全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 2期
番茄叶片 GDP甘露糖焦磷酸化酶基因
表达载体的构建与转化
吴海琴 赵瑛 符庆功 王华森
(浙江林学院农业与食品科学学院,临安 311300)
摘 要: GDP甘露糖焦磷酸化酶 ( GMPase, EC 2 7 722)是维生素 C合成途径的第一步关键酶。通过 RTPCR扩增到
1498 bp的 GMPase全长序列, G enBank登录号为 DQ449030。利用克隆到的基因分别构建得到正义及反义植物表达载体。并
将其克隆至 PBI121真核表达载体, 转化农杆菌 LBA4404,利用农杆菌介导法转化烟草植株,经基因组 PCR及琼脂糖凝胶电泳
检测, 结果表明 GMPase真核表达载体构建成功,并成功获得转基因植株。
关键词: 番茄 GDP甘露糖焦磷酸化酶基因 ( GM Pase) A sA 表达载体
Construction ofGDPmannose Pyrophosphorylase
Gene Expression Vector andW estern Blotting
WuH a iqin Zhao Y ing Fu Q inggong W angH uasen
(H angzhou Depar tment of H orticulture, School of Agricultura and Food Science, Zhejiang Forestry University, L inan 311300)
Abstrac:t GDPm annose pyropho spho ry lase ( GMPase, EC 27 7 22) can ca talyse the syn thesis of GDPDm annose and repre
sents the first comm itted step in the fo rm ation of a ll guano sinconta in ing sugar nucleo tides found in p lants w hich a re precursors for the
syn thesis o f LascorbateA fullleng th cDNA encoding GMPase from Ly cop ersicon esculentum w as iso lated us ing a RTPCRT ransgen ic
tobacco plants were generated in w hich the fragm ents of tom ato GDPmannose pyrophosphory lase gene(GMP ase ) cDNA w as introduced
in antisense orien tation to the 35S prom oter
Key words: Toma to GDPm annose pyropho spho ry lase AsA Expression vector
收稿日期: 20091210
作者简介:吴海琴,女,研究方向:蔬菜生理与分子生物学; Em ai:l yuand ianste@f 163 com
通讯作者:王华森, Em ai:l w anghuasen666@ tom com
维生素 C又称抗坏血酸 ( AsA, ) ,是维持机体生
理机能的重要维生素之一, A sA在动植物中具有重
要的抗氧化功能和代谢功能,但人类自身缺乏合成
A sA能力, 新鲜的蔬菜水果是人类饮食中主要的
A sA源 [ 1]。抗坏血酸是一种普遍存在于植物组织
的高丰度小分子抗氧化物质 [ 24] , 它可以直接与单
线态氧 ( O21 )、超氧自由基 ( O 2 )、过氧化氢 ( H2O 2 )
和羟自由基 (HO - )等活性氧反应, 因此在植物抵抗
氧化胁迫中具有重要作用 [ 5]。
GDP甘露糖焦磷酸化酶 ( GMPase)是 AsA合成
途径的第一个关键酶 [ 6] ,其催化所得产物 GDP甘露
糖也用于细胞壁碳水化合物的合成和蛋白糖基化。
