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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 7 期
木糖异构酶基因 xylA的克隆及其表达载体的构建
孙磊 张国军 闫爱玲 徐海英
(北京市农林科学院林业果树研究所，北京 100093)
摘 要: 木糖异构酶基因 xylA是一种正向选择标记基因，在植物基因工程中使用该标记可以获得安全的转基因植物。
构建了以 xylA基因为选择标记的植物表达载体。从大肠杆菌 Top10 中扩增出 xylA基因，插入到质粒 pCAMBIA2301 的 Xho I
位点，通过酶切和 PCR检测插入片段的正确性，得到载体 pCAMBIA2301-xylA，将 pBI121 载体上的‘35S-GUS-Nos’表达框插入
到 pCAMBIA2301-xylA的 EcoR I和 Hind III位点。得到中间载体 pCAMBIA2301-xylA-GUS，用 Sac I和 Sma I 切下克隆载体上
的 CBF1 基因替代 pCAMBIA2301-xylA-GUS中的 GUS片段，用电转化法将获得的表达载体转化到农杆菌中，为将来获得安全
的转基因抗寒植株奠定基础。
关键词: 木糖异构酶基因 标记基因 植物表达载体 克隆
Cloning of xylA Gene and Construction of Its Plant Expression Vector
Sun Lei Zhang Guojun Yan Ailing Xu Haiying
(Institute of Forestry and Pomology，Beijing Academy of Agricultural and Forestry Sciences，Beijing 100093)
Abstract: Xylose isomerase gene was the positive selective marker which can be used to obtain safe transgenic plants in the ge-
netic engineering． In this research，the XylA gene was amplified from the genomic DNA of Escherichia coli‘Top10’by using specific
primers containing Xho I enzyme site． XylA gene fragment which was inserted into the plasmid pCAMBIA2301 to substitute the nptII
gene，was identified by enzyme digestion and PCR，therefore，the pCAMBIA2301-xylA was obtained．‘35S-GUS-Nos’fragment was cut
from the vector pBI121 and linked to the EcoR I /Hind III sites of pCAMBIA2301-xylA to get pCAMBIA2301-xylA-GUS． CBF1 was then
cut by Sma I /Sac I form the cloning vector and cloned into pCAMBIA2301-xylA-GUS． Finally，the recombinant vector pCAMBIA2301-
xylA-CBF1 was successfully constructed and transformed into Agrobacterium tumefaciens‘EHA105’by electroporation． The following
research of genetic transformation could be done to obtain the cold tolerance transgenic plants with safe marker gene．
Key words: Xylose isomerase gene Marker gene Plant expression vector Cloning
收稿日期:2010-12-10
基金项目:现代农业产业技术体系建设专项资金项目(nycytx-30) ，北京市优秀人才培养资助项目(20104D002020000007)
作者简介:孙磊，男，助理研究员，研究方向:鲜食葡萄育种;E-mail:sunlei. bjfu@ gmail. com
通讯作者:徐海英，女，研究员，研究方向:鲜食葡萄资源与育种;E-mail:haiyinxu63@ sina. com
国际上从 20 世纪 80 年代开始植物基因工程的
研究，而从 90 年代才开始关注在转基因植物中普遍
使用的抗生素标记基因的安全性问题。近 20 多年
来，研究人员尝试使用了不同的策略去剔除标记基
因或使用安全标记基因［1 － 4］。糖类代谢酶标记基因
