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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
大蒜 A病毒 CP基因的原核表达及抗血清制备
杨宇1 韦传宝1，2 华俊雅1 刘春云1 吴琪瑶3
(1皖西学院生物与制药工程学院，六安 237012;2安徽仿生传感与检测技术实验室，六安 237012;3安徽大学生命科学学院，合肥 230039)
摘 要: 根据 GenBank报道的大蒜 A病毒(GarV-A)序列设计引物、扩增其外壳蛋白基因并进行序列分析。结果表明，
GarV-A的 CP基因与目前已报道的两种 GarV-A不同分离物 CP基因的核苷酸序列同源性为 98% － 99%;氨基酸序列同源性
均为 98%。将 GarV-A CP基因插入表达载体 pSBET，在大肠杆菌 BL21(DE3)Plys E菌株中诱导表达。CP经 12% SDS-PAGE
和 5% －20% SDS-PAGE两次纯化，免疫小鼠获得抗 CP血清，Western blotting 分析表明确定制备的抗体对 CP 具有高度特异
性，ELISA检测表明制备的抗体能够与天然病毒离子结合，因此可以作为该病毒的检测。
关键词: 大蒜 A病毒 CP基因 原核表达 抗血清制备
Prokaryotic Expression of Garlic virus A CP Gene and
Preparation of Its Antiserum
Yang Yu1 Wei Chuanbao1，2 Hua Junya1 Liu Chunyun1 Wu Qiyao3
(1Biological and Pharmaceutical Engineering College，West Anhui University，Liuan 237012;
2Anhui Provincial Laboratory of Biomimertic Sensor and Detecting Technology，Liuan 237012;
3Life Science College，Anhui University，Hefei 230039)
Abstract: Specific primer was designed to amplify Garlic virus A Liuan isolate． The multiple aligment shows that GarV-A shared
98% －99% nucleotide acids identities and 98% amino acids identities with the two sequences of CP genes reported on GenBank． Then
the CP gene was inserted into pSBET and expressed in Escherichia coli BL21 (DE3)plys E strain． The object protein was purified by
12% SDS-PAGE firstly and subsequently 5% － 20% gradient SDS-PAGE． The antiserum against the CP was raised in mouse and its
specificity was confirmed by Western blotting analysis． ELISA result indicated that the antiserum is suitable for GarV-A detection．
Key words: Garlic virus A CP gene Prokaryotic expression Antiserum preparation
收稿日期:2010-12-13
基金项目:安徽省教育厅自然科学基金重点项目(KJ2011A272)
作者简介:杨宇，男，本科，研究方向:分子生物学;E-mail:yangyu1009@ sina． cn
通讯作者:韦传宝，男，博士，副教授，硕士生导师;E-mail:weichuanbao@ sina． com
已报道侵染大蒜的病毒主要来自马铃薯X病毒属
(Potxvirus)［1，2］、马铃薯 Y病毒属(Potyvirus)［3，4］、麝香
石竹潜隐病毒属(Carlavirus)［5］和葱属 X病毒属(Allex-
ivirus)［6］，几种病毒复合侵染的情况十分普遍［3，7］。
大蒜 A 病毒(Garlic virus A，GarV-A)是侵染大
