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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 11 期
大丽轮枝菌分泌蛋白激发子的分离纯化及生物功能研究
王炳楠 杨秀芬 曾洪梅 邱德文
(中国农业科学院植物保护研究所 生物防治农业部重点开放实验室，北京 100081)
摘 要: 利用硫酸铵沉淀、KTA explorer 10 蛋白纯化仪、非变性电泳、割胶电洗脱等方法，从大丽轮枝菌(Verticillium
dahliae)发酵液中分离纯化出一种蛋白激发子，经 SDS-PAGE电泳检测单一条带，相对分子量为 20 kD。该蛋白激发子能够诱
导烟草的过敏反应，处理 6 h后，处理部位出现水渍状，24 h后出现坏死斑。该激发子可以诱导烟草细胞在较短时间内产生防
卫反应信号分子 H2O2 和 NO，并引起活性氧爆发。
关键词: 大丽轮枝菌 蛋白激发子 纯化 过敏反应 信号分子
Purification and Its Bioassay of Secreted Elicitor
Protein from Verticillium dahliae
Wang Bingnan Yang Xiufen Zeng Hongmei Qiu Dewen
(Key Laboratory for Biological Control of Ministry of Agriculture，Institute of Plant Protection，CAAS，Beijing 100081)
Abstract: The protein elicitor from the culture filtrate of cotton Verticillium wilt pathogenic fungus，Verticillium dahliae，was isola-
ted and purified through the procedures of ammonium sulfate precipitation，KTA Explorer 10 Protein Purification System，native-
PAGE，corresponding gel cut and electroelution which appeared as a single band in SDS-PAGE gel with molecular mass 20 kD． Infiltra-
ted with this elicitor induced a hypersensitive response in tobacco leaves． Treated post 6 h，the tissue became water damageable，and 24
h after treated，the tissue became necrosis with browning and complete drying． The protein elicitor activated signal moleculars production
included hydrogen peroxide(H2O2)and nitric oxide(NO) ，and induced reactive oxygen species(ROS)burst in short time．
Key words: Verticillium dahliae Protein elicitor Purification Hypersensitive response Signal molecular
收稿日期:2011-03-28
基金项目:中俄国际合作项目(2009DFR30630)
作者简介:王炳楠，硕士研究生，研究方向:诱导植物抗性的新型蛋白生物农药;E-mail:bingnanwang@ 126. com