是一种无毒副作用的安全标记基因，主要有甘露糖
异构酶基因和木糖异构酶基因［5，6］，它们的特点是
使转化细胞获得特定的代谢优势，使之旺盛生长从
而达到筛选效果，其优点是无毒副作用，有利于转化
植株的再生，转化效率高。糖类代谢酶标记基因作
为一种正向选择标记，已经显示出了巨大的应用潜
力。本研究从大肠杆菌 Top10 中克隆 xylA 基因，并
构建以 xylA基因为选择标记，以 CBF1 转录因子为
目的基因的植物表达载体，转化到农杆菌中，旨在为
研究 xylA基因在植物遗传转化体系中的筛选效果，
以及 CBF1 基因对提高转化植株的抗寒性效果奠定
基础。
1 材料与方法
1. 1 材料
大肠杆菌 Top10 感受态细胞购自北京天根生物
生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
公司，农杆菌 EHA105、pCAMBIA2301 载体由本实
验室保存，pGEM-T easy载体购自 Promega公司、各
种限制性内切酶、T4连接酶、Taq DNA 聚合酶、抗
生素、DNA marker 均购自 TaKaRa 公司，引物由上
海生工公司合成，大肠杆菌基因组 DNA 提取试剂
盒、质粒提取试剂盒及凝胶回收试剂盒均购自 Ax-
ygen公司。
1. 2 方法
1. 2. 1 大肠杆菌基因组 DNA 的提取 大肠杆菌
Top10 菌株于 37℃振荡培养过夜，离心收集菌体，
DNA提取方法参照 Axygen公司细菌基因组 DNA提
取试剂盒说明书。
1. 2. 2 大肠杆菌 xylA 基因的克隆 根据 GenBank
中登录的 xylA 基因序列设计引物，并在上、下游引
物添加 Xho I 酶切位点。P1:5-CCCTCGAGATG-
GAGTTCAATATGCAAGC-3，P2:5-CCGCTCGAG-
TTATT-TGTCGAACAGATAATG-3。
以大肠杆菌 Top10 基因组 DNA为模板，使用高
保真 Taq酶扩增 xylA基因全长，反应条件为 95℃预
变性 4 min，95℃预变性 30 s，57℃退火30 s，72℃延
长 90 s，共 30 个循环;最后 72℃延长 7 min，4℃终止
反应。将 PCR产物连接到 pGEM-T easy 载体上，得
到质粒 T-xylA。重组质粒经酶切鉴定后送去测序，
将结果在 NCBI网站进行比对。
1. 2. 3 pCAMBIA2301-xylA 载体的构建 用 Xho I
分别酶切 pCAMBIA2301 和 T-xylA，回收 pCAM-
BIA2301 中的载体片段，回收 T-xylA 的小片段，用
T4 DNA连接酶连接。转化后挑单菌落提质粒，先用
Xho I酶切，初步检测 xylA是否插入，再用 PCR检测
插入片段的方向，所用的引物分别是 P1:5-CCCA-
GATAAGGGAATTAGGGTTC-3， P2: 5-CAA-GCG-
CAATGGCGGTGGCTATTT-3，扩增长度为 840 bp。
1. 2. 4 植物表达载体 pCAMBIA2301-xylA-CBF1 的
构建 用 EcoR I和 Hind III双酶切 pBI21 载体回收
‘35S-GUS-Nos’片段，连接到同样用 EcoR I 和 Hind
III双酶切 pCAMBIA2301-xylA的位点上，转化后挑单
菌落提质粒，酶切鉴定，得到中间载体 pCAMBIA2301-
xylA-GUS。用 Sac I和 Sma I双酶切质粒 pCB-CBF1，
回收目的基因 CBF1，连接到同样用 Sac I和 Sma I双
酶切 pCAMBIA2301-xylA-GUS的位点，转化后提质粒
酶切检测，得到植物表达载体 pCAMBIA2301-xylA-
CBF1。用电激法转化到农杆菌 EHA105 中，PCR 检
测 CBF1 基因的插入，引物分别是 P1:5-GCTTCGT-
CATCATCCTCTTC-3， P2: 5-TCAATGTGGGAAT-
CAGTCG-3，扩增长度为 780 bp。
2 结果
2. 1 xylA基因的克隆和鉴定
用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物，
得到长约 1. 3 kb 的片段(图 1) ，与预期大小一
致，用试剂盒回收纯化后连接到 pGEM-T easy 载
体上，转化大肠杆菌 Top10 感受态细胞，挑取单
菌落摇菌后提质粒，用 Xho I 酶切鉴定，选择能切
出 1. 3 kb 的重组质粒送去测序，结果表明该片段
长 1 330 bp，与 NCBI 上公布的 xylA 基因序列同
源性为 99%，表明所克隆片段正是大肠杆菌 xylA
基因。
M. TaKaRa DL2000 marker;1-3． xylA基因扩增片段;4．阴性对照
图 1 xylA基因片段的 PCR扩增
2. 2 pCAMBIA2301-xylA 载体和 pCAMBIA2301-
xylA-CBF1 重组载体的鉴定
根据 pCAMBIA2301 载体中 nptII 基因两端的
Xho I酶切位点设计引物扩增大肠杆菌 xylA全长序