蒜的病毒之一，为葱属 X 病毒属成员，其全基因组
序列已被测定。葱属 X 病毒属成员的病毒粒子呈
弯曲线状，螺旋对称结构，全长约 700 － 800 nm，直
径为 12 nm，无包膜。其核酸分子为单链正义 RNA，
长约 8 000 － 9 000 bp，整个基因组包括 6 个 ORF，翻
译产生 6 个蛋白质，从 N 端到 C 端依次为复制酶、
25 － 28 kD蛋白、11 － 12 kD 蛋白、31 － 43 kD 蛋白、
外壳蛋白(Coat protein，CP)和 14 － 15 kD蛋白［8］。
国内外对 GarV-A的普通生物学和血清学研究
较少，鲜见关于制备该病毒 CP 抗血清并用 ELISA
方法检测 GarV-A 的报道。本研究旨在原核表达
GarV-A的 CP基因，并制备抗 CP 血清，为大田检测
GarV-A奠定了基础。
1 材料和方法
1. 1 材料
从六安市郊区采集有明显花叶症状的大蒜叶片
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
置 － 80℃冰箱保存。大肠杆菌 TG1 菌株和表达菌
株 BL21(DE3)pLys E购自 Pharmacia 公司;pGEM-T
和 pSBET载体为 Promega公司产品;Ex Taq DNA聚
合酶、T4 DNA Ligase、BamH I、Nde I、RNase H、AMV
Reverse Transcriptase、Ribonuclease Inhibitor、DNA
Ligation Kit ver． 2 为 TaKaRa 公司产品;GeneRulerTM
1 kb DNA Ladder为MBI公司产品;低分子量标准蛋
白为中国科学院上海生物化学研究所产品;羊抗鼠
IgG(共价结合碱性磷酸酶)、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸
(BCIP)和氮蓝四唑(NBT)为 Sigma 公司产品;其它
试剂均为进口分装的分析纯;引物合成以及测序由
上海生工完成。
1. 2 植物病叶总 RNA提取与 cDNA合成
提取样品总 RNA 按照 RNeasy Plant mini(QIA-
GEN)试剂盒提供的方法，－80℃保存。以 M4-T (5-
GTTTTCCCAGTCACGAC(T)15-3)为起始引物，采用
禽源逆转录酶体系，20 μL 反应体系包括:10. 5 μL
模板 RNA;4. 0 μL 5 ×逆转录反应缓冲液;0. 5 μL
RNase Inhibitor (40 U /μL) ;2. 0 μL 起始引物(100
μmol /L) ;2. 0 μL 10 mmol /L dNTPs;1 μL AMV (5
U /μL)。42℃水浴合成 1. 5 h，加入 40 μL灭菌水后
于 － 30℃冰箱备用。
1. 3 原核表达载体的构建与 CP基因的诱导表达
根据 GenBank 上已报道的 GarV-A 全序列，由
上海生工公司合成以下引物:GarV-A CPe(+) :5-
CCATATGAACAATCCTGTTGATCC-3;GarV-A CPe
(－ ) :5-GGGATCCTTAGAACGTGATCATTGGAG-3
(划线处为 Nde I 和 BamH I 的酶切位点)以样品第
一链 cDNA 为模板，采用 LA Taq DNA 聚合酶
(TaKaRa公司)PCR扩增 GarV-A分离物全长 CP基
因，反应体系参照说明书。预期扩增产物经 1%
(W/V)的琼脂糖凝胶电泳分离，用 QIAquick Gel Ex-
traction试剂盒回收，具体方法参照厂家说明。将纯
化产物导入 pGEM-T 载体，并转化 TG1 菌株，蓝白
斑筛选后，提取阳性克隆质粒，经 PCR检测后测序。
将含有 GarV-A CP 基因的质粒(pGEM-GarV-A-3t)
用 Nde I和 BamH I 双酶切后插入到同样经双酶切
的表达载体 pSBET 中，转化大肠杆菌 BL21 (DE3)
plys E 菌株，用 IPTG 诱导表达目的基因，经 12%
SDS-PAGE后，用考马斯亮蓝 G-250 染色检测。
1. 4 抗血清的制备和 Western blotting 检测
用 2 × SDS 上样缓冲液裂解表达 CP 基因的大
肠杆菌，煮沸 10 min离心去除沉淀，对含 CP的上清
液进行 12% SDS-PAGE 分离纯化，电泳完毕后用
0. 25 mol /L KCl溶液染色。切下目的蛋白条带并加
入适量 1 × SDS 上样缓冲液充分研磨。离心后上清
液进行 5% － 20%梯度 SDS-PAGE 二次分离纯化，
电泳完毕后用 4℃预冷的 0. 25 mol /L KCl 溶液染