通讯作者:邱德文，研究员，研究方向:新型蛋白生物农药;E-mail:qiudewen@ caas. net. cn
激发子是一类可以诱导植物产生防御反应的生
物源和非生物源物质。根据来源可以分为植物源激
发子和微生物源的激发子，微生物源激发子又包括
真菌产生的激发子、细菌产生的激发子、某些病毒和
植食性昆虫产生的激发子等［1］。1968 年 Cruicks-
hank和 Perrin［2］从丛梗孢菌(Monilinia fructicola)菌
丝体中提取到一种蛋白多肽(monilicolin A) ，它可以
诱导菜豆内果皮形成和植保素———菜豆素的积累。
此后人们陆续从真菌菌丝体、细胞壁或发酵液中相
继分离纯化出不同性质的激发子［3 － 9］。大丽轮枝
菌是棉花黄萎病的主要致病菌，先前的研究大多集
中在致病菌毒素的纯化之上。例如，吕金殿等［10］分
离的大分子量糖蛋白，可以导致棉花维管束系统产
生了胶滞体和侵填体。国内储昭庆等［11］纯化出 26
kD的糖蛋白可以使棉花致蔫，经研究其主要活性成
分为蛋白质，糖基起到维持蛋白结构作用。国外
Meyer等［12］从病原菌培养液中分离纯化出棉花黄
萎病菌毒素———蛋白脂多糖复合物(PLPC) ，它能导
致棉苗萎蔫及坏死。而对于一些植物防御反应的蛋
白激发子，国内外较少报道。激发子诱导植物产生
过敏反应，是植物提高自身防御的一种重要的途径。
随着人们对植物防御反应的深入认识，各种激发子
诱导植物的防御反应，都要依赖于某些信号分子来
启动植物的抗性机制。已经报道的信号分子有钙离
子、过氧化氢、一氧化氮、茉莉酸、水杨酸、脱落酸、乙
烯及系统素等［13］。
2011 年第 11 期 王炳楠等:大丽轮枝菌分泌蛋白激发子的分离纯化及生物功能研究
本研究主要通过多种纯化步骤，从大丽轮枝菌
培养液中分离到一种分子量为 20 kD 的蛋白类激发
子，该蛋白激发子能够在低浓度下诱导烟草植株产
生过敏反应，并且可以诱导烟草细胞在较短的时间
内产生防卫反应的信号分子 H2O2和 NO，同时引起
活性氧爆发。已报道的大丽轮枝菌激发子与该激发
子在分子量差异明显，该激发子可能是一种新的大
丽轮枝菌蛋白激发子。人们可以用蛋白激发子为研
究和探索植物诱导抗病性机制及抗病性提供重要
策略。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 菌株和植物材料 大丽轮枝菌(Verticillium
dahliae)XH-8，由新疆农垦科学院棉花所提供。枯
斑三生烟草(N． tabacum cv． Samsun NN) ，由本实验
室保存;烟草悬浮细胞 BY2，由中国农业大学生命科
学研究中心馈赠。
1. 1. 2 试剂和仪器 HEPES、Tris、3，3-二氨基联
苯胺(DAB)、发光氨(Luminol)购自 Sigma 公司;NO
检测试剂盒(NO assay Kit)购自北京普利莱基因技
术有限公司;NO 荧光探针(DAF-FM DA)购于南京
碧云天生物技术研究所;蛋白含量分析试剂盒
(BCATM protein assay kit)购自美国 Thermo Fisher
Scientific公司，其它试剂均购于北京化工厂。
KTA explorer 10 蛋白纯化仪(美国 GE公司) ;
荧光显微镜、光学显微镜(日本 OLYMPUS 公司) ;
GF-M2000 型酶标仪(山东高密彩虹分析仪器有限
公司) ;紫外分光光度计(日本岛津公司) ;发光检测
仪(美国 Promega公司) ;蛋白电泳槽(美国 Bio-Rad
公司)。
1. 2 方法
1. 2. 1 粗蛋白激发子的制备和生物活性监测 大丽
轮枝菌于 PDA培养基，25℃培养 2 周后，挑去菌落边
缘处菌丝体接种于 Czapek-Dox加 1% 水解络氨酸液
体培养基［14］，25℃、150 r /min黑暗培养 14 d，得到大
丽轮枝菌的发酵液。
所得的发酵液，在 4℃ 5 000 r /min 条件下离心
