全 文 ：综述与专论
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 4期
木质素合成关键酶 肉桂醇脱氢酶的研究进展
龚琰 许梦秋
(北京林业大学生物科学与技术学院,北京 100083 )
摘 要: 肉桂醇脱氢酶 ( CAD )是木质素合成途径的关键酶之一, 它作用于木质素单体生物合成的最后一步。重点综述
了肉桂醇脱氢酶 ( CAD )的在基因家族方面 ,基因调控方面以及蛋白结晶方面的研究进展, 讨论了存在的问题并提出了相关
策略。
关键词: 木质素 肉桂醇脱氢酶 ( CAD ) 调控
Advance in CinnamylA lcohol Dehydrogenase as
a Key Enzyme of L ignin B iosynthesis
Gong Yan Xu M engqiu
(College of Life Sciences and B io technology, Beijing Forestry University, B eijing 100083)
Abstrac:t The c innam y l alcoho l dehydrogenase ( CAD ) is a key enzym e in lignin biosynthesis as it cata ly zes the final step in the
syn thesis o fm ono ligno ls. Th is pape r fo cused on recent reports on cinnam yl a lcoho l dehydrogenase in var ious fields, such as gene fam i
ly, regulation and cry sta llization. M eanw hile, som e prob lem s needed to research are suggested and the possib le developments from now
on are forecasted.
Key words: L ign in C innamy l a lcoho l dehydrogenase Regu lation
收稿日期: 20091120
作者简介:龚琰,女,硕士研究生,研究方向:生物化学与分子生物学; Em ai:l gong6182006@ yah oo. com. cn
肉桂醇脱氢酶 ( cinnamy l a lcohol dehydrogen
ase, CAD, EC 1. 1. 1. 195)是木质素合成途径中第一
个被研究的酶 [ 1, 2]。它是木质素合成过程中关键酶
之一, 催化多种不同的肉桂醛 (香豆醛, 芥子醛, 松
柏醛等 )生成木质素单体的前体物质。目前, 已经
有许多 CAD cDNA从不同的植物中被克隆出来,到
目前为止已在 NCB I上注册的 CAD的完整 mRNA
序列共 187条, 对 CAD cDNA序列分析的结果说明,
它们具有高度的同源性。
1 CAD基因家族
越来越多的试验证明 CAD在植物体内存在着
基因家族。研究者发现拟南芥中有 9个 CAD基
因 [ 3, 4]。它们的相似性高达 70%, 其中的 6个能催
化 5种肉桂醛生成肉桂醇,另外 3个催化能力很低
且只有在底物浓度很高的时候才表现活性。有力地
说明了在拟南芥中木质素单体的合成不是靠单一
CAD催化生成的。A tCAD5和 A tCAD4被证明催化
活性和同源性最高,因而在木质素生物合成中起着
重要的作用 [ 5]。 A tCAD5能有效催化所有 5种底
物, 而 A tCAD4却几乎不能催化芥子醛。
Fan和 Sh i[ 6]研究表明, 棉花纤维中含有 8个
CAD基因。其中 GhCAD1和 GhCAD6的同源性最
高。在棉花纤维次生木质部形成时, 只有 GhCAD6
的表达量升高。系统进化分析表明 GhCAD6属于第
一类,它在木质素合成过程中起着主要作用。 Gh
CAD1属于第三类, 它被认为是对木质素合成有补
偿性作用的机制。氨基酸序列分析表明棉花纤维中
CAD的辅酶结合位点与 bona fide的 CAD的结合位
点有很高的相似性。Tobias和 Chowk[ 7]最近研究发
现水稻中含有 12个 CAD基因。水稻染色体上 9个
不同位点包括 12个基因编码产物截然不同的
CAD,其中 4个与木质化相关的基因在同一位点关
系密切。
目前最新研究表明, 杨树中含有 15个 CAD基
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 4期
因或类似基因 [ 8 ]。系统进化分析表明 CAD基因可
被分为 3类,一类存在于裸子植物和被子植物中,另
外两类只存在于被子植物中。所有的杨树 CAD同
源基因,除了 PtCAD4之外, 都属于第一类和第三
