全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 10 期
基于简并引物同步克隆两个红麻 PDIL同源
基因 cDNA 5-末端序列
金刚 陈鹏 唐向民 周瑞阳
(广西大学植物遗传育种重点实验室，南宁 530005)
摘 要: 探索利用同一套简并引物结合通用引物同步扩增两个红麻 PDIL 同源基因的 cDNA 5-末端序列，以期为同一
转录组中两个旁系同源基因 cDNA 5 RACE的同步扩增提供借鉴。通过红麻 HcPDIL5-2a 和 HcPDIL5-2b cDNA 中间片段及
3-末端已知序列的比对，在其完全保守区段设计了一条引物用于两个基因 5 RACE的共反转录;在其部分保守区段设计了两
条简并引物，并利用其在两个基因的 5 RACE扩增时退火温度的差异，结合通用引物巢式 PCR同步扩增两个基因的 cDNA 5-
末端未知序列。在两个基因全长 cDNA拼接序列的基础上设计两对特异引物分别扩增它们的 cDNA全长序列，测序结果进一
步验证了序列拼接和 cDNA 5 RACE同步扩增的可靠性。进化分析证实两个基因属于 PDIL基因家族成员。
关键词: 红麻 简并引物 5 RACE 同步克隆
Synchronous Cloning of 5 cDNA End of Two PDIL Homologous
Gene from Kenaf(Hibiscus cannabinus L．)Using Degenerate Primers
Jin Gang Chen Peng Tang Xiangmin Zhou Ruiyang
(Provincial Key Laboratory of Plant Genetics ＆ Breeding，Guangxi University，Nanning 530005)
Abstract: The study was to put into practice 5 RACE synchronous cloning of two PDIL homologous genes from Kenaf using the
same set of degenerate primers and universal primers，which will provide an insight into 5 RACE synchronous cloning of two homolo-
gous genes from the same plant species． Two middle PDIL gene fragments and their 3 cDNA End were obtained from Kenaf anther in
advance． The common reverse-transcription primer for the 5 RACE was designed in the completely conservative nucleotide regions
based on the sequence alignment of the two middle fragments． Two degenerate primers for nest PCR，which associated with the universal
primers(AAP and AUAP)to nest-amplify the two 5 cDNA end according to different annealing temperature，were designed in the par-
tial conservative regions． The two complete cDNA sequences were checked by specific-primer PCR according to their sequence assem-
bly，which further validates the sequence-assembly results and feasibility of synchronous cloning technique of cDNA 5 RACE． Phyloge-
netic analysis also confirmed that the two genes belong to PDIL gene family． It paves a way to further study the function of the two genes
in cytoplasmic male sterility of Kenaf．
Key words: Hibiscus cannabinus L． Degenerate primers 5 RACE Synchronous cloning
收稿日期:2011-02-14
