全 文 ：研究报告
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 3期
大肠杆菌腺苷脱氨酶基因的克隆表达
栾海涛 1 丁庆豹 1 欧伶 1 魏晓琨2 许彦梅 2
( 1华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海 200237; 2上海璞诚生物科技有限公司,上海 200235)
摘 要: 将大肠杆菌 K12菌株来源的腺苷脱氨酶基因 ( add )克隆到载体 pET28a中, 并转化至大肠杆菌 BL21( DE3)中
进行表达。通过 IPTG诱导 , SDSPAGE检测和酶活性的测定发现, 重组菌表达产生大量腺苷脱氨酶, 活性达到 51 07 U /m g蛋
白。通过酶性质的研究, 腺苷脱氨酶对腺苷最适 pH和温度分别为 75和 40 , 且在 40 下维持稳定。
关键词: 大肠杆菌 腺苷脱氨酶 基因工程
Cloning and Expression ofE. coli Adenosine Deam inase Gene
Luan H a itao
1
D ing Q ingbao
1
Ou L ing
1
W e iX iaokun
2
Xu Yanme i
2
(
1
S tateK ey Laboratory of B ioreactor Eng ineering, East China University of Science and T echnology,
Shanghai 200237;
2
Shanghai Pucheng B iotechnology Co. , Ltd, Shanghai 200235)
Abstrac:t The gene encod ing adenosine deam inase( add ) from E scherichia co li K12 w as c loned into expression vec to r pET28a
and transform ed into the stra in E. coli BL21( DE3) . The prote in was high ly expressed afte r the induction w ith IPTG, then w as analyzed
w ith SDSPAGE and confirm ed by the assay o f activ ity. The ac tiv ity o f adenosine deam inase expressed cou ld reached up to 51. 07 U /mg
prote in. The study o f character ization showed that adenosine deam inase had optim um pH 7. 5 and optim um tem pe rature a t 40 w ith
therma l stab ility at 40 .
Key words: Escher ichia coli Adenosine deam inase Gene eng inee ring
收稿日期: 20091110
作者简介:栾海涛,男,硕士,研究方向:生物化学与分子生物学; Em ai:l alan is lht@ hotm ai.l com
通讯作者:欧伶, Em ai:l b ioxian leid@ 163. com
腺苷脱氨酶 ( adenosine deam inase, ADA, EC
3544)是一种催化腺嘌呤核苷及其衍生物水解
脱氨的酶, 故又称为腺苷氨基水解酶 ( adenosine
am inohydro lase)。该酶普遍存在于各种生物体中,
腺苷脱氨酶参与细胞内嘌呤代谢。在该代谢体系中
腺苷脱氨酶分别将腺苷或 2!脱氧腺苷转化为次黄
嘌呤核苷或 2!脱氧次黄嘌呤核苷。次黄嘌呤核苷
进一步裂解生成次黄嘌呤。后者通过黄嘌呤氧化酶
转化为尿酸或者通过次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移
酶 (HGPRT)转化为单核苷酸进入嘌呤补偿途径 [ 1]。
腺苷脱氨酶是嘌呤代谢途径中的一种重要酶,
先天性腺苷脱氨酶的缺陷会导致重症联合免疫缺陷
疾病 ( SC ID) [ 2]。此外,贫血、各种淋巴瘤、白血球异
常及肺结核和脑膜炎等疾病都与 ADA的含量水平
有关,所以体内或组织中 ADA含量检测可以作为疾
病诊断的重要依据。
除了在医学方面的诊断应用,腺苷脱氨酶也广
泛用于核苷类化合物的合成。 Seela和 Ka iser[ 3]报
