全 文 ：生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN·研究报告· 2008年第 6期
收稿日期：2008-04-30
基金项目：国家“973”计划项目“重要农作物品质性状功能基因组学与分子改良的研究”（2002CB111302）
作者简介：汪长东（1974-），男，博士研究生，研究方向：化学与分子生物学；E-mail：wangchangdonghust@yahoo.cn
通讯作者：何光源（1958-），男，教授，博导，E-mail：hegy@hust.edu.cn
在盐田生态系统中生活的细胞，极高的含盐量可以引起高渗透压，为了生存，细胞就要保持低水压同
时增加细胞中钠离子的浓度。耐盐微生物进化出与众不同的策略以对重平衡渗透压 [2]。海洋环境的生物，其
机体组分和代谢产物也与陆生生物大不相同，其细胞内形成了多种具有特殊功能的酶，同时蕴含着大量的
新型化合物，对人类的生产和生活都是十分有用的 [3]。
根据其对盐分的要求以及耐受范围不同，Kushner 将盐生微生物分为 6 类：即非嗜盐菌（最适生长盐度
即氯化钠浓度<0．2mol/L）主要是淡水微生物；轻度嗜盐菌（最适生长盐度为 0．2～0．5mol/L），多数海洋微生
物属于这个类群；中等嗜盐菌（最适生长盐度为 0．5～2．5mol/L）；边缘极端嗜盐菌（最适生长盐浓度在 1．5～
4．0mol/L）极端嗜盐菌（最适生长盐度 2．5～5．2mol/L）；耐盐菌（生长对氯化钠没有要求，其中对盐分的耐受
浓度超过 2．5mol/L 的称为极端耐盐菌）[4，5]。
近年来，从我国青海省大柴旦盐湖、新疆艾丁湖、塘沽盐场、青岛东风盐场等地不断分离出耐盐菌新种 [6]。
舟山位于我国东南沿海，中国大陆海岸线的中心，地理坐标为东经 121°30′~123°25′，北纬 29°32′~-31°04′，
是著名的长江、钱塘江和甬江的出海口，海洋资源相当丰富，是进行耐盐菌研究的菌株理想来源地。从舟山
深海取得海泥样品，获得一株耐盐菌，能在 0.5%~10%NaCl 培养基中生长，测其 16S rRNA 序列。
一株耐盐细菌的 16S rRNA基因序列分析
汪长东 陈鹏 闫旭 景红娟 黄阜峰 汪越胜 杨广笑 何光源
（华中科技大学生科院中英联合实验室 教育部分子生物物理重点实验室，武汉 430074）
摘 要： 从舟山群岛滩涂土壤中获得了海水和底泥样品，并从中提取到了一株耐盐细菌，通过用不同盐浓度的培
养基培养，挑取单菌落，反复划线纯化，得到了耐盐菌的单菌落。通过菌株基因组DNA的提取、菌株的抗性实验、质粒的
提取、16S rRNA的PCR扩增及克隆、16S rRNA的全序列分析等手段，对该菌株的16S rRNA的基因序列进行了研究。
关键词： 耐盐菌 筛选 16S rRNA PCR
The 16S rRNA Gene Sequence Analysis of a
Halotolerant Bacteria Strain
Wang Changdong Chen Peng Yan Xu Jing Hongjuan Huang Bufeng
Wang Yuesheng Yang Guangxiao He Guangyuan
（China-UK HUST-RRes Genetic Engineering and Genomics Joint Laboratory，Huazhong University of
Science and Technology，Wuhan 430074）
Abstract： The sea water and mud sample was got from Zhoushan archipelago，and a halotolerant bacterium strain
was isolated. By culturing in medium with various salt concentrations，the single colony was picked out and isolated by
streaking purification. The gene sequencing of the 16S rRNA of the halotolerant bacteria continued，that was carried out
with following work，including genomic DNA of the strain，resistance study of the strain，extraction of the plasmid，PCR
amplification and clone of the 16S rRNA，sequence analysis of 16S rRNA.
