全 文 ：
技术与方法

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2010年第 2期
牛卵核移植技术的应用
征月良
(临沂师范学院生命科学学院,临沂 276000 )


摘
要:
用去核的牛卵母细胞进行核移植, 形成重构胚,胚胎移植后 ,可产生克隆牛。将克隆牛的肉和奶制成肉粉和奶
粉饲喂大鼠, 大鼠的生理功能不受影响。牛卵核移植技术为珍稀动物的保护提供了一条重要途径, 对于细胞治疗的研究也具
有重要意义。通过牛卵核移植技术,可构建异种克隆胚胎, 用以研究核质相互作用。将牛卵核移植技术和体细胞基因修饰技
术相结合, 可生产转基因克隆牛。
关键词:
牛 核移植 应用
Applications of Bovine Oocyte Nuclear Transfer Technique
Zheng Yueliang
(Co llege of Lif e Science, LinyiN ormal University, L iny i 276000)


Abstrac:t
Nuclear transfer techn ique has advanced rap id ly in recent years. Feeding o fm eat and m ilk pow der from cloned bov ine
has no effect on physiolog ica l param ete rs of rats in feed ing stud ies. Nuclear transfer techn ique m ay be important fo r preserva tion o f en

dangered spec ies and stud ies of ce ll therapy. Interspecies cloned embryos can be reconstructed from bov ine oocy tes, and transgenic bo

v ine can be produced from genetically m od ified cells us ing nuc lear transfer techn ique.
Key words:
Bov ine Nuclear transfer App lica tion
收稿日期: 2009
10
20
作者简介:征月良,男,博士,副教授,研究方向:细胞工程; E
m ai:l zhyl_ liny@i yahoo. com. cn