基金项目:国家自然科学基金项目(30900912，31060199) ，国家麻类产业技术体系建设专项资金项目(nyctx-19-E16)
作者简介:金刚，男，硕士研究生，研究方向:生物技术育种;E-mail:jgjg_1981@ 163． com
通讯作者:周瑞阳，男，教授，博士生导师，研究方向:作物雄性不育与杂种优势利用;E-mail:ruiyangzhou@ yahoo． com． cn
蛋白质二硫键异构酶(protein disulfide isomer-
ase，PDI)在多种代谢途径中起重要作用，包括分泌
蛋白折叠、分子伴侣活化和氧化还原信号的传
导［1–3］。高等植物的类蛋白质二硫键异构酶(pro-
tein disulfide isomerase-Like，PDIL)基因家族成员在
同一基因组中具有多样性的特征，在水稻和拟南芥
中的分别有 12 和 13 个成员，分属于 8 个不同的基
因亚家族［4，5］。部分基因也涉及到信号传导通路，
通过与转录复合体的协作调控响答于各种外界刺激
信号基因的表达。李刚［6］利用 ITRAQ 技术揭示了
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
红麻中一个 OsPDIL5-3 直系同源在不育系和保持系
花药中的蛋白表达量差异显著。我们之前的研究通
过同源克隆和 3 RACE 技术分别获得了红麻两个
PDIL同源基因 cDNA 中间片段及其 3-末端序列。
分子进化树分析显示，它们和水稻 OsPDIL5-3 直系
同源。克隆两个基因的全长 cDNA序列可为研究其
在不育系和保持系花药中的表达特征，继而进行功
能分析奠定基础。
完整的 cDNA序列可以通过全长 cDNA 文库的
筛选和 cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification
of cDNA ends，RACE)获得。在功能基因组学日益
发展的今天，RACE 在众多技术中日益凸显出其优
势。但当前针对植物中多基因家族成员的 5 RACE
或 3 RACE 扩增大多设计特异引物进行［7］。研究
人员往往需要根据目的基因已知的中间片段序列而
设计 5 RACE 或 3 RACE 反应的基因特异性引物
(GSP1 和 GSP2)。特异性引物在很大程度上避免
了其他同源基因模板的存在对目的基因扩增的干
扰，使得 PCR产物的特异性得以增强。对于基因家
族成员的 5 RACE 或 3 RACE 扩增往往只能逐个
针对其非保守区段设计特异引物来进行 PCR，工作
量大且繁琐。因此，如能基于同一基因组中旁系同
源基因核苷酸序列的同源性，在其序列完全或部分
同源区段设计 5 RACE 或 3 RACE 的反转录简并
引物和 PCR简并引物，即利用一套相关引物同步进
行 5 RACE或 3 RACE扩增，那么必将显著提高多
个同源基因 cDNA末端序列扩增的效率。
本研究在这两个基因 cDNA已知中间片段序列完
全同源区域设计反转录引物，在其部分同源区域依据
模板序列设计两条巢式 PCR简并引物，并利用扩增目
的基因退火温度的差异尝试同步克隆两个同源基因的
cDNA 5-末端序列，得到了它们的全长序列，并命名为
HcPDIL5-2a和 HcPDIL5-2b。研究结果为提高同源基
因 cDNA末端序列的扩增效率提供参考。同时，克隆
的红麻全长基因HcPDIL5-2a和 HcPDIL5-2b为进一步
了解其在红麻细胞质雄性不育(Cytoplasmic male steril-
ity，CMS)发生过程中的作用奠定了基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 植物材料 以红麻 P3A为供试材料，其种子由
广西大学麻类作物研究所提供，2009 年 3 月种植于广
西大学农学院教学科研实习基地，并于当年 9 月提取
其花药总 RNA。
1. 1. 2 主要试剂 CTAB、PVP、β-巯基乙醇和DEPC购
自索莱宝公司;5 RACE System for Rapid Amplification
of cDNA Ends(Version 2. 0)购自英骏公司;pUCm-T载
体、Taq plus Taq DNA聚合酶和 dNTP Mixture均购自上
海生工生物工程公司;T4 DNA 连接酶和 M-MLV 反转
录酶购自 TaKaRa 公司;DL5000 DNA Ladder 购自全式
金公司;DNA凝胶回收试剂盒购自东盛公司;大肠杆菌
DH5α菌株由广西大学植物遗传育种实验室提供;引物
合成和测序工作交由华大基因公司完成。
1. 2 方法
1. 2. 1 总 RNA的提取 采用 CTAB法提取红麻 L23A
的花药总 RNA［8，9］。
1. 2. 2 5 RACE扩增 在 HcPDIL5-2a和 HcPDIL5-2b
基因已知 cDNA序列的完全保守区段，设计一条反转
录引物(Co-RT)用于两个基因 5 RACE 的共反转录。