Key words： Halotolerant bacteria Screening 16S rRNA PCR
2008年第 6期
1 材料和方法
1.1 供试菌株
菌株来源于舟山群岛滩涂土壤，经无菌双蒸水稀释后，再过滤获得。
1.2 仪器和试剂
用于本试验的设备主要为低温冷冻离心机（HITACHI CR21R）、PCR 扩增仪（Biometra PCR 仪）。 试验所
用 ExTaq DNA 酶、pMD-18T 载体购于 TAKARA 公司。 DNA 凝胶回收试剂盒购于上海博亚生物技术有限公
司。
1.3 菌株筛选及基因组 DNA 的提取
1.3.1 菌株的筛选 筛选 LB 培养基：每一升中含蛋白胨 10g，酵母粉 5g，盐浓度按照含 NaCl 浓度 0.5％，
0.9％，2.5％，3.5％，5％，8%，10％，20%，30％设置。 用 200μl 土壤过滤液涂平皿，挑取单菌落反复划线纯化，
37℃摇床培养，得到 10％NaCl 培养基中生长的 9 个单菌落。 纯化好的菌株以甘油管用冻存管在-80℃保存，
以便后面的研究使用。
1.3.2 菌株基因组 DNA 的提取 将液体培养基中生长好的菌经，12 000r/min 离心 2min 后倒去上清收集
菌体，用无菌水清洗菌体，按 TIANamp Genomic DNA Kit DNA 提取试剂盒提取菌基因组 DNA。溶菌酶破壁，
蛋白酶 K 处理，酚/氯仿/异戌醇按体积比 25/24/1 进行抽提，冷无水乙醇沉淀，70%冷乙醇洗净沉淀后减压
干燥风干，最后溶于 TE 缓冲液中并放置在- 20℃条件下保存。
1.4 菌株的抗性试验
用不同盐浓度的 LB 培养基在 37℃摇床中摇菌，对菌株抗盐性进行筛选，结果表明该株菌能在 0.5％~
10％NaCl 生长，而普通菌如 DH5a 只能在 0.5％~5％NaCl 生长。
1.5 16Sr RNA 的 PCR 扩增及克隆
以提取的基因组 DNA 为模板， 通过 PCR 反应扩增菌株的 16S rRNA 基因序列。 PCR 扩增采用一对引
物，其正向引物为 F（8~27）：5-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3，反向引物为 R（1525~1541）：5-TAAGGAGGT
GATCCAAC-3。 引物分别对应 NCBI Escherichia coli （J01859）16S rDNA 核苷酸保守序列上的 8~27 位和
1525~1541 位。
PCR 反应体系为 50μl， 其中 10×PCR buffer （含有 MgCl2 20mmol/L）5μl，2.5mmol/L dNTP 1μl， 基因组
DNA 模板 0.2μl，20μmoL/l 的引物分别 2μl，Taq DNA 聚合酶 0.5μl，去离子水 39.3μl。
PCR 扩增条件为 94℃ 5min；94℃ 1min，55℃ 45s，72℃ 1.5min，30 个循环；72℃ 10min
扩增的 PCR 产物在 1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳分离后，采用 DNA 凝胶回收试剂盒进行回收纯化，
将纯化的 PCR 产物与载体 pMD-18T 连接后转化 DH5a 进行克隆。
1.6 阳性克隆的筛选
将转化后的 DH5a 菌落接种于含氨苄青霉素 （100mg/L），X-gal（40mg/L）和 IPTG（24mg/L）的 LB 平板
中。 挑取白色菌落，将其扩大培养后用碱裂解法小量快速提取质粒 DNA。 将提取的质粒 DNA 为模板进行
PCR 扩增，1%琼脂糖凝胶电泳检测重组阳性质粒。同时将质粒 DNA 以 BamH I，HindⅢ酶切，进一步验证克
隆结果。
1.7 16SrRNA 的全序列测定
纯化后得到重组质粒 DNA，由北京三博公司进行全序列测定。
2 结果
2.1 菌株基因组 DNA 的提取
菌株的基因组 DNA 通过溶菌酶、蛋白酶 K 以及酚/氯仿/异戌醇抽提，用乙醇沉淀，得到了基因组 DNA
（图 1）。
汪长东等：一株耐盐细菌的 16S rRNA基因序列分析 165
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2008年第 6期