色。切下目的蛋白条带，充分研磨后免疫小鼠，每隔
7 d免疫 1 次，第 4 次免疫后 3 d 断头取血，制备抗
血清。用Western blotting 法检测抗 GarV-A CP血清
的特异性，二抗为羊抗鼠 IgG (共价结合有碱性磷酸
酶) ，BCIP /NBT显色［9］。
1. 5 样品的间接 ELISA检测
用制备的抗 GarV-A CP血清与带 GarV-A病毒的
大蒜病叶进行间接 ELISA检测，被测样品孔吸光度值/
阴性样品孔吸光度值(P/N)≥2. 1判断为阳性［10］。
2 结果
2. 1 GarV-A CP基因的克隆与序列分析
用引物对 GarVA-CPe(+)∕ GarVA-CPe(－)
从样品 cDNA 中扩增到 756 bp 大小的预期目的片
段(图 1)。经纯化后插入 pGEM-T 载体，构建
pGEM-GarV-A-3t，转化 TG1 菌，测序并对序列进行
Blast比对。分析结果(图 2)表明，GarV-A六安分离
物 CP基因由 756 个碱基组成，共编码 251 个氨基酸
(图 3) ，与 GenBank上已报道的两种 GarV-A不同分
离物 CP基因的核苷酸序列同源性为 98% － 99%，
其相应翻译的氨基酸序列同源性均为 98%。
M． DNA Marker DL2000;1． GarV-A CP基因 RT-PCR产物
图 1 GarV-A CP基因 RT-PCR扩增产物琼脂糖
凝胶电泳分析
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2011 年第 7 期 杨宇等:大蒜 A病毒 CP基因的原核表达及抗血清制备
图 2 GarV-A六安分离物、日本分离物和韩国分离物 CP基因核苷酸序列对比
图 3 GarV-A六安分离物、日本分离物和韩国分离物 CP基因氨基酸序列对比
2. 2 GarV-A外壳蛋白基因的原核表达
GarV-A CP 基因经过 BamH I 和 Nde I 双酶切
后插入到同样双酶切 pSBET 原核表达载体中，转
化大肠杆菌 BL21 (DE3)Lys E 菌株，经 IPTG 诱
导表达。12% SDS-PAGE 检测结果(图 4)表明，
在预期大小位置显现一条浓度较高的诱导表达
条带，而对应的空载体转化诱导的细菌裂解物无
此条带。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
M．蛋白质分子量标准;1． 经 IPTG 诱导的 BL21(DE3)
plys E(CK －) ;2．经 IPTG诱导且转化 GarV-A CP 基因的
BL21(DE3)plys E
图 4 GarV-A CP基因转化的 BL21(DE3)plys E菌株经
IPTG诱导表达 3 h后 SDS-PAGE检测
2. 3 抗血清的 Western blotting 检测
Western blotting 分析(图 5)表明，制备的抗 CP
血清与空载体转化诱导的细菌裂解物(CK －)无显
色反应，而与表达 CP 工程菌目的蛋白条带部位有
显色反应。
M．蛋白质分子量标准;1． IPTG诱导的 BL21 (DE3)plys
E (CK －) ;2． 经 IPTG 诱导且转化 GarV-A CP 基因的
BL21(DE3)plys E菌
图 5 GarV-A外壳蛋白抗血清的Western blotting检测
2. 4 ELISA检测
抗 GarV-A CP血清与带 GarV-A 病毒的大蒜病
叶进行的间接 ELISA 反应呈阳性，与健康叶阴性对
照比较，P /N = 8. 30。
3 讨论
大蒜(Allium sativum L．)是我国重要的经济作
物，由于大蒜采用无性繁殖，以致病毒在球茎中不断
积累，产量和品质逐年下降。解决的办法主要是繁
育脱毒或者低毒良种，要确定是否带病毒有效、方
便、低成本的检测方法是关键，因此病毒抗体的制备
至关重要。
关于植物病毒抗体的制备，最直接的方法是用
分离纯化的病毒粒子直接免疫试验动物。侵染大蒜
的病毒众多，而且大多呈复合感染［3，4］，而且它们的
形态、大小相似［6，7］，增加了分离纯化病毒的难度，
纯化的病毒粒子往往是几种病毒的混合物，制备的
抗体特异性差。本研究采用原核表达 GarV-A CP基
因、两次制备电泳纯化 CP 并免疫小鼠，成功地制备
出能与天然病毒粒子结合的抗体，为检测和研究
GarV-A奠定了基础。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠)
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