在该反转录引物下游的部分保守区段根据模板序列设
计两条简并引物 GDP1和 GDP2(3最末或倒数第二位
均含简并碱基)，分别与通用引物 AAP 和 AUAP(表
1)组成引物对用于 5 RACE巢式 PCR扩增。引物与
GenBank中非 OsPDIL5-3 的直系同源基因序列无明
显同源性。巢式 PCR反应中的引物退火温度依照其
所扩增的目的基因已知 cDNA对应序列而设定，基因
扩增示意图如图 1所示。所有步骤均按 Invitrogen公
司的 5 RACE System for Rapid Amplification of cDNA
Ends kit说明书进行。
图 1 HcPDIL5-2a和 HcPDIL5-2b 5
RACE同步扩增示意图
011
2011 年第 10 期 金刚等:基于简并引物同步克隆两个红麻 PDIL同源基因 cDNA 5-末端序列
PCR 扩增体系为 50 μL:10 × PCR buffer 5 μL，
10 mmol /L的 dNTP 2 μL，10 μmol /L 上下游引物
(AAP或 AUAP，3 GSP1)各 2 μL，反转录产物 1
μL为模板，Taq DNA 聚合酶 2 U，加 ddH2 O 至 20
μL。HcPDIL5-2a 5 RACE 第一轮降落 PCR 反应
程序:105℃热盖，95℃预变性 5 min;95℃变性 45
s，64. 5 － 55. 5℃退火，每个循环降 0. 3℃，72℃延
伸 45 s，共 31 个循环;95℃变性 45 s，55℃退火 45
s，72℃延伸 45 s，共 10 个循环;72℃延伸 10 min。
其第二轮 PCR 反应程序:95℃预变性 5 min;95℃
变性 45 s，60℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，共 30 个
循环;72℃延伸 10 min。HcPDIL5-2b 5 RACE 第
一轮 PCR反应程序:95℃预变性 5 min;95℃变性
45 s，57℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，共 10 个循环。
其第二轮降落 PCR 反应程序:105℃热盖，95℃预
变性 5 min;95℃变性 45 s，65. 5 － 54. 5℃退火，每
个循环降 0. 3℃，72 ℃延伸 45 s，共 31 个循环;
95℃变性 45 s，54℃退火 45 s，72℃延伸 45 s，共 10
个循环;72℃延伸 10 min。第二轮 PCR 反应的模
板均为第一轮 PCR产物 100 倍的稀释液。电泳检
测第二轮 PCR反应产物后用胶回收试剂盒回收目
的条带，并克隆测序。
表 1 本研究使用到的引物序列及其退火温度
引物名称 引物序列 退火温度(℃)
Co-RT TTCAGATATTGAACAAGT 42. 0
GDP1 AKAATACTCCATAGAAACKCCATGYA 60. 9 /59. 2
GDP2 GACGGGTAAAYTTGTCAGCATTAACTTTRG 57. 4 /58. 5
AAP GGCCACGCGTCGACTAGTACGGGIIGGGIIGGGIIG –
AUAP GGCCACGCGTCGACTAGTAC 59. 6
HcPDIL5-2a-Check-F TGTTGCTGTTCTCGATCTTG 52. 6
HcPDIL5-2a-Check-R GAGTGCAATAACAGTGTTAGAGAA 52. 7
HcPDIL5-2b-Check-F CTCCAATGCCGAAAATG 50. 0
HcPDIL5-2b-Check-R CAGAAATCAGGACTTGAACTC 51. 0
1. 2. 3 全长 cDNA序列的拼接和验证 通过DNAs-
tar软件将 5 RACE测序结果与已知的中间片段以及
3 RACE序列进行拼接，在此基础上设计两对特异引
物 (HcPDIL5-2a-Check-F，HcPDIL5-2a-Check-R 和
HcPDIL5-2b-Check-F，HcPDIL5-2b-Check-R) (表 1)
分别用于两个基因 cDNA 全长序列的扩增，并将目
的条带回收，克隆至 pUCM-T载体上，送至华大基因
广州分公司测序，以验证拼接的全长 cDNA序列。
2 结果
2. 1 HcPDIL5-2a和 HcPDIL5-2b基因 5 RACE 的
同步克隆
巢式 PCR扩增产物电泳(图 2)及测序结果表
明 HcPDIL5-2a 和 HcPDIL5-2b 5 RACE 产物序
列(图 2)分别为 296 bp 和 338 bp。用 DNAstar
软件将测序结果与已知的中间片段以及 3
RACE 序列进行拼接，并结合测序峰图进行校正，
两个 5 RACE 测序结果分别和对应的中间片段
序列重叠。以上结果表明扩增结果是两个基因
的 cDNA 5-末端序列。