1 h(或 13 000 r /min，30 min) ，收集上清液，用滤膜
(0. 45 mm)抽滤两次，直至没有菌体。加入硫酸铵
粉末，使上清液中硫酸铵终浓度为 80%来沉淀目标
蛋白质，4℃透析 48 h，最后将获得的胞外总蛋白质
溶解到 Tris-HCl缓冲液(20 mmol /L，pH8. 0)中。
蛋白质含量用 BCATM蛋白含量分析试剂盒测
定［15］，以牛血清白蛋白做标准曲线。
生物活性的监测:以具有 5 － 7 片真叶的烟草为
材料，根据预试验用 1 mL 不带针头的注射器，将
50 μL(1 μmol /L)蛋白溶液从叶子背面注射进叶片
中去，蛋白缓冲液为对照，每个处理重复 3 次。处理
24 h 后，观察是否有过敏反应的坏死斑形成，确定
蛋白激发子是否具有活性。
1. 2. 2 大丽轮枝菌蛋白激发子的纯化 利用
KTA explorer 10 蛋白纯化仪进行蛋白分离纯化。
首先应用阴离子柱 HP Q HiTrapTM(5 mL)进行层
析，5 倍体积 20 mmol /L的 Tris-HCl缓冲液(pH8. 0)
平衡离子柱，取离心并过 0. 22 mm 滤膜的粗蛋白激
发子 15 mL上柱，流速为 3 mL /min，淋洗至基线后，
用含有 1 mol /L NaCl的 20 mmol /L的 Tris-HCl缓冲
液(pH8. 0)线性洗脱，流速为 3 mL /min，收集各个
峰用 HiTrapTMDesalting(5 mL)脱盐处理，脱盐后各
峰样品用于生物活性监测，确定目的峰。其次将含
有目的蛋白组分的缓冲液替换为加入 1 mol /L
(NH)4SO4 的 20 mmol /L Tris-HCl缓冲液(pH5. 4) ，
样品 1 mL用疏水柱 phenyl HP(1 mL)层析，平衡淋
洗，流速为 1 mL /min，待平衡后，用 20 mmol /L Tris-
HCl缓冲液(pH5. 4)进行线性洗脱，流速 1 mL /min，
收集各个峰脱盐样品用于生物活性监测，确定活性
组分峰。最后，参照 Davis［16］ native-PAGE 电泳方
法，电泳后切取部分染色，根据染色结果切下目的条
带，将含有目的条带的胶粒装入透析袋，与电泳槽中
进行冰浴电洗脱，回收蛋白并做生物活性监测，确定
目的蛋白。
参照郭尧君的电泳方法［17］，用 SDS-PAGE银染
法检验蛋白的纯度和测量分子量大小。
1. 2. 3 NO的检测 参照 Asai方法［18］，略有改变。
根据预试验取 1 mL 悬浮细胞，加入蛋白激发子处
理，同 时 再 加 入 DAF-FM DA 使 其 终 浓 度 为
5 μmol /L，黑暗室温孵育 20 min。上述操作在离心
管中操作，每个 3 min 颠倒混匀一下，使探针和细胞
充分接触。700 r /min，3 min 离心收集细胞，用 PBS
洗涤细胞 3 次，充分去除 DAF-FM DA。在荧光显微
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镜下观察，激发波长 495 nm，发射波长 515 nm。
同样取 30 mL悬浮细胞，加入蛋白激发子处理，
然后根据 NO检测试剂盒进行操作，应用分光光度计
在 540 nm下测量。蛋白缓冲液为对照。
1. 2. 4 H2O2的沉积和活性氧爆发 参照 Hans
［19］
的 3，3-二氨基联苯胺(DAB)组织染色法，略有改
变。用 50 μL(1 μmol /L)纯化的蛋白激发子注射烟
草叶片，处理 24 h后，取处理的叶片，用蒸馏水洗净
后置 于 2 mL 离 心 管 中，取 适 量 DAB 染 液
(1 mg /mL，pH3. 8) ，用 NaOH 调 pH 值至 5. 8，分别
加入管中，室温避光保存 8 h。随后去除各管中染
液，加入 95% 乙醇，沸水浴数分钟，去除各管液体，
再加入无水乙醇并沸水浴直至叶片绿色完全脱去为