近年来,核移植技术发展迅速,人们利用此技术
已获得多种克隆动物。牛是一种重要家畜, 国内外
均有克隆牛出生的报导。以牛卵作受体进行核移
植,对于研究克隆动物肉和奶的营养价值和安全性、
珍稀动物保护、异种核移植、生产转基因牛和细胞治
疗的研究具有重要意义。
1
克隆牛的营养价值
通过显微操作技术, 将牛的细胞核移入去核的
卵母细胞中,形成重构胚,胚胎移植后, 产生一个新
的个体,即克隆牛。近年来,人们对克隆牛的肉和奶
的营养价值和食用安全性, 心存疑虑和担心。T ian
等 [ 1]对克隆牛的肉进行分析, 发现克隆牛的冈下
肌、阔背肌、内转肌、胸最长肌和股二头肌在肌肉湿
度、粗蛋白和粗脂肪含量上与非克隆牛无显著差异。
克隆牛和非克隆牛的胸最长肌在丙氨酸、精氨酸、酪
氨酸等氨基酸含量上也无显著差异。克隆牛的半腱
肌内脂肪在油酸、亚油酸、棕榈酸和棕榈油酸含量上
高于非克隆牛,但在豆蔻酸和硬脂酸含量上无显著
差别。W alsh等 [ 2]对克隆牛的奶进行研究, 发现克
隆牛和非克隆牛的奶在固体物、蛋白质、脂肪和乳糖
的含量上无显著差异, 均符合牛奶的正常标准。在
克隆牛的奶中,油酸、亚油酸、硬脂酸和豆蔻酸等脂
肪酸含量与非克隆牛也无显著差异, 但棕榈酸和亚
麻酸含量低于非克隆牛。克隆牛的奶在体细胞数和
pH值上正常。在克隆牛的奶中, 钠、钾、钙、铁和硫
的含量和非克隆牛相似, 而锌和磷的含量低于非克
隆牛,锶的含量高于非克隆牛,这些差异可能是由于
克隆牛和非克隆牛在不同农场中饲养,它们的饲料
不同引起的。
Yamaguchi等 [ 3]将克隆牛的肉和奶分别制成肉
粉和奶粉来饲喂大鼠,大鼠的进食量和体重增加量
正常,未出现死亡现象。饲喂后, 大鼠的感觉和反射
功能、发情周期均正常, 它们的肺、胃、心脏和肝脏等
器官也正常,无病理现象。用克隆公牛的精液对非
2010年第 2期 征月良:牛卵核移植技术的应用
克隆母牛进行受精, 或用非克隆公牛的精液对克隆
母牛进行受精, 获得克隆牛后代。在食用克隆牛后
代的肉粉和奶粉后, 大鼠的体重增加量、进食量、反
射能力、四肢抓力和运动活性均正常 [ 4]。在血液生
化检测中,与食用非克隆牛后代肉粉的大鼠相比,食
用克隆牛后代肉粉的大鼠在葡萄糖、钠、尿素氮、无
机磷和天冬氨酸转氨酶水平上要高, 在乳酸脱氢酶
和肌酸激酶水平上要低。虽然两组大鼠在生化指标
上存在一些差异, 但均处于正常值范围 [ 4]。因此,
食用克隆牛和克隆牛后代的肉粉和奶粉不影响大鼠
的生理功能。
2
保护珍稀动物
以珍稀动物的体细胞作供体, 牛卵母细胞作受
体进行核移植,为保护这些动物提供了一条重要途
径。W ells等 [ 5]对濒危的恩德比岛牛进行核移植,
将其颗粒细胞的核移入去核牛卵母细胞中, 获得克
隆胚胎,克隆胚胎可发育至囊胚。在核移植中,激活
前融合的方法比融合激活同时进行的方法产生高的
囊胚发育率,这可能是由于在激活前将体细胞核暴
露于卵母细胞胞质有利于核的重编程。克隆胚胎移
植后, 出生 2头恩德比岛牛后代, 其中一头小牛存
活。Lanza等 [ 6 ]将亚洲野牛体细胞与去核牛卵母细
胞融合后, 产生克隆胚胎, 囊胚发育率达 12%。胚
胎移植后, 18%的胚胎发育至胎儿期,并获得一头野
牛克隆后代。牛卵母细胞胞质体也能支持爪哇野牛
成纤维细胞核的发育,重构胚可发育至囊胚。用雄
性野牛成纤维细胞获得的重构胚比来自雌性野牛成
纤维细胞的重构胚有高的卵裂率和囊胚率。胚胎移
植后, 两头受体牛怀孕, 但分别在孕期第 30- 60 d
和 60- 90 d流产 [ 7]。L i等 [ 8]将牦牛成纤维细胞的
核移入去核牛卵母细胞,重构胚也可发育至囊胚,但
克隆囊胚的总细胞数及滋养层细胞数占总细胞数的
比例要低于牛体外受精囊胚。克隆胚胎移植后,可
在受体牛子宫中植入,但不能发育至终期。用斑羚
成纤维细胞与去核牛卵母细胞进行融合, 产生重构
胚。未经血清饥饿处理的供体细胞核移植后, 重构
胚可发育至囊胚,而经血清饥饿处理的供体细胞核
移植后,重构胚未能发育至囊胚 [ 9]。羚牛成纤维细
胞与去核牛卵母细胞融合后,克隆胚胎能发育至囊
胚。对克隆囊胚中线粒体 DNA( m itochondria lDNA,
m tDNA)分析发现, m tDNA主要来自受体牛卵母细
胞, 也含有少量供体羚牛 m tDNA [ 10]。
3
异种核移植
异种核移植为研究核质相互作用提供了一种方
法。核移植后,牛卵母细胞能支持异种核发育,从而
可以构建异种克隆胚胎。Dom inko等 [ 11]把绵羊、猪
和猴的成纤维细胞与去核牛卵母细胞进行融合, 异
种克隆胚胎能发育至囊胚, 且囊胚腔形成时间与核
供体动物本身的囊胚腔形成时间一致。但胚胎移植
后,不能发育至终期。狗成纤维细胞与去核牛卵母
细胞融合后, 重构胚可发育至 8- 16细胞期。胚胎
移植后,同样未能得到后代 [ 12]。 Chang等 [ 13]将成纤
维细胞与去核牛卵母细胞进行融合, 4% - 9%的重
构胚发育至桑葚胚和囊胚阶段。在 16细胞期前, 人
和牛 m tDNA在克隆胚胎中共存, 而到桑葚胚阶段,
克隆胚胎中只有牛 m tDNA。猫成纤维细胞与去核
牛卵母细胞融合后, 重构胚可发育至 8细胞期。在
异种克隆胚胎中, 出现 mtDNA的异质性, 从单细胞
期到 8细胞期, 猫 m tDNA的含量相对稳定, 而牛
mtDNA的含量在 1细胞期到 4细胞期相对稳定, 在
8细胞期下降 [ 14]。在异种克隆胚胎中, 核 DNA来自
核供体细胞, 但胞质中存在来自受体卵的 m tDNA,
核质间不协调可能会影响克隆胚胎的发育。
4
转基因牛的生产
将牛体细胞基因修饰和核移植技术相结合, 可
以生产转基因牛,从而使复杂的基因修饰成为可能。
将编码