2. 2 全长 cDNA序列的验证
为验证克隆全长 cDNA 序列的准确性，分别设
计了两对引物用于扩增 HcPDIL5-2a和 HcPDIL5-2b
全长 cDNA。扩增出结果(图 3)显示，其长度分别为
1 521 bp和 1 590 bp 并有完整的开放阅读框(数据
未列出)。全长 cDNA 测序结果与序列拼接结果吻
111
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 10 期
合。说明扩增的 HcPDIL5-2a 和 HcPDIL5-2b 基因
全长序列正确。两个全长 cDNA 序列均已提交到
GenBank (HcPDIL5-2a，HQ638208;HcPDIL5-2b，
HQ898859)。
M． 100 bp plus DNA 分子质量标准 100 bp plus DNA
marker;1． HcPDIL5-2a 的 5 RACE 扩增产物;2． HcP-
DIL5-2b的 5 RACE扩增产物
图 2 HcPDIL5-2a和 HcPDIL5-2b
的 5RACE同步扩增产物
M． DNA Marker DL5000;1． HcPDIL5-2a;2． HcPDIL5-2b
图 3 HcPDIL5-2a和 HcPDIL5-2b全长
cDNA序列的扩增产物电泳图
2. 3 红麻 PDIL基因的分子进化分析
分别选取 GenBank 中水稻、玉米、红麻和拟南芥
的 PDIL同源基因，用 MEGA 4. 0软件构建进化树(图
4)。基于氨基酸序列的分子进化树分析进一步表明，
这些基因分属于 8 个不同的基因亚家族，与 Hous-
ton［5］的研究结果一致。而 HcPDIL5-2a 和 HcPDIL5-
2b均是与水稻 OsPDIL5-3直系同源的基因。
图 4 基于氨基酸序列的 HcPDIL5-2a和
HcPDIL5-2b分子进化树
3 讨论
本研究基于红麻 HcPDIL5-2a 和 HcPDIL5-2b
已知 cDNA序列的同源性，应用 5 RACE 技术同步
克隆了两个基因的 5-末端 cDNA序列。众所周知，
引物与模板的结合及引物链的延伸是遵循碱基配对
原则的。引物 3端的碱基，特别是最末及倒数第二
个碱基，应严格要求配对，否则会因末端碱基不配对
而导致 PCR 失败。本研究设计的 5 RACE 巢式
PCR引物在其 3端最末或倒数第二位均含有依据
两个基因中间片段同源区段单核苷酸差异而设计的
简并碱基。这使得在巢式 PCR扩增时，简并引物会
因该位点简并碱基的存在而特异性地扩增 HcP-
DIL5-2a 或 HcPDIL5-2b 的 cDNA 5-末端序列;同
时，利用简并引物在扩增不同目的基因时退火温度
的不同而针对性地设置了不同的 PCR 反应程序。
降落 PCR正确和非正确退火温度之间的任何差异
将造成每个循环 PCR 产物量的两倍差异［10］。在扩
增 HcPDIL5-2a cDNA 5-末端序列时，第一轮 PCR
简并引物在较高的退火温度下优先扩增目的产物，
虽然在较低的退火温度下存在 HcPDIL5-2b 5
211
2011 年第 10 期 金刚等:基于简并引物同步克隆两个红麻 PDIL同源基因 cDNA 5-末端序列
RACE的非目的扩增，但采用降落 PCR 反应程序使
得目的产物在第一轮 PCR 后得以富集。在进行
HcPDIL5-2b 5 RACE 扩增时，第一轮 PCR 在较低
的退火温度下进行，虽有 HcPDIL5-2a 5 RACE非特
异扩增的干扰，但只扩增了 10 个循环;且在第二轮
PCR中简并引物在较高的退火温度优先进行 HcP-
DIL5-2b 5 RACE扩增，降落 PCR 反应也使得目的
产物得以富集。这些都在很大程度上避免了另一旁
系同源基因模板的存在对目的基因扩增的干扰，大
幅度提高了 PCR 扩增特异性［11］。在操作上，同步
克隆法较传统的设计特异巢式 PCR 引物分步克隆
同一转录组中两个旁系同源基因的 cDNA 5-末端
序列的方法更为简易，实现了从提取总 RNA到巢式
PCR之前操作的同步，人力、物力和财力因而得以
节省。本研究对同一转录组中旁系同源基因的 3
RACE克隆也具有重要的参考意义。
PDIL基因家族中某些基因对植物的正常生长
发育至关重要。例如，拟南芥 CYO1 基因功能的丧
失会导致其子叶的白化［12］;拟南芥 PDIL1-1 蛋白对
于其种子的正常发育是必需的，且通过活化或抑制
Cys蛋白酶来调控程序性细胞死亡的发生［13］;Wang
等［14］发现拟南芥中的 PDIL2-1 基因的突变会导致
因为胚囊延迟成熟而导致的种子产量减少。本研究
从红麻花药中克隆获得两个 PDIL 同源基因 cDNA
全长序列，为进一步研究这两个基因与红麻 CMS 的
关系奠定了基础。
参 考 文 献
［1］Wilkinson B，Gilbert HF． Protein disulfide isomerase． Biochim Bio-
