全 文 ：生物杖术通银
研 究报告 刀云口T E乙阴叭儿刀心 Y B U L L E TI W 2(X 刃 年 增 刊
细胞外酶 M nP 降解聚乙烯的分子动力学研究
姚 学峰 宋怡铃
(北京航空航天大学生物与医学工程学院 ,北京 10 191 )
摘 要: M np 醉 (~ 乡田 es e Pe m 范d e) 已被鉴定为降解聚乙烯的关健阵 , 通过设计不同长度的破健泉乙蹄蜡为实脸底
物 ,分别与拟肠P 结合分析采用 Au to do ck 分子对接软件进行结合能的预浏并用 G ro ma c:软件模拟了水 离子环境下,底物复
合物能黄 空间构象的变化等情况研究结果表明M 卫IP 踌只能催化 C 56 以下的聚乙蜂蜡 ,随着破桩长度的增加醉与底物结合
越不德定;能贵分析表明随着破健长度的粉加 ,其动能逐渐降低 ,而总能童亦有降低的趁势
关拍词: 住过氧化物阵 泉乙烯降解 分子动力学 结合能 生物降解
M olecul a r D o cki n g a n d D y n a m ic S ti m ul ati o n o f E x tra eellu la r
M anganese Pe rox idas e fo r P oly eth ylene of B iod egradtion
Y ao X u efe ng S o ng Y iln g
份扣扣止of B切闷盯 及Me 面以 召呼ne eri咯 Be i肠堵刀成e好,Be 乒咭 10 191)
A bstra ot : M nP 15 1山n比ed as 0 key enZy m e in biode尹 ds tion of po ly eth yl ene.A uth or desi笋 di玉re nt e七七n length of PE wax
as subs 以 e fo r enZy lle. U 蛀ng so 俪 二 of auto do ek Pre di eo bin din g ene卿 , th e res 曰ts demo ns 比tes tha t M nP can just catal yZ e e赴七on
lengt h o咖 in ran 沙 nuzn ber of 56.M olecuar stn 以匕tion 15 ak o eo ed on com Pex an 习州s, th e res ul ts de m ons tra te ki netic energy w il
创 o fF w hen earb on num ber 面 se , an d the to 回 energy has th e sazn e 吮 n d exeeP t C 49 .
KeyW Ord s: M 扣1脚 es e pero 范d e Po ly eth ylene de, ds tion M olec ar so m 巨don Bin di ng ene卿 Biod e, ds tion
聚乙烯是一高分子类化合物 , 分子量较大 ,而
且疏水性强 ,表面能较大川他们之所以不容易在
自然界中降解 , 是因为它不可以自由进入细胞膜
内 ,并且一般的塑料制品都含有稳定剂以防止被自
然氧化 即使聚合物能进人胞内 ,但由于其疏水性
强 ,因此生物体内酶很难对它起作用
口 卜 . 口 , 留 卜
圈 1 橄生物降解. 乙姆的假设徽型12
低分子量化合物通过非生物氧化过程形成放
基末端化合物(1);低分子量化合物仍然太大而不
能通过细胞壁(2);进能通过细胞外酶结合 (3 );或
通过与细胞壁上的酶结合(4 );经过进一步氧化 ,一
些酶间接地增强分子扩散性 (5 );生物活性剂(6 );
细胞壁表面确保分子粘附着细胞 ,并且让小分子水
进人可溶性不强的聚乙烯氧化产物 ,以促使其通过
细胞壁障碍 (7);及 通过酶的转移 (8 );在细胞质膜
内(9 );或最终转移至细胞外周质(10 );氧化产物很
有可能分子以其极限小的大小被转移(11);最终完
全通过细胞质膜进入 Bet a 氧化途径
但随着超长链聚乙烯蜡 (C40 以上 )被真菌降
解的报道出现 ,人们才相信在某种程度上微生物可
收稿日期二2(X 为一04 一27
基金项 目:国家 自然科学基金(207 7 (X 巧)
作者简介:姚学峰(19 84 一).男 ,硕士.研究方向:生物降解及分子模拟;E 一m l:6川@ 163 .co m
通讯作者:宋怡铃(1 % 5一) ,女 ,副教授.研究方向:徽生物和生物化学;E 一耐 l:yil n脚 n夕 , 田1.com
2仪为 年 增 刊 姚学峰等:细胞外酶 M nP 降解聚乙烯的分子动力学研究 357
以降解其类似物 :聚乙烯 如 Yam ad al 31等人发现
Pe ni eilium sim plieis imu m 真菌可以降解长链烷烃
和聚乙烯 , 0.1% 正烷烃 (碳链长 30 一40 间 )在两周
内就会被完全降解 逐渐地 ,国内外有很多关于细
菌 真菌 酵母降解聚乙烯的报道 他们分别用不同
的菌种对处理过的聚乙烯进行一系列降解实验 ,结
果证明这些微生物确实能够降解聚乙烯 ,但令人遗
憾的是 ,至今其降解分子机制仍不是很明确
其实 ,早在上个世纪 90 年代 , Pom eto t41 等人就
发现细胞外酶的降解作用 他们分别用 0.6% 的醉
母提取物培养 s. ba 成 5 252 , 5. , eton扛75V i2 , 5.