道了在磷酸缓冲液中 ADA可以将 2!, 3!二脱氧8
吖7脱氮杂腺苷转化为 2!, 3!二脱氧呋喃核糖苷。
Farina和 Ben ign i[ 4]在合成具有抗 H IV活性的化合
物双脱氧次黄嘌呤核苷 ( ddI)时, 利用 ADA从双脱
氧腺嘌呤核苷 ( ddA )的 、混合物中成功分离出
差向异构体, 该反应是利用 ADA只会大量水解
差向异构体, 而剩下未反应的 差向异构体。
M inato和 N akan ish i等 [ 5]利用腺苷脱氨酶将 6氯嘌
呤核苷水解脱氯生成次黄嘌呤核苷, 这表明该酶既
可以催化脱氨反应又可以催化脱氯反应。
然而, 用野生型菌株或从组织中提取法来获取
腺苷脱氨酶的成本及效率都不是很理想,研究利用
基因工程方法, 将腺苷脱氨酶基因 ( add )克隆到大
肠杆菌 BL21( DE3)中,诱导大量表达生产出腺苷脱
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氨酶, 用以进行后续核苷化合物的合成。
1 材料和方法
11 供试材料
111 菌种和质粒 pMD18T 载体购自 TaKaR a
生物技术公司, 表达载体 pET28aDNA以及宿主菌
大肠杆菌 BL21 ( DE3 )购自 N ovagen, 大肠杆菌
JM 109为本实验室保存。
112 培养基 大肠杆菌均在 37 下 LB培养基
培养。 LB培养基配方: 10% 蛋白胨, 5% 酵母膏,
10%氯化钠。培养基中抗生素终浓度: 羧苄青霉素
100 g /mL, 卡那霉素 50 g /mL。 IPTG 终浓度
05mmo l /L。试验所用到的缓冲液的配置及基本
试验操作参照文献 [ 6]进行。
113 仪器 TechneTC412PCR仪, DYCP31水平
电泳槽, DYCZ24D垂直板电泳槽, 752紫外光栅分
光光度计, DYCZ24D电泳仪, GL312UV检测仪,
JY92∀超声破碎仪 。
114 试剂 DNA聚合酶、dNTP、限制性内切酶、
T4连接酶购自 TaKaRa生物技术公司, DNA回收试
剂盒及感受态细胞制备试剂均购自上海捷瑞生物技
术公司。其它试剂均为国产分析纯。
12 重组 DNA构建
大肠杆菌腺苷脱氨酶基因 ( add )序列参见 Gen
Bank(登录号: M 59033. 1) [ 7]。按文献 [ 6]方法提取
E. coli K12的基因组, 以其作为模板,设计 5!端引物
CCCATGGGCATGATTGATACCAC, 3!端引物 GCG
GATCCTTACTTCGCGGC,进行 PCR扩增, 下划线处
分别为 N co#和 BamH#的酶切位点。扩增条件如
下: 95 预变性 5 m in, 94 变性 30 s, 55 退火 1
m in, 72 延伸 1 m in,共 30个循环, 最后 72 延伸
10 m in。回收目的条带与 pMD18T克隆载体连接,
转化至大肠杆菌 JM 109感受态细胞,涂布于含羧苄
青霉素的 LB平板上, 过夜培养。挑选单克隆, 提取
质粒,进行限制性内切酶分析鉴定后并进行 DNA序
列测定。
选取阳性结果将 add从克隆载体亚克隆入表达
载体 pET28a, 转化至大肠杆菌 BL21 ( DE3(感受态
细胞, 涂布至含卡那霉素的 LB平板上, 过夜培养。
挑选单克隆,提取质粒,进行限制性酶切分析, 筛选
出阳性结果。流程如图 1。DNA测序由上海美季生
物技术有限公司完成。
图 1 重组 DNA构建示意图
13 add的表达及 SDSPAGE检测
将带有 add的 pET28a质粒转化到大肠杆菌
BL21( DE3)后,挑取单菌落,提取质粒,进行限制性酶
切分析鉴定其正确性。选取阳性结果接种于含有卡
那霉素的 LB培养基中, 37 振荡过夜,接种至二级瓶,
当 OD600 = 05时加入 IPTG在 18 下诱导表达 8 h。培
养结束后,发酵液于 6 000 r/m in离心 20 m in收集菌
体, 50mmo l/L TrisHC l( pH75)缓冲液重悬,在冰水浴
中超声破碎处理, 90次 ∃ 3 s, 100W, 12 000 r /m in离心
5m in收集上清。用 2倍电泳上样缓冲液处理上清,考
马斯亮蓝 G250染色,沸水浴5m in。所用电泳凝胶浓
度为浓缩胶 5%,分离胶 12%。
14 蛋白含量测定
参照 B radford的考马斯亮蓝 G250法测定粗酶
液中蛋白含量 [ 8]。
15 腺苷脱氨酶酶活测定
按 13方法获得上清液作为粗酶液, 按照 K al
ckar法测定酶活性 [ 9]。腺苷在腺苷脱氨酶的作用