本研究利用从番茄中克隆到的 GMPase基因分别成
功构建了番茄 GMPase基因的正、反义植物表达载
体, 并通过农杆菌介导法获得了转基因烟草植株,为
进一步研究 A sA对植物生理作用的分子机制打下
了基础。
1 材料和方法
11 材料
111 植物材料 料番茄 (Lycopersicon esculentum )
品种为中蔬 4号,盆栽培养 3月后进行处理。
112 细菌菌株与质粒载体 本研究所用的大肠
杆菌菌株为 E co l i DH5, 农杆菌菌株为 LBA 4404,
克隆载体为 PMD18T V ector, 表达载体为改造过的
2010年第 2期 吴海琴等 :番茄叶片 GDP甘露糖焦磷酸化酶基因表达载体的构建与转化
pB I121V ector。
113 工具酶及生化试剂 限制性内切酶、Taq
DNA聚合酶及胶回收试剂盒购自天为时代生物公
司。 IPTG、DNA M aker DL2000和 T4DNA连接酶等
均为大连宝生物公司产品。 PCR引物由大连宝生
物公司或上海生物工程公司合成。
12 番茄叶片 GDP甘露糖焦磷酸化酶基因植物表
达载体的构建
121 表达载体引物设计 根据测序结果得到的
GMPase基因序列上的酶切位点和载体上的酶切位
点,设计了不带酶切位点的正义扩增引物和 5 端含
Sac I酶切位点的反义扩增引物,由上海博雅生物工
程公司合成。
正义序列扩增的上游引物: 5 GAGGCGACG
CAGTGCAGCTT3 ; 下游引物为: 5 CGTAATCATGT
GAATGGTC3 ;
反义序列扩增的上游引物: 5 GCGAGCTCCAT
CAGATCGAGG3 ;下游引物: 5 TGGATGGACATCG
GACA3 ,
122 PCR扩增目的片段 以稀释 5 000倍的测
序质粒为模板, 采用 Taq DNA聚合酶进行 PCR扩
增。反应条件: 94! 预变性 5 m in, 94! 变性 50 s,
50! 复性 50 s, 72! 延伸 60 s, 35个循环, 最后一轮
72! 延伸 10 m in。PCR产物经 1%的琼脂糖凝胶电
泳后, 切下目的条带, 用胶回收试剂盒回收。
123 表达载体的构建 分别经限制性内切酶
X ba I+ Sal I和 Sac I + BamH I消化后的正义和反
义 PCR回收产物, 从胶中回收目的片段; pB I121
质粒也分别用 X ba I+ Sa l I和 Sac I + BamH I酶酶
切, 电泳回收大片段, 回收的目的片段进行定向连
接。连接产物转化到感受态大肠杆菌 Ecoli
DH5中,在含有 100 g /mL卡那霉素的 LB平板
上筛选阳性菌落, 碱法提取质粒。分别采用 X ba I
+ Sal I和 Sac I + BamH I双酶切的方法, 判断插
人正义和反义片段的正确性并设置非酶切的质粒
对照。
2 结果分析
21 植物表达载体的构建
以稀释 5 000倍的 GMPase测序质粒为模板, 用
正义和反义序列的扩增引物分别扩增到 1条约
图 1 正义真核表达载体构建示意图
1 408 bp和 1条约 560 bp的片段, 与设计结果相符
(图 2)。反义序列的 PCR纯化产物经 Sac I+ BamH
I双酶切后,插人到经 Sac I + BamH I双酶切的改
造过的 pB I121载体上, 构建成为反义植物表达载
体, 定名为 PB IGMP(图 2A )。正义序列的 PCR纯
化产物经 Xba I+ Sal I双酶切后, 插人到经 Xba I+
Sal I双酶切的 pB I121载体上, 构建成为正义植物
表达载体,定名为 PB IGMP(图 2C )。
对重组质粒反义和正义表达载体 PB IGMP
( - )和 PB I- GMP ( + )分别用 Sac I + BamH I和
Xba I+ Sal I双酶切进行酶切鉴定, 重组质粒的酶切
产物电泳谱带与预期大小一致, 表明反义表达载体
PB IGMP( - ) (图 2B)和 PBIGMP( + )构建的正确
性 (图 2D)。
图 2 GMPase基因真核表达载体
PBIGMP( - )和 PBIGMP( + )的构建