对为卿 川吕竹A 三种不同的微生物 , 48 一72 h 后收
集培养物 ,滤去培养物中的细菌 ,用该培养物与含
淀粉和氧化强化剂的聚乙烯培养三周 ,发现聚乙烯
分子量明显降低 人们纷纷猜测细胞外降解聚乙烯
的酶是什么 Te tsuy a [5] 等人又用木质素降解真菌
IZ U 一154 对尼龙 6 进行降解实验 , 发现加人锰盐
后 ,会加快降解速度 并指出 ,该真菌细胞外酶在降
解 中起关键作用 , 并要分离纯化该酶 次年 ,
u yo shi fel等人又进行了聚乙烯降解实验 ,证明该真
菌对聚乙烯也具有降解能力 , 并纯化得到 M nP 聚
乙烯降解酶
为了进一步研究 M nP 酶对聚乙烯降解的分子
机制 ,作者设计了不同碳链长度的低分子量聚乙烯
作为底物进行动力学模拟研究
, 材料和方法
1.1 材料
M np 晶体文 件 lm np 由 R CSB DA TA BA N K
(h ttP :/l ~ .冈b.org ) 获得 [7. S] 低分子量聚乙烯由
M O E (M of eed ar o perat ion Envio nm ent)商业软件设
计 A uto doc k 4.0 由美国 M olec ular G ran hi es U bo -
ra t衅 (A ka o lso n 肠bo ra to叮) 提供 G ro m ac s 4 .0.2
soft Pa ck 由 st anfo rd wo rk sh叩 提供 计算机群系由
北航生物与医学工程学院 H em od yna m iC lab 提供
1.2 方 法
1.2.1 酶与底物对接 用 M OE (M oleeul ar o 碑ra-
tion Env iro nm ent)对 M nP 进行处理1.1,打开 M OE ,用
se qu en ce ed ito r 删除水分子以及其他不需要研究的
杂原子 对聚乙烯蜡(C4() C科 C46 C49 C54 C56
C59 C63 C69 C74 )进行处理 ,打开 PR OD R G Z 服务
器110) ,用记事本打开底物的 PD B 文件 ,粘贴其到服
务 器 空 白 窗 口 , Chira lity 为 Y E S , Full charg es 为
N O , E ne rgy mi ni m izati on 为 YE S 得到处理而且含有
极性键的 PD B 文件 ,作为 A ul o doc k 配体输人文件
l苗1
当酶与配体文件准备就绪时 , 用 A ul od oc k 4.0
分别打开 M nP 以及配体文件 先对 M nP 进行去氢
键加极性氢键处理并保存为 PD B 文件
先进行 A uto G rid 计算 , G rid bo x 放置在蛋白大
分子中心 ,大小为 0. 7 ,其他皆采用其默认选项 ,保
存 解 后缀文件 计算完毕后 , 进行 A ut o D oc k 计
算 , DO C K 参数皆采用其默认值 ,采用 LGA 算法 ,保
存为 d讨文件
在 A nal yze 工具栏下打开 dpf 文件 ,并在 nfi 卜
m at in ns 选项下选择 Pa y , Aut o doc k 界面会演示是个
不同的底物与酶结合的构象 ,它们皆以结合能高低
排序 , 选择其一接近酶催化中心的底物构象作分
析 ,并保存其为 PD B 文件
由 A uto dock 计算所得的底物构象 PD B 文件 ,
用记事本打开 ,将其粘贴到 PR O D R GZ 服务器处理
l,,], hi司ity 为 Y E s , Fu ll eha飞es 为 Y ES , E ne卿
m inim izat ion 为 N O 按 R U N 按 钮 , 得到含底物的
D R G P O H .PD B 和 D R G G M X .TP
运行 e M x 4.0 , 用 冈bZgmx 处理 lm np.pdb ,得
到 ne w. Pd b , 将 D R G PO H 用记事本打开并粘贴至
ne w. 冈b 末尾处 并修改拓扑文件 ,打开生成的TO P
文件 ,在力场 itp 行下新增一行说明 ,衍nc lud e drg.