止，再次吸出各管液体，将叶片浸泡在 70%甘油中，
赶出细胞间气泡显微镜观察。蛋白缓冲液为对照，
每个处理重复 3 次。
参照 Vandelle方法［20］，检测活性氧爆发，方法
略有改变。取约 0. 1 g /mL的烟草悬浮细胞，离心收
集重悬于缓冲液(175 mmol /L 甘露醇，0. 5 mmol /L
CaCl2，0. 5 mmol /L K2SO4，10 mmol /L 羟乙基哌嗪乙
磺酸(HEPES)pH5. 75)中，24℃，150 r /min 孵育 1
h。然后取 250 μL悬浮细胞加入 HEPES缓冲液(添
加 0. 3 mmol /L发光氨(Luminol)于上述缓冲液)中，
同时加入蛋白激发子使其终浓度为 1 mmol /L，并开
始用化学发光检测仪，检测细胞所生成的活性氧浓
度。蛋白缓冲液为对照，每个处理重复 3 次，并在
Excel中进行方差分析。
2 结果
2. 1 大丽轮枝菌蛋白激发子的纯化
大丽轮枝菌粗蛋白样品，首先经过 HP Q Hi-
TrapTM的阴离子交换层析，根据预备试验进行线性
洗脱(0% －40%，30 min) ，然后 100% 洗脱液洗脱，
共获得到 1 个蛋白穿透峰(Q1)和 5 个蛋白洗脱峰
(Q2 － Q6) (图 1)。经生物活性监测，其中洗脱峰
Q3 具有强烈的过敏反应，可以确定 Q3 含有目的蛋
白。该蛋白质峰样品再通过 pheny HP疏水层析柱，
同样也获得 1 个穿透峰(P1)和 2 个洗脱峰(P2，P3)
(图 2) ，经过脱盐，生物活性检验，P3 峰含有目的
蛋白。经过进一步的 native-PAGE 电泳及电洗脱回
收，确定目的蛋白能够形成明显的坏死斑(图 3) ，在
15% SDS-PAGE电泳检测为单一带，说明蛋白质纯
度高(图 4)。该蛋白质表观分子量为 20 kD，将此蛋
白激发子命名为 PevD2(Protein Elicitor of Verticilli-
um dahliae)。相同的纯化步骤得到的另一蛋白激发
子 PevD1(另文发表)。
图 1 阴离子柱 HP Q HiTrapTM(5 mL)层析分离图谱
图 2 疏水柱 phenyl HP(1 mL)层析分离图谱
1．纯化的蛋白激发子-PevD2 引起的坏死斑;2．蛋白缓冲液作为对照
图 3 蛋白激发子引起过敏反应形成坏死斑
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M．蛋白质分子量标准;1．纯化的蛋白激发子
图 4 纯化蛋白 SDS-PAGE电泳图
2. 2 NO的检测
以 DAF-FM DA 荧光探针标记法联合 Griess 试
剂检测法检测 NO 的产生及变化，对于 NO 的产生
给予了定性和定量的测量。由于荧光探针 DAF-FM
DA穿过细胞膜后，在 NO存在的情况下可以生产强
烈荧光物，激发波长为 495 nm，发射波长为 515 nm。
经 PevD2 处理的悬浮细胞产生 NO 被标记后呈现绿
色荧光(图 5)。PevD2 处理的烟草悬浮细胞，NO的
产生量明显高于对照细胞，在激发子处理 15 min 后
NO的生成量达到极大值，随后随时间延续有所回
落并趋于平稳，对照细胞 NO 的量在整个处理时间
内则缓慢升高并趋于平稳(图 6)。
1．蛋白缓作冲液为对照;2．蛋白激发子-PevD2 处理细胞
图 5 DAF-FM DA荧光探针检测 NO的产生
2. 3 H2O2的积累和活性氧爆发
PevD2 处理烟草叶片经 DAB 染色，脱去叶绿素
后，可以观察到 DAB在 H2O2产生和积累处与 H2O2
发生反应，形成褐红色斑点。通过观察褐红色斑点
的产生检测 H2O2 的聚集情况，主要积累在叶脉组
织和处理部位(图 7)。蛋白激发子处理烟草悬浮细
胞后，细胞内 H2O2 成分开始增加并在处理时间内
出现双峰(图 8) ，在处理后 30 min达到极值，约 147
nmol /L。这时 PevD2 诱导产生的 H2O2 约是对照的