类。促进木质部生长的 CAD基因 ( P tCAD4和 Pt
CAD10)属于第一类和第二类。大多数杨树的 CAD
基因在各个组织,如树叶, 茎,外表皮,木质部等都有
表达, 但表达水平不同。
Saballos等 [ 9]报告在高粱中有 14个 CAD类似
基因, 它们分布于染色体的 7个不同位点。与玉米
和大米的 CAD基因相比, 高粱的 CAD基因在基因
的数量,排列和表达方式上都不同。高粱 CAD2是
主要参与木质化的系统发育的 CAD基因,它的基因
中包含有 3个褐色叶中脉突变体的突变位点。Sat
t ler和 Saatho ff等 [ 10 ]报告高粱 CAD4具有 bm r6的表
型,在木质素合成过程起主要作用。
2 CAD基因调控
研究者已经得到 CAD活性降低的转基因烟
草 [ 11]、杨树 [ 12 ]、苜蓿 [ 12 ]、松柏 [ 13]、玉米 [ 14, 15]和拟南
芥 [ 16, 17 ]。研究表明几种转基因植物的 CAD活性被
抑制, 木质素的总含量并未明显改变,但 CAD的底
物肉桂醛增加了,而产物肉桂醇减少。例如, Bauch
er等 [ 12, 18]将从杨树分离出来 CAD的 cDNA, 进行正
义和反义转化,结果表明木质部组织 CAD活性下降
70%,但木质素含量并未下降。光谱分析显示红色
木质部的杨树香兰素和紫丁香基醛含量提高了。这
些情况可能是由于抑制程度不足或存在其它同工酶
的作用,其原因有待深入研究。
近几年有研究者 [ 17]报道, 将拟南芥的两个木质
素合成相关的基因 ( A tCAD4和 A tCAD5)双突变后,
拟南芥与野生型对比出现倒俯茎, 植株呈现俯倒状
态。这是因为植株缺少维管组织,即大分子木质素
含量大量减少。虽然突变植株中的酚醛的含量却
与野生型中的含量一样。但在最后催化反应步骤
上, 突变体仅有很少的能力去生成木质素单体。
而双突变的木本植物也表现出木质素大量减少的
情况。
3 CAD蛋白结晶
3. 1 蛋白结晶的方法及原理
结晶一般分为 3个不同阶段, 分别为形成稳定
的晶核,由晶核生成晶体,生长结束。单晶培养的方
法 [ 19]通常分为 6种, 包括溶液中晶体生长、界面扩
散结晶、蒸汽扩散结晶、凝胶扩散结晶、水热法,溶液
热法及升华法。蛋白结晶最常采用的是是蒸汽扩散
法 [ 20]。其原理是将蛋白质溶液溶解于含结晶剂的
溶液中,悬滴或坐滴于封闭容器的上方,在容器底部
的池液除不含大分子物质外其他物质与液滴相同。
液滴和池液中的挥发性物质不断进行扩散, 直到液
滴的蒸汽压与池液的相等为止。在该过程中发生的
体积变化使结晶剂的浓度升高, 这很有可能导致过
饱和及随后的结晶。
3. 2 蛋白结晶的影响因素
影响蛋白结晶的主要因素有结晶蛋白的纯度,
过饱和度,温度, pH 值, 结晶剂, 压力, 外加物理场,
及其他影响因素,如蛋白质结晶液的浓度,蛋白质的
来源,细菌及真菌引起的污染程度,样品体积及氧化
还原环境等。
3. 3 国外对 CAD蛋白结晶的研究进展
研究者 [ 21]已经在两个不同温度条件下得到拟
南芥的 A tCAD5的蛋白晶体和 A tCAD5与 NADP+结
合产生的二元蛋白晶体。A tCAD5蛋白晶体分辨率
为 2. 0A。A tCAD5与 NADP +结合产生的二元蛋
白晶体分辨率为 2. 6A。通过对晶体结构的解析,
CAD单体由两个结构域组成: 一个是 Rossmann折
叠的核苷酸结合区域 (残基 163- 301) ,另一个是底
物结合区域 (残基 1- 162, 302- 357)。活性中心就
位于这两个区域中间的接合处。有 Zn2+和 NADP+
等催化辅助物就结合在活性中心。
另有研究者 [ 22]得到了颤杨 SAD(催化底物为芥
子醛的反应 [ 23] )的两个蛋白结晶 (纯化过程中分别
用 DTT 和 ME 处理的 )。它们的分辨率分别为
20A和 25A 。其中介绍了 SAD的三维结构, 通
过对晶体结构的解析, 揭示其活性中心与传统 CAD
蛋白活性中心的预测结构截然不同, 分别从晶体结
构和突变体活性检测结果中证明了 SAD对底物芥
子醛的高特异性。
4 问题与展望
通常情况下,在蛋白结晶试验中,不同的研究人
员会用采用不同材料,甚至是相同的材料,所取得的
试验结果也不一样。除了可能与试验材料及试验药
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2010年第 4期 龚琰等 :木质素合成关键酶 肉桂醇脱氢酶的研究进展
品等相关,还可能是试验程序的设计和操作方面的
问题。因此,需要科研人员加大试验力度。
经过国内外学者几十年的研究, 现在部分植物
CAD的基因家族成员已被阐明, 极少的 CAD蛋白
质结构已被确定。随着分子生物学方法的快速发展
及研究的不断深入,必将有更多的 CAD基因家族成
员和 CAD蛋白结构被阐明。
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