酪蛋白和

酪蛋白的基因转入牛成纤维
细胞,成纤维细胞核移植后, 产生 11个转基因克隆
牛。在克隆牛的奶中,

酪蛋白的含量增长 8% -
20% ,

酪蛋白增长 2倍 [ 15]。Kuro iw a等 [ 16]通过染
色体克隆系统,构建含人免疫球蛋白 ( immunoglobu

lin, Ig)的重链 ( IgH )和
轻链 ( Ig
)基因的人工染
色体 ( human art ific ia l chromosome, HAC ), 将 HAC载
体导入牛成纤维细胞。成纤维细胞核移植后, 成功
产生 6头克隆牛。对小牛的外周血淋巴细胞进行荧
光原位杂交 ( fluorescent in situ hybridizat ion, FISH )
和逆转录 PCR ( reverse transcription PCR, RT
PCR )
分析,发现 HAC在细胞中保留, IgH和 Ig
均能表
达, 在克隆小牛的血液中出现人 Ig。利用转基因牛
来生产治疗性蛋白在医学领域具有重要的价值。
73
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2010年第 2期
5
细胞治疗
牛成纤维细胞与去核卵母细胞融合后, 获得克
隆胚胎,从克隆囊胚中分离出内细胞团。小鼠成纤
维细胞饲养层用丝裂霉素处理进行灭活。在无血清
培养基中,将内细胞团培养于饲养层上,内细胞团形
成玫瑰花样结构,这种结构可产生神经嵴前体细胞
系。神经嵴前体细胞系长期增殖,并分化成神经元、
神经胶质细胞、黑色素细胞、平滑肌细胞和软骨细
胞, 从而可用于核供体动物的同源自体细胞治
疗 [ 17]。牛卵丘细胞与去核卵母细胞融合后, 产生克
隆胚胎。将分离的内细胞团培养于小鼠成纤维细胞
饲养层上, 获得全能性胚胎干细胞 ( embryon ic stem
cells, ES)。这种 ES细胞具有碱性磷酸酶活性, 能
表达阶段特异性胚胎抗原 4( stage
specific embryon ic
ant igen 4 SSEA4)和 OCT4。ES细胞能形成类胚体,
可分化成 3个胚层细胞,如神经样细胞、肌细胞和上
皮样细胞 [ 18]。从怀孕 42- 50 d的母牛中获得克隆
牛胎儿,自牛胎儿中获得多巴胺细胞,移植至患帕金
森病的免疫抑制大鼠,移植细胞能存活,大鼠的运动
机能增强 [ 19]。 Lanza等 [ 20]用牛成纤维细胞进行核
移植, 从克隆牛胎儿中获得心肌、骨骼肌和肾细胞,
构建组织工程结构,移植到核供体牛中,移植细胞也
能存活。移植后, 心肌组织结构完整, 含纺缍形的
核,骨骼肌组织有多核的肌纤维。肾细胞形成肾小
球状和肾小管样结构,具有滤过和重吸收功能,能够
排泄含有代谢废物的尿样液体。
6
展望
牛卵核移植技术具有广阔的应用前景。通过核
移植技术获得克隆牛。克隆牛的肉和奶的营养价值
和安全性是一个争论热点,目前的研究成果还较少。
这类食品的营养价值与安全性只有经过科学的证
实,才能得到政府和消费者的接受,使人们在餐桌上
享用克隆技术的成果。以牛卵作受体进行异种核移
植,为保护珍稀动物和研究核质相互关系提供了一
条途径。但异种克隆的效率很低, 这可能与核质间
不协调和核不能被正确重编程有关, 因此要对核重
编程的机理进行深入研究, 并改进核移植技术来提
高克隆效率。通过核移植技术生产转基因克隆牛,
但奶中重组蛋白可能对乳腺功能和动物本身有害,
要保证转基因能在哺乳期表达和在乳腺中表达。通
过核移植技术,获得克隆胚胎,从克隆胚胎中获得胚
胎干细胞用于移植治疗研究。移植后细胞死亡率高
可能成为细胞治疗的障碍, 如何提高移植细胞的存
活率需进一步研究。
参 考 文 献
[ 1] T ian XC, Kubota C, S akash ita K, et a.l M eat and m ilk com posit ions
of bovine clon es. Proc Nat l A cad S ci USA, 2005, 102 ( 18 ):
6261
6266.
[ 2] W alsh MK, Lu cey JA, Govindasamy
Lucey S, et a.l C omparison of
m ilk produced by cow s clon ed by nuclear tran sfer w ith m ilk from
n on
clon ed cow s. C lon ing S tem Cells, 2003, 5( 3) : 213
219.
[ 3 ] Yam aguch i M, Ito Y, Takahash i S. Fourteen
w eek feed ing test of
m eat and m ilk derived from cloned cattle in the rat. Theriogenology,
2007, 67( 1 ): 152
165.
[ 4] Yam agu chiM, ItohM, Ito Y, et a.l 12
m on th feed ing study of rep ro