140 倍。随着处理时间的延续，H2O2 浓度逐渐下
降，在处理后 70 min，H2O2 含量又有一较小峰值，此
后 H2O2含量急剧下降，仅高于对照，并一直持续到
130 min。在整个 H2O2 检测过程中，对照细胞的
H2O2 含量一直比较平稳，未发生较大的波动。
图 6 NO 含量的检测
1．对照处理叶片;2．蛋白激发子处理叶片
图 7 DAB染色检测植物体内 H2O2的积累
每组处理重复 3 次，方差分析，* 显著差异，P ＜ 0. 05
图 8 化学发光检测 H2O2 浓度
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3 讨论
对得到的 PevD2 蛋白激发子进行双向电泳检
测，确定该蛋白为酸性单一蛋白，并验证该蛋白激发
子为热不稳定的糖蛋白，最适蛋白活性在 pH6 － 8
之间，过酸过碱的条件都会使蛋白失去活性(结果
未列出)。目前我们已经对该蛋白质进行了质谱分
析，得到了其部分肽段(结果未列出)。PevD2 可以
在较低浓度下诱导烟草叶片的过敏性坏死;蛋白激
发子(1 μmol /L)处理叶片 2 h 后，处理部位便出现
透明状，6 h 后水渍斑出现，24 h 组织坏死变干，出
现典型的过敏反应症状。已经有报道证明，激发子
在诱导植物抗性和产生过敏反应的过程中活性氧
(ROS)和 NO 起到了重要的信号传递和调节作用。
ROS主要包括 O2-和 H2O2，H2O2具有高的细胞膜通
透性能在植物细胞之间快速扩散并且半衰期较长等
特点，所以在植物的进化中逐渐成为了诱导植物产
生抗性反应的信号分子［21，22］。在激发子诱导植物
抗性时，最快速的反应是 Ca2 +等的离子内流和 K +、
Na +、Cl －等的离子外流，随后是细胞周围 H2O2浓度
的剧增(即活性氧爆发) ，接着是细胞内酶类的磷酸
化 /去磷酸化，从而使抗性相关基因被激活，积累相
应的 mRNA，增加相应酶的活性，最后表现为产生植
物防御的物质或过敏性细胞死亡［23］。1998 年
Delledonne［24］和 Durner［25］对 NO 参与植物防御反
应作用进行了报道，用无毒丁香假单孢菌(Pseudo-
monas syringae)接种大豆悬浮细胞以后，因为 NO与
H2O2联合作用诱导悬浮细胞发生过敏性死亡，而用
NO合成酶抑制剂 L-单甲基精氨酸(L-NMMA)同时
处理大豆细胞，可以有效地阻断过敏性反应的发生。
可见，NO在诱导植物过敏性反应中有着重要作用。
有报道称植物细胞膜内 NO作为信号分子也和有些
蛋白激酶信号通道偶联，如丝裂原活化蛋白激酶
(MAPK)信号途径，以此来调节信号的传导［18，26］。
有关胞外 蛋 白 激 发 子 的 纯 化 已 经 有 报
道［14，27，28］，但是对于大丽轮枝菌分泌型激发子的纯
化还仅仅停留在复合物的分离上，本研究探讨了有
效的纯化方法，优化并建立了快速的纯化步骤。通
过对 PevD2 纯化条件的多次摸索，确定了以层析为
主，盐析和切胶回收为辅的最佳纯化路线，节省了时
间，减少了损失，提高了蛋白的获得率。该蛋白激发
子的有效纯化与获得为进一步研究植物诱导抗性机
制，寻找蛋白受体研究信号传递通路，获得蛋白晶体
解析结构模型等深入的研究奠定了基础。
4 结论
本研究从大丽轮枝菌培养液中经过盐析，蛋白
纯化仪层析分离，非变性凝胶电泳，切胶回收，从大
丽轮枝菌发酵液中分离纯化出一种蛋白激发子，经
SDS-PAGE 电泳检测单一条带，相对分子量为 20
kD。该蛋白激发子能够诱导烟草的过敏反应，处理
烟草叶片 24 h 后出现坏死斑。该激发子能够引起
烟草细胞在较短时间内产生防卫反应信号分子
H2O2 和 NO，并引起活性氧爆发。
致谢:新疆农垦科学院棉花所刘政老师惠赠大丽轮枝
菌，特此致谢。
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