phys Acta，2004，1699(1-2) :35-44．
［2］Tsai B，Rodighiero C，Lencer WI，et al． Protein disulfide isomerase
acts as a redox-dependent chaperone to unfold cholera toxin． Permis-
sions ＆ Reprinits，2001，104(6) :937-948．
［3］Hayano T，Hirose M，Kikuchi M． Protein disulfide isomerase mutant
lacking its isomerase activity accelerates folding in the cell． FEBS
Lett，1995，377(3) :505-511．
［4］dAloisio E，Paolacci AR，Dhanapal AP，et al． The protein disulfide
isomerase gene family in bread wheat(T． aestivum L．)． BMC Plant
Biology，2010，10(1) :101．
［5］Houston NL，Fan CZ，Xiang QY，et al． Phylogenetic analyses identify
10 classes of the protein disulfide isomerase family in plants，inclu-
ding single-domain protein disulfide isomerase-related proteins． Plant
Physiol，2005，137(2) :762-778．
［6］李刚．红麻细胞质雄性不育系线粒体蛋白质组差异分析与不育
相关基因的发掘［D］．南宁:广西大学农学院，2008．
［7］Harvey RJ，Darlison MG． Random-primed cDNA synthesis facilitates
the isolation of multiple 5-cDNA ends by RACE． Nucleic Acids Re-
search，1991，19(14) :4002．
［8］Chang SJ，Puryear J，Cairney J． A simple and efficient method for iso-
lating RNA from pine trees． Plant Molecular Biology Reporter，1993，
11(2) :113-116．
［9］Gasic K，Hernandez A，Korban SS． RNA extraction from different ap-
ple tissues rich in polyphenols and polysaccharides for cDNA library
construction． Plant Molecular Biology Reporter，2004，22:437a-437g．
［10］沈元月． RACE技术研究进展与展望．生物技术通报，2008(增
刊) :131-134．
［11］钟涛． cDNA末端快速扩增技术新进展． 国外医学分子生物学
分册，2002(1) :7-11．
［12］ Shimada H，Mochizuki M，Ogura K，et al． Arabidopsis cotyledon-
specific chloroplast biogenesis factor CYO1 is a protein disulfide
isomerase． Plant Cell，2007，19(10) :3157-3169．
［13］ Andeme Ondzighi C，Christopher DA，Cho EJ，et al． Arabidopsis
protein disulfide isomerase-5 inhibits cysteine proteases during traf-
ficking to vacuoles before programmed cell death of the endothelium
in developing seeds． Plant Cell，2008，20(8) :2205-2220．
［14］Wang HZ，Boavida LC，Ron M，et al． Truncation of a protein disul-
fide isomerase，PDIL2-1，delays embryo sac maturation and disrupts
pollen tube guidance in Arabidopsis thaliana． Plant Cell，2008，20
(12) :3300-3311．
(责任编辑 马鑫)
311