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生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 2期
22 番茄叶片 GDP甘露糖焦磷酸化酶基因转化烟
草及转基因植株的分子检测
将构建好的反义表达载体转化农杆菌, 通过农
杆菌介导,叶盘法转化烟草,获得了大量的转基因植
株。为了检测转基因是否成功,提取表现卡那霉素
抗性的 5株转基因烟草和一株野生型烟草植株的基
因组 DNA作为模板,通过 PCR反应进行检测。有 4
株扩增出目的带 (图 3)。在转基因烟草中,我们发
现所有株系叶片变薄, 变小, 节间长明显变长, 且出
现早花和早衰的现象。
MM arker; CK野生型烟草; 1, 2, 35转基因烟草
图 3 转基因烟草的 PCR验证
3 讨论
抗坏血酸 ( Lascorbic ac id, AsA ) ,是植物和大多
数动物体内合成的一类含量丰富的己糖内酯化合
物。由于人类缺乏其合成关键酶 ∀ 古洛糖内酯氧化
( Lgulono lactone ox idase, GLO )而只能从食物中
获取 AsA,因此 A sA含量已成为衡量农产品品质的
重要指标 [ 1, 3]。植物中 AsA的重要性不仅在于它为
不能合成 AsA的少数动物 (包括人类 )提供丰富的
维生素 C源; 而且近年来的研究发现, A sA对于植
物自身的抗氧化和清除自由基、光合作用和光保护、
细胞的生长和分裂以及一些重要次生代谢物和乙烯
的合成等诸多方面起着非常重要的生理功能。迄今
对高等植物的研究表明, 虽然可能还有其他共存的
合成途径 [ 7] , 但 AsA合成主要是通过 D葡萄糖 6
磷酸# D果糖6磷酸 # D甘露糖6磷酸 # D甘露
糖 1磷酸 # GDPD甘露糖 # GDPL半乳糖 # L半
乳糖1磷酸 # L半乳糖 # L半乳糖内酯 # AsA [ 8 ]。
在该途径中, GM Pase是 A sA合成途径的第一步限
速酶, 起着非常关键的作用 [ 9]。
国内外关于 GMPase基因的研究不少,人们已从
烟草、马铃薯、拟南芥、玉米中克隆了 GMPase基因,
Tabata等 [ 13 ]指出通过外源调节烟草 AsA含量可以明
显抑制 GMPase基因在 mRNA上的表达, Conklin
等 [ 10]研究表明转反义 GMPase基因的拟南芥 AsA含
量为对照的 30% - 40%; Keller等 [ 11]获得了转反义
GMPase基因的马铃薯,发现转基因植株 AsA含量比
对照下降且有早衰现象。Zou等 [ 12]虽克隆到了番茄
GMPase基因,但仅对其进行了序列分析和定位,还未
做进一步的研究。为了对番茄 GMPase的性质和功
能进行研究,首先必须获得一定数量的转基因植株,
因此本试验构建了番茄 GMPase基因的真核表达载
体,获得了转反义 GMPase基因的烟草植株,并对转
基因植株和野生植株进行了基因组 PCR鉴定,表明
获得了转反义 GMPase基因的烟草植株,为今后进一
步在体外研究 GMPase的性质和功能等打下了基础。
参 考 文 献
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(下转 177页 )
156
2010年第 2期 薛龙吟等:黑曲霉脂肪酶盖子结构域突变对其活性的影响
突变对重组脂肪酶活性有轻微影响; 而换盖和 S84G
对重组脂肪酶活性有严重影响,直接导致重组脂肪
酶完全丧失活性 (图 4B )。
图 4 脂肪酶突变体活性的定性检测 ( A)
和定量检测 ( B)
3 结论与讨论
本研究通过构建一系列黑曲霉脂肪酶盖子结构
域发生突变的脂肪酶基因突变体, 以期获得不依赖
油水界面激活的脂肪酶突变体。通过试验获得了两
个具有活性的突变体,但还有待进一步纯化并测定其
在油水界面的催化动力学,以判断其盖子结构是否处
于一种开盖状态; 对没有表现出活性的脂肪酶突变
体,还有待进一步深入分析突变失活的具体原因。
参 考 文 献
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