itp ,并在[m ol eeul es]下加 d飞和数字 l ,关闭保存
1.2.2 M D Stim ulation 利 用 脚 m aes 4.0.2 , 采用
G RO M A CS fG43al 力场和 SPC /E 充 分含水模型19]
具体步骤 : 选取立方体盒子 , 边界 d 值为 2. 0 nm ,
加人水分子 35 0 个 ,用 ge ni on 命令添加 509 个镁
离子以及 1XX 个抓离子
采用 st eeP 算法进行能量最小化 10 ps 平衡步
骤 ,温度时间藕合为 0.1 ps ,体系个原子初速度由
M ax w ellian 分布给出 ,温度为 3(X) K ,用 IJ N CS 算法
约束全键长l3, 41 ,远程静电相互作用采用 PM EI 2] ,
压力为 1个大气压 1.0 ,平衡时间为 10 ps 最后进
行 自由动力学模拟 ,时间为 20 ps ,体系个原子初
358 位物技术通稚召白tec hno助盯 B叫吸云如 2 X 珍年 增 刊
速度由 M ax we 山an 分布给出 ,温度为 30 K ,压力为
1个大气压 ,短程邻近截断半径为 I nm 每步时间
皆为为 0. (X) 2
2 结果和讨论
2.1 住过氧化物醉催化聚乙烯蜡
通过运行 A uto doc k 计算 ,发现其 C40 一C60 底
物与 M nP 结合能维持在较低的水平 底物位于血
红素侧面并靠近 M n 离子(表 1 ,图 1)
卜的山日姗响血to 认的自
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县 0 .匕 卜 J 油肺 r ~ 一 l e . 1
代! . . , 曰
O 见 1口 !习 刀J
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裹 , 低分子t . 乙姗与 M np 反应结合能
圈 3 不同碳服子橄的. 乙姆幼与资白结合时 , 班白
飞 如汤 场 to c. 娜恤
R es 川 ta C4 C49 C 54
B inding 27 .89 13.16 3 1.29
C5 6
5 95 0
C63
创双
C 69 C 74
163(X) 34 灾众阅
E ne粗口(kJ )
R ef- R M S 46 .14 4 5.4 1 45 .03 37 .07 38.93 38 .25 38.39
C 翻
一一 C翻
C 口
C M
六 日,
一面
压函弓 份 圈 4 不同曦旅子橄的. 乙拐. 与班白摘合时.C 一aI Ph a
R M S D (2加 PS
城
翻 二 二 岛 伪 目 翻 . 二 乞
圈 1 不同长度. 乙份 . 摘合能对傲曲经
双润心
图 3一图 7 分别给出了底物与酶结合后蛋白和
C一al仙a 的 R M SD (Th e 耐 m ean 叩 are deviat ion )
值的变化 C4 C49 C54RM SD 明显低于其他各配
体 , 这个结果 Auto doc k 分析结果一致 , 虽然 M nP
酶对底物催化的专一性很弱 ,但明显倾向于低分子
量短碳链底物 可能是由于碳链过长 ,酶的纵横向
不足以容纳更长的碳链 , 让长分子链末端暴落 ,从
而使落 t. * , :.
黝盖,
刃 .......~.. ...