列时，引入了 Xho I酶切位点，因此单酶切后可能以
正反两种方向插入载体，必须鉴定插入片段的方向。
首先酶切阳性克隆验证 xylA基因的插入，如图 2 所
示，泳道 1 和 2 是非重组子，泳道 3 － 6 是初步判断
有 xylA基因的插入。在载体上 35S 启动子内部设
计 1 个上游引物，在 xylA 基因内部设计一下游引
物，基因片段正向插入时可扩增出产物，反向插入时
则没有条带，图 3 显示的 PCR 检测结果，证明克隆
2、4 和 5 是正确的克隆。
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2011 年第 7 期 孙磊等:木糖异构酶基因 xylA的克隆及其表达载体的构建
M. TaKaRa DL15000 marker;1，2． 非重组子;3-6 初步判
断有 xylA基因片段插入
图 2 重组质粒 pCAMBIA2301-xylA的酶切检测
M． TaKaRa DL2000 marker;1，3． xylA 片段反向插入;2，
4，5． xylA 片段正向插入的重组质粒;6． 以质粒 pCAM-
BIA2301 为模板的对照
图 3 重组质粒 pCAMBIA2301-xylA正反向的 PCR检测
将 pCAMBIA2301-xylA 和 pBI21 分别用 EcoR I
和 Hind III双酶切，回收‘35S-GUS-Nos’小片段和载
体大片段，连接转化后挑取单菌落提质粒，用 EcoR I
和 Hind III双酶切可得到 2. 8 kb 的条带(图 4) ，用
Sac I和 Sma I双酶切可得到 1. 8 kb 的条带与 GUS
基因大小相符，说明‘35S-GUS-Nos’表达框已经插
入到 pCAMBIA2301-xylA 中，得到中间载体 pCAM-
BIA2301-xylA-GUS。
M. Cwbio DM10000 marker;1． Sac I和 Sma I酶切获得的
1． 8 kbGUS 片段;2． EcoR I 和 Hind III 酶切获得的 2． 8
kb‘35S-GUS-Nos’表达框片段
图 4 中间载体 pCAMBIA2301-xylA-GUS的酶切检测
用 Sac I和 Sma I 双酶切质粒 pCB-CBF1，回收
目的基因 CBF1，连接到同样用 Sac I 和 Sma I 双酶
切 pCAMBIA2301-xylA-GUS 的位点，挑单菌落提质
粒酶切检测，可得到 1. 2 kb CBF1 基因目的条带(图
5) ，上述结果说明 pCAMBIA2301-xylA-CBF1 表达载
体构建完成。用电转化法将构建好的载体转入农杆
菌 EHA105 中，用 CBF1 基因特异引物对阳性克隆
扩增，得到长约 850 bp 的特异性片段(图 6) ，说明
已经成功将载体导入到农杆菌中。
M. TaKaRa DL2000 marker;1． 重组质粒 pCAMBIA2-301-
xylA-CBF1 的酶切检测;2．非重组子
图 5 重组质粒 pCAMBIA2301-xylA-CBF1 的酶切检测
M． TaKaRa DL2000 marker;1，3，4． 成功转化的重组克
隆;2．未转化成功的克隆;5．以无菌水为模板的对照
图 6 重组载体 pCAMBIA2301-xylA-CBF1
转化农杆菌后的菌落 PCR检测
3 讨论
到目前为止，以糖类代谢酶基因为安全标记的
转化体系已经在白菜、洋葱、苹果等园艺作物中取得
成功［7 － 9］，使用该类正向选择标记，由于培养基中没
有抗生素对植物生长的抑制，转化效率更高，有利于
转化植株的生长发育。
澳大利亚 CAMBIA公司的 pCAMBIA 系列植物
表达载体在植物遗传转化中应用较多，其中 pCAM-
BIA2301 上的抗生素标记基因 nptII可以被 Xho I 切
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 7 期
掉，而且其上还有多克隆位点和报告基因 GUS，方
便引入其他目的基因。在构建 pCAMBIA2301-xylA
载体时，使用的单酶切策略，为了防止大片段自连，
需要对载体去磷酸化处理，从而在一定程度上降低
了连接效率，增加了筛选阳性克隆的工作量;另外，
在酶切过程中，质粒不纯导致的蛋白质、其他离子都
可能抑制酶的活性，本试验用进口 Axygen 质粒提取
试剂盒，获得的质粒纯度较高，酶切效果较好。在引
物合成时，为了避免两面的互补配对，所以两引物用
同样的酶切位点序列，而不是互补的序列，并且在两
端都加上保护性碱基，这样减少了 PCR 失败的
机率。
本试验构建了以 xylA 为选择标记，以 CBF1 转
录因子为目的基因的植物表达载体，转化到农杆菌
中，下一步是将其导入其他植物中使该基因表达，从
而为研究 xylA 基因在植物遗传转化体系中的筛选
效果，以及 CBF1 基因对提高转化植株的抗寒性奠
定了基础。
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠)
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