下转化为次黄嘌呤核苷,而在 265 nm下,腺苷和次
黄嘌呤苷的紫外吸收相差极大, 后者仅为前者的
40% ,故可以吸光度的差值计算酶活。 3mL反应液
( 05 mM 腺苷, 50 mM TrisHC l pH 75, 粗酶液若
干 )于 37 水浴反应 10 m in, 加入 3 mL的 1 mo l/L
HC l终止反应, 测定 265 nm光吸收。酶活单位定
义: 在上述条件下, 每分钟 265 nm 光吸收每变化
0001定义为一个酶活单位 (U )。
16 腺苷脱氨酶酶学性质研究
通过在不同温度及 pH条件下粗酶液与腺苷的
反应进程得出该酶的最适温度及 pH,温度控制范围
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2010年第 3期 栾海涛等 :大肠杆菌腺苷脱氨酶基因的克隆表达
20- 60 、pH控制范围 44- 100。以及通过在不
同温度下先对粗酶液进行不同时间预热来研究腺苷
脱氨酶的热稳定性, 温度分别从 40- 70 , 时间为
20- 60 m in。
2 结果
21 add PCR扩增及重组 DNA的构建
目的基因 add进行 PCR扩增, 得到 1 kb左右的
条带, 如图 2A 。重组载体 pMD18Tadd进行 N co
#和 BamH #双酶切分析鉴定, 琼脂糖电泳结果如
图 2B, 在 10 00 bp及 2 500 bp左右处分别有两条条
带,分别对应 pMD18T载体与 add基因的大小。重
组载体 pET28aadd进行 N co#和 BamH #双酶切
分析鉴定结果,如图 2C,在 1 000 bp及 5 000 bp左
右处分别有两条条带, 分别对应 pET28a载体与
add的大小,后续的质粒序列测定与 G enB ank中一
致,证明 add成功克隆。
A. addPCR鉴定结果; B. pMD18Tadd鉴定结果; C. pET28aadd鉴定
结果
图 2 add PCR扩增及 DAN重组载体构建的检测结果
2. 2 SDSPAGE检测 add的表达
培养并诱导含 pET28aadd的重组 E. coli BL21
( DE3)菌株, SDSPAGE结果如图 3。细胞在加入
IPTG诱导前后有明显差异,破碎后的细胞电泳结果
有大约 36 kD的蛋白带产生,与文献 [ 10 ]报道一致。
1. IPTG诱导前未经破碎的总细胞; 2.经 IPTG诱导后未经破碎
的总细胞; 3.破碎后上清; 4.破碎后沉淀
图 3 pET28aadd载体 BL21(DE3)
宿主菌的蛋白表达结果
2. 3 腺苷脱氨酶的酶活测定
按 1. 5方法测定腺苷脱氨酶的活性,以 pET28a
空载质粒的宿主菌作为对比, 含 pET28aadd的重组
E. coli BL21( DE3)菌的腺苷脱氨酶活力为 5107 U /
mg,而 pET28a空载质粒的宿主菌表达所得腺苷脱氨
酶活力仅 276U /mg,前者比后者提高 18倍。
24 腺苷脱氨酶性质研究
241 pH对腺苷脱氨酶活性的影响 腺苷脱氨酶
进行脱氨反应时的最适 pH为 75(图 4), 腺苷脱氨
酶受 pH影响较为剧烈,当 pH小于 50或大于 100
时,酶活性几乎损失殆尽。
图 4 pH对腺苷脱氨酶活力的影响
242 温度对腺苷脱氨酶活性的影响 腺苷脱氨酶
进行脱氨反应时的最适温度为 40 (图 5),当温度高
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于 60 时,酶活性损失 90%以上。图 6显示了腺苷
脱氨酶在不同时间、不同温度下的热稳定性, 40 可
以作为酶催化一般反应的最适温度,因为在该温度下
酶活力没有收到影响,而高于 40 的温度都会使酶
活损失。
图 5 温度对腺苷脱氨酶活力的影响
图 6 腺苷脱氨酶的热稳定性
3 讨论
本研究选取从大肠杆菌 K12菌株的基因组中克
隆 add基因,利用原核表达载体 pET28a的强启动子
T7配合宿主菌进行诱导表达, 使重组菌中目的蛋白
大量表达。此外由于外源基因也是来自大肠杆菌,有
较好的同源性, 故可溶性表达蛋白有较高的活力, 达
到 5107U /mg,比原始出发菌株提高了近 18倍。
重组表达的腺苷脱氨酶的最适 pH75,与人体和
小鸡肝脏中提取的 ADA的最适 pH一致。而酵母和
大鼠中腺苷脱氨酶的最适 pH则为 70[ 11, 12]。重组表
达腺苷脱氨酶最适温度是 40 , 比骆驼肌肉中的腺
苷脱氨酶略低 ( 50 ) [ 13]。该腺苷脱氨酶在 70 下处
理 20m in几乎丧失所有活力, 热稳定性与从组织中
提取的腺苷脱氨酶相似。
在大肠杆菌中,通过基因工程技术将 add基因成功构