2.2 菌株 16S rRNA 基因序列的 PCR 扩增
以提取的基因组 DNA 为模板， 通过 PCR 反应扩增菌株的 16S rRNA 基因序列。 扩增的 PCR 产物在
1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳分离后，其电泳结果图 2。 菌株 16S rDNA 基因序列经过 PCR 扩增后，有一
条大约 1 500bp 左右的核苷酸片断被扩增出。
图 1 基因组 DNA 提取结果 图 2 菌株 16S rRNA 基因序列的 PCR 扩增结果
2.3 菌株的 16S rRNA 基因全序列测定
将扩增的 PCR 产物在 1.0%的琼脂糖凝胶上进行电泳分离后， 采用 DNA 凝胶回收试剂盒进行回收纯
化，将纯化的 PCR 产物与载体 pMD-18T 连接后转化 E.coli bl21 进行克隆，经过筛选后将有 16S rRNA 基因
序列插入的质粒提取测序。 Bankit1053279 的 16SRNA 的基因序列被测定后，将该数据提交 GenBank（注册
号为 EB382221），测序结果如下所示。
166
2008年第 6期
3 讨论
对这株细菌的反复研究表明 ， 该菌为硬壁菌门 、 杆状和葡萄球菌 ， 并且与表皮葡萄球菌 RP62A
（NC002976.3）有 99%的相似性。
普通的耐盐细菌如 Dh5a 只能在 0.5％~5％NaCl 中生长，但是该菌株却可以在 0.5％~10％NaCl 生长。耐
盐微生物是极其宝贵的基因资源，同时也是研究生物进化和生物多样性的重要材料。
微生物的次级代谢产物被认为是化合物合成的主要来源 [7]，耐盐微生物更是被人们用来合成多种化合
物。例如，某些耐盐微生物可以在细胞内积累相容性溶质来抵抗细胞外的高渗透压，如多经基化合物、甜菜
碱、2-甲基-4-梭基-3，4，5，6-四氢嘧啶等 [8]。 耐盐菌在环境治理中也有很重要的应用，如在石油的生物除污
和空气污染的治理中都有很好的应用 [9]。
这项研究对菌株的 16S rRNA 基因全序列进行了测定， 这对今后的工作具有重要的理论和现实意义。
例如，可以通过构建真核表达载体，基因枪转入植物的胚乳细胞中，就可以获得相应的耐盐植株。
参考文献
1 TM Caton，LR Witte，HD Ngyuen. Microbial Ecology，2004，（48）：449~462.
2 Tina Kogej，Jose Ramos，Plemenitas. Applied and Environmental Microbiology，2005，71：6600~6605.
3 周旭华，王勇，吴敏. 浙江大学学报（理学版），2007，34（3）：335~339.
4 贺江舟，张莉利，王建明，等. 塔里木大学学报，2007，19（2）：53~57.
5 任培根，周培瑾.微生物学报，2003，43（3）：427~431.
6 吕爱军，王秀琴，温洪宇，等. 淮北煤炭师范学院学报，2004，25（1）：47~49.
7 De la Rosa-Garcia SC，Munoz-Garcia AA，Barahona-Pe ez LF. Applied Microbiology，2007，45：289~294.
8 隋海澜，郎亚军，刘稳结.大连轻工业学院学报，2007，26（3）：199~201.
9 Asad S，Amoozegar MA，Pourbabaee AA. Bioresource Technology，2007，98：2082~2088.
汪长东等：一株耐盐细菌的 16S rRNA基因序列分析
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
应广大作者读者的要求，为适应科技期刊改革发展的需要，加强国内外生物技术信息交流提供良好的
渠道，更好地为生物技术领域的科研人员服务，经上级新闻出版管理部门批准，自 2009 年 1 月起，《生物技
术通报》将由原来的双月刊改为月刊，页码增加至 128 页，每月 26 日出版。 每期定价 25 元，全年 300 元。
欢迎新老作者踊跃投稿！ 欢迎新老读者订阅！
《生物技术通报》编辑部
2008 年 8 月
重 要 启 事
167