du ct ion /d evelopm ent in rats fedm eat /m i lk pow der supp lem en ted d i

ets derived from the progeny of clon ed cattle p roduced by som atic
cell nu clear transfer. J Rep rod Dev, 2008, 54( 5) : 321
334.
[ 5] W ells DN, M is ica PM, TervitH R, et a.l Adult somat ic cel l nuclear
transfer is used to p reserve the last su rviving cow of the Enderby Is

land catt le breed. R eprod Fert ilDev, 1998, 10( 4) : 369
378.
[ 6] Lan za RP, C ibelli JB, D iazF, et a.l C lon ing of an endangered species
(B os gau rus ) using interspecies nuclear tran sfer. C lon ing, 2000, 2
( 2) : 79
90.
[ 7] S ans inenaM J, Hy lan D, H ebert K, et a.l B anteng(B os javan icu s) em

b ryos and p regn ancies produ ced by interspecies nuclear trans fer.
Theriogenology, 2005, 63( 4 ) : 1081
1091.
[ 8] L iY, L iS, DaiY, et a.l Nu clear reprogramm ing in em bryos generated
by the t ransfer of yak(B os grunn ien s) nu clei in to bovine oocytes and
com parison w ith bov ine
bov ine SCNT and bovine IVF em bryos. Ther

iogenology, 2007, 67( 8 ): 1331
1338.
[ 9] Oh BC, K im JT, Sh in NS, et a.l Produ ct ion of b lastocysts after in ter

generic nu clear tran sfer of gora l(N aem orhedu s g ora l ) somat ic cells
into bov ine oocytes. J VetM ed S c,i 2006, 68( 11) : 1167
1171.
[ 10] L iY, Dai Y, DuW, et a.l C loned endangered sp ecies tak in(B ud or

cas taxicolor ) by in ter
species nuclear tran sfer and comparison of
th e blas tocyst developm en t w ith yak ( B os grunn ien s) and bov ine.
M olRep rod Dev, 2006, 73( 2) : 189
195.
[ 11] Dom ink o T, M italipova M, H aley B, et a.l Bovine oocyte cytop lasm
supports developm en t of emb ryos p roduced by nuclear transfer of
somat ic cell nuclei from various m amm al ian species. B iol Rep rod,
1999, 60( 6 ): 1496
1502.
[ 12 ] Westhu sinME, Bu rghardt RC, Ruglia JN, et a.l Poten tia l for cloning
dogs. JRep rod Fertil Supp,l 2001, 57 ( 1) : 287
293.
[ 13] Thongphakdee A, Kobayashi S, Im ai K, et a.l Interspecies nuclear
74
2010年第 2期 征月良:牛卵核移植技术的应用
transfer emb ryos reconstructed from cat somat ic cells and bovine oo

p lasm. J Rep rod Dev, 2008, 54( 2 ) : 142
147.
[ 14 ] Chang KH, L im JM, Kang SK, et a.l B lastocyst form ation, karyo

typ e, and m itochondrial DNA of in terspecies emb ryos derived from
nuclear transfer of hum an cord fib rob lasts in to enu cleated b ovin e o

ocytes. Fert il S teri,l 2003, 80( 6 ): 1380
1387.
[ 15 ] Brophy B, Sm olen sk i G, Wheeler T, et a.l C loned tran sgen ic catt le
produce m ilk w ith h igh er levels of b eta
casein and kappa
casein.
Nat B iotechn o,l 2003, 21 ( 2) : 157
162.
[ 16 ] Kuroiw a Y, K as inathan P, ChoiY J, et a.l C loned transch rom osom ic
calves p roducing hum an immunoglobu lin. Nat B iotechno,l 2002, 20
( 9 ) : 889
894.
[ 17 ] LazzariG, C olleon iS, G iannelli SG, et a.l D irect der ivat ion of neu ral
rosettes from cloned bovin e b lastocysts: a m odel of early neu ru lation
events and neu ral cres t sp ecification in vi tro. S tem Cel ls, 2006, 24
( 11) : 2514
2521.
[ 18] Wang L, Duan E, Sung LY, et a.l G eneration and characterization of
p lu ripotent stem cel ls from cloned bov ine em bryos. B iol Rep rod,
2005, 73( 1 ): 149
155.
[ 19] Zaw ada WM, C ibell i JB, Choi PK, et a.l S om at ic cel l cloned tran s

gen ic bovine neu ron s for transp lantation in park inson ian rats. N at
M ed, 1998, 4 ( 5) : 569
574.
[ 20] Lanza RP, Chung HY, Yoo JJ, et a.l Gen erat ion of h istocom patib le
t issu es u sing nuclear tran sp lan tat ion. NatB iotechno,l 2002, 20( 7 ):
689
696.

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