全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 12期
番茄加工产品 DNA提取方法研究
吴明生 贾希海 律宝春 云晓敏 郭慧杰
(北京市种子管理站 ,北京 100088)
　　摘 　要 : 　采用 SDS法、CTAB法、热碱法和试剂盒法提取番茄加工产品的 DNA,并通过 PCR方法是否检测出番茄内源基
因来评价 DNA提取效果。结果显示 ,番茄加工产品经弱碱稀释处理后 , CTAB法和热碱法提取的 DNA利用嵌套 PCR检测出
内源基因 ,可以满足基因检测需求。同时对加工产品 DNA提取及基因检测需注意的问题进行了探讨。
关键词 : 　番茄 加工产品 DNA提取 基因检测
收稿日期 : 2009209209
基金项目 :北京市农业局农业科技新星项目 (200903231)
作者简介 :吴明生 (19782) ,农艺师 ,硕士 ,主要从事转基因产品检测和检测技术研究 ; E2mail: wum ish2002@ yahoo. com. cn, Tel: 010262382454
Study on DNA Extraction M ethod from Processed
Food of Tomato for Gene Detection
W u M ingsheng J ia Xihai Lv Baochun Yun Xiaom in Guo Huijie
(B eijing Seed Adm inistration S tation, B eijing 100088)
　　Abs trac t: 　Four DNA extraction method of SDS method, CTAB method, hot alkali method and commercial kit method were used to
extract the genom ic DNA form the p rocessed p roducts of tomato, and the PCR results of one tomatopis endogenous gene with the extracted
DNA were used to evaluate those methodspieffect. The results indicated the endogenous gene could be detected from the DNA extracted
by CTAB method and hot alkali method with nested PCR technology. A t the same time, the some advertent p roblem s in the DNA extrac2
tion and gene detection of p rocessed foods were discussed.
Key wo rds: 　Tomato Processed p roduct DNA extraction Gene detection
　　番茄作为重要转基因受体植物之一 ,目前国际
上已有多个转基因品种获得商业化种植 ,如孟山都
(Monsanto)公司开发的抗虫品种 5345和延期成熟
品种 8338,我国也于 1996年批准首个转基因番茄
品种商业化 ,即耐贮藏的华番一号。但是关于转基
因产品食用安全问题科学界至今还未定论 ,为此各
国对转基因产品都实行监督检测 ,进行标识管理 ,保
护消费者知情权和选择权 [ 1 ]。作为番茄的加工产
品 ,番茄酱及番茄沙司是人们日常生活中重要的食
用配料 ,研究其 DNA提取方法 ,并通过合适的 PCR
技术检测出目的基因将对日后番茄加工产品基因检
测和标识管理具有重要意义。
1　材料与方法
1. 1　试验材料
番茄酱及番茄沙司从超市购买 ,共 3个品牌 ,分
别为味好美蕃茄沙司 ( 340 g/瓶 ) ,普德瑞番茄酱
(227 g/罐 )和加乐番茄沙司 ( 330 g/瓶 ) ,用于对照
的为普通番茄种子。
1. 2　生化试剂
DNA markerⅠ (100 bp, 200 bp, 300 bp, 400 bp,
500 bp, 600 bp )、新型植物基因组 DNA 提取试剂
盒、Taq酶和 dNTPs由天根生化科技 (北京 )有限公
司提供 , PCR引物由上海英俊生物技术有限公司合
成 ,其他生化试剂都由博励阳 (北京 )生物医学技术
发展有限公司提供。
1. 3　引物设计
根据番茄的内源基因多聚半乳糖醛酸酶基因
( GenBank登录号 :M3730411) DNA序列 ,利用引物设
计软件 Primer 510设计扩增片段长度不等的 3对引物
(表 1) ,其中 P2是 P1嵌套引物 , P3是 P2的嵌套引物。
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2009年第 12期 吴明生等 :番茄加工产品 DNA提取方法研究
表 1 番茄多聚半乳糖醛酸酶基因扩增引物序列信息
引物名称 碱基序列 扩增片段大小 ( bp)
P1
F: 5′2tcattgtttctttaatttccct23′
R: 5′2aaggcaaagatgctctgaaaa23′ 384
P2
F: 5′2gatagaaggctttggattg23′
F: 5′2gcatttgtgacacctccttc23′ 220
P3
R: 5′2atggcaatggacaagtatggtg23′
R: 5′2cgagcaacatagcgtaaaact23′ 97
1. 4　样品前处理
