，还可以提高蛋白的含量。
本试验在目的基因前引入引导肽序列，以期提高目
的基因的表达水平，使表达产物进行特异空间的积
累，减少细胞内蛋白酶的降解作用而提高目的蛋白
的含量，进而增强转基因植物疫苗的黏膜反应，提高
疫苗的免疫效果［8］。
在以质粒 pMD-BTT 为模板，W1-W4 为引物，
PCR扩增换酶切位点时，扩增出片段 YBT 条带很
亮，而目的条带片段 YBTT条带很淡，无法回收。摸
索试验条件，当降低模板浓度时可以扩增较亮的片
段 YBTT条带。其原因可能是当起始模板浓度高时
引物 W4 结合中间和末端的 T几率相同，但片段 BT
较短，体系可能产生优先扩增现象，致使得到片段
BT浓度远远大于目的片段 BTT，扩增出片段 BT 越
来越来多，而目的片段 BTT减少，条带淡无法回收。
本试验已成功得到 4 个重组植物表达载体
(pBI-xsYB /xsYT /xsYBT /xsYBTT) ，这为下一步热研
2 号柱花草转基因植株的获得，以及与不含引导肽
序列的表达载体在植株蛋白表达中的差异比较研究
奠定了基础。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠)
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