幻 书 . , 压 5 日 口 协
圈 2 不同碳旅子傲的. 乙娜蜡对接后构象 R M S O
圈 5 不同碳旅子傲的. 乙姗绪与资白结合后其动
健 亦 妙 恰 为
p . 一 l它. 耳y
当线性碳链数增加 , n>54 时结合能达到 5950
kJ /mo l, 此时酶催化活性很低 , 基本不参与催化反
应 由图 2 可 以看 出 , 随着分 子链长度 增加
R ef- RM S 有逐渐降低的趋势 圈6 不同碳服子橄的. 乙始幼与班白结合后其势能
变化情况
2仪冷 年 增 刊 姚学峰等 :细胞外酶 M nP 降解聚乙烯的分子动力学研究 359
丫加l 盆. 招 ,
一
圈 7 不同碳旅子傲的. 乙份蜡与l 白结合后其总能
一变化情况
从能量分析的角度来看 ,其动力学能盘随着碳
链长度增加而降低 , 而势能有着相反的趋势 (C49
除外) ,而总能量也有逐渐降低的趋势 (C49 除外)
这与其结合空间的构象存在着很大的关系
3 结论
通过结合能的预测 , M nP 酶只能氧化低分子量
聚乙烯量(Cn<56) 由于 M nP 酶是细胞胞外酶 ,降
解聚乙烯过程中必然经历非生物氧化阶段 ,将大分
子链削断成 C56 以下长度的低分子量聚合物 在胞
外酶的进一步氧化的情况下 ,更短的分子链穿过细
胞壁进行 Beta 氧化和能量代谢过程 在真核生物
里 ,细胞膜的厚度一般仅为 7一 8 nm ,而聚乙烯碳原
子间长度为 0.15I nm ,当碳原子数为 54 ,低聚物长
度为 S lun ,刚好与细胞膜厚度相当 ,这正好是 M nP
能催化的极限长度 ,而该酶的空间构象也恰好可以
包裹 细胞壁厚度与 M nP 催化极限之间是否存在
联系 ,需要进行下一步研究证实
~ 回 面~ ,2加7 ,28 (5 ): 1 一1 68 .
Z K田tny M , 肠m苗re J, 刃地 lort AM . 肠e jou m a] of ohe~ pher ,
2侧万 ,麟 : 124 3~l 25 2.
3 Y 朗附da ~O 叭闭 e. K , M uk u口. t0 H , K油妞uyam y , et al . Th e
j皿门目 苗即留y口比朋d 而cIO b词 teC hno叨 .20 2 ,v 30 (6 ):27 :
828~83 1.
4 PO me o AL J 友 B , John的n KE , et al . Th o j二m al of 印户闭 an d
en 朽功n砚 ntaj 而汕 101叨 , 19 2 , 5 8(2): 73 1一733 .
5 介肠uya D. , M . . 阅 K 厂l泊翔 kin N .Th e j侧m 目of aP 户闭 an d
en板功~ ntaj 而c汕 101叨 , 19 7 .6 3 (1): 329一331.
6 U仰 hi Y .乳u扛目而 Y , Nishida T .Th e joujmal Of ja户川w加d 卜
~ h 吸 iety , 19 8 , 4 :2 2一229 .
7 G ra ef C V ~ 日即 NP E , Fe 朋tla K A . Th e j~ 以 of n洲 i司
cb e面.匀 ,2加5 , 48 (8): 27 25 一27 5 .
8 K u伴r l, W O叱 T . S , R .义泊加口O D , W 山阻朋s M ,et 目Th e jouj m al
儿讹对 ca of ehe而.匀 S沈iety , 2加7 , 129 (18): 5786州5787 .
9 YU Jia- Fe飞 , W A N G Ji 一H ua , D() U 兀朗名一H ua . J阅 m al of A to而 e
即 d M olec uar 外州cs (C肠nes ),2以犯, 25(4):834 一836.
10 ha d目旧 E , H es E , B , S降 van der D . Jou m al Of M olec ular
M 团eli ng , 2的 l , 7 : 3肠 ~3 17 .
1 W d 犯r w , H u ne汕曰乎r P . H , M cC ~ J. Jou 门目 of Pb 尹i耐
C h. istly B , 2仪X) , l以 (15):3肠8一3575.
12 D . 启en T , Y 诫 D , P目 ~ L . J侧 m al of 孙 ysi司 C he而 tIy ,
19 3 , 9 8: l阅 89~ 1(侧为2 .
13 E s ~ n U , L. 氏沈口 , 跳浅衅 itz M . L , D 明 Ien T. , et 习.Jou 门司
af Phy.i司 C he面 .匀 , 19 5 , 103 : 8577 一8592 .
14 H哪 B , B d山份 H , 压此ndse n H , F口画 e J. J二m al of
C OIn pu画 明司 C he而.勺 , 19 7 , 18: 146 3一1472 .
15 Sc huet el kopf W , van A 目te n D M F . A eta C 叭 团 傀 phica 址刃 ,
2 (X 抖 , 13 5 5 ~ 1 36 3 .
今考文献
Y 山唱Ju n , 黝叱 Yi 一U ng , 李n Xj 沙 Y即.几e j田川al 苗en 诚门n-