建至表达载体 pET28a质粒上,并高效表达出有活性
的腺苷脱氨酶,且酶学性质在一般条件下稳定, 为后
续核苷化合物的合成奠定了良好基础。
参 考 文献
[ 1] M uchPetersen A. M etabol ism of Nucleot ides and Nucleobases inM i
croorgan ism s[M ]. New York: A cadem ic Press, 1983.
[ 2] Andreasyan NA, H airapetyan HL, et a.l ADA2 isoform of adenos ine
deam inase from p leu ral flu id. FEBS L ett, 2005, 579: 643647.
[ 3 ] Seela F, Kaiser K. 8Aza7deaza2!, 3!d ideoxyadenosin e: synthes is
and convers ion into allopurinol 2!, 3!d ideoxyribofuranoside. Chem
Pham Bu l,l 1988, 36: 41534156.
[ 4] FarinaV, Ben ign iDA. A new syn thesis of2!, 3!d ideoxynucleosides for
aid s chem otherapy. T etrah edron Lett, 1988, 29: 12391242.
[ 5] M inato S, Nakan ish i K. S tud ies on nonspecific adenos ine deam inase
from takad iastase. IV. dech loronase activity. J B iochem, 1967, 62:
2125.
[ 6] 萨姆布鲁克 J,弗里奇 EF,曼尼阿蒂斯 T.分子克隆实验指南 (第 2
版 ) [M ] .北京:科学出版社, 1992.
[ 7] C hang ZY, Nygarrd P, Ch inau ltAC, Kellem sKE. Deduced am ino acid
sequence ofE scherichia col iadenosine deam inase reveals evolut ionari
ly conserved am ino acid res idu es: im pl ications for catalyt ic funct ion.
B iochem is try, 1991, 30: 22732280.
[ 8] 张龙翔.生化试验方法和技术 (第 2版 ) [M ] .北京:高等教育出版
社, 1982, 138140.
[ 9 ] K alckar HM. Different ial spectriphotom etry of pu rine compouds
ym eans of specif ic enzym es. J B iol Chem, 1947, 167: 461476.
[ 10] Q ianH L, Zeng Y, Zhang HZ. C lon ing, express ion and delet ion of a
denos ine deam inase in E sche ica coli. Acta M icrob io logica Sinica,
2002, 42( 6) : 686691.
[ 11] M am aocch i S, Lup id i G, Venardi G, R iva F. Adenos ine deam inase
from Sacchaomyces cerevisiae: purif icat ion and characterizat ion. B io
chem Int, 1987, 14: 569580.
[ 12] S ingh LS, Sharm a R. Pu rif icat ion and characterization of in test inal a
denos ine deam in ase from m ice. Mol Cell B iochem, 2000, 204:
127134.
[ 13] A lrok ayan S. Pu rif icat ion and characterization of adenosine deam inase
from cam el skeletalmu scles. In t JB iochem CellB io,l 2002, 34: 1608
1618.
98