取 50 g番茄酱或番茄沙司 ,加入 200 m l NaOH
溶液 ( pH1010 ) 进行稀释 , 并在搅拌器上搅拌
20 m in,将混合物 12 000 r/m in离心 10 m in,取沉淀
进行 DNA提取。
115　DNA提取
1. 5. 1　CTAB 法 取沉淀 5 g于 50 m l的离心管
中 ,加入预热的 CTAB 提取缓冲液 ( 50 mM CTAB,
100 mM Tris2HCl, 20 mM EDTA, 114 M NaCl,
pH810) 20 m l,混匀后在 65℃水浴加热 30 m in,加入
15 m l苯酚 /氯仿 /异戊醇 ( 25∶24∶1 )溶液 ,混匀后
12 000 r/m in离心 10m in。取上清加入等体积的氯
仿 /异戊醇 (24∶1)溶液 ,混匀后 12 000 r/m in离心
10 m in。取上清 ,加入等体积的异丙醇和 1 /10体积
的乙酸钠溶液 ( pH512 ) , 混匀后于 - 20℃放置
30 m in, 12 000 r/m in离心 10 m in。70%乙醇溶液洗
涤沉淀两遍后用 800μl的 TE溶液溶解 ,移至 2 m l
的 EP管 ,加入等体积的氯仿 /异戊醇 ( 24∶1)溶液 ,
混匀后 12 000 r/m in离心 10 m in。取上清 ,加入等
体积的异丙醇和 1 /10体积的乙酸钠溶液 (pH512) ,
混匀后于 - 20℃放置 2 h, 12 000 r/m in离心 10 m in,
70%乙醇溶液洗涤沉淀两遍后用 100μl的 TE溶液
溶解 ,放置 4℃备用。
1. 5. 2　SDS法 取沉淀 5 g于 50 m l的离心管中 ,
加入预热的 SDS提取缓冲液 ( 200 mM Tris2HCl
pH810, 300 mM NaCl, 25 mM EDTA, 015% SDS) 20
m l,混匀后在 65℃水浴加热 30 m in,剩下抽提步骤
同 511。
1. 5. 3 热碱法 取沉淀 5 g于 50 m l的离心管中 ,
加入预热的 NaOH溶液 (25 mM ) 20 m l,混匀后在沸
水浴中加热 10 m in,加入 5 m l预冷的 Tris2HCl(1 M ,
pH210)混匀 ,抽提步骤同 11511。
11514　试剂盒法 　参照试剂盒说明书。
116　PCR扩增
PCR扩增体系 : 215 mM Mg2 + , 1 U Taq酶 , 1 ×
PCR缓冲液 , 200 mM dNTPs,引物 0110μM , DNA模
板 2μl,反应体积为 20μl。PCR扩增条件 : 95℃变
性 5 m in; 95℃变性 30 s, 60℃退火 30 s, 72℃延伸
45 s, 36个循环 ; 72℃延伸 10 m in。PCR产物用琼脂
糖凝胶电泳检测。如果一次 PCR没有扩增出目的
片段 ,取一次 PCR 产物 1 μl作为模板进行嵌套
PCR,其中 P1扩增的产物分别用 P2和 P3进行再扩
增 , P2的产物采用 P3进行再扩增。
2　结果分析
211　引物特异性与扩增效率检测
由于大部分番茄加工产品含有其他的植物成
分 ,为了避免其他植物 DNA的干扰 ,根据番茄的
内源基因多聚半乳糖醛酸酶的 DNA序列 ,设计的
3对特异引物 ,将 3对引物同时扩增番茄、水稻、玉
米、大豆、小麦、和洋葱 6种植物种子基因组 DNA ,
结果显示只有从番茄种子基因组 DNA中扩增出目
的基因片段 ,而且 3对引物扩增条带清晰明亮 (图
1) ,说明设计的引物不仅具有特异性 ,而且扩增效
率高 ,可以用于番茄加工产品的番茄 DNA的特异
检测。
1, 7, 13.番茄 ; 2, 8, 14.水稻 ; 3, 9, 15.玉米 ; 4, 10, 16.大豆 ;
5, 11, 17. 小麦 ; 6, 12, 18. 洋葱 ;M. DNA marker
图 1　设计引物的特异性与扩增效率检测
212　DNA提取效果分析
利用 4种 DNA提取方法分别对 3种番茄加工
产品进行了 DNA提取 ,并用 3对番茄内源基因引物
对提取的 DNA进行了扩增。显示通过一次 PCR, 4
方法提取的 DNA都没有扩增目的基因 (图 2) ,说明
DNA没有提取成功或者提取 DNA含量非常低。为
此 ,采用巢式 PCR技术将一次 PCR产物进行了二
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生物技术通报 B iotechnology　B u lle tin 2009年第 12期
次扩增 ,结果显示 ,仅 P2一次扩增的产物通过 P3二
次扩增出目的片段 ,并且是 CTAB法和热碱法提取
的 DNA 都扩增出目的片段 ,其中 CTAB 法提取的
DNA扩增条带较热碱法的好 (图 3)。这些结果显
示 ,通过合适的 PCR技术 , CTAB法和热碱法提取的
番茄加工产品 DNA可以用于基因检测。
1～3. 分别为 P, P2和 P3对番茄种子 DNA的扩增 ; 4, 8, 12. CTAB; 5,
9, 13: SDS; 6, 10, 14. 热碱法 ; 7, 11, 15. 试剂盒
图 2　四种方法提取的 D NA第一次 PCR结果
(样品 :味好美番茄沙司 )
1～3. 分别为 P, P2和 P3对番茄种子 DNA的扩增 ; 4, 8, 12. CTAB;
5, 9, 13. SDS; 6, 10, 14. 热碱法 ; 7, 11, 15. 试剂盒
图 3　四种方法提取的 D NA巢式 PCR结果
(样品 : 味好美番茄沙司 )
为了进一步验证比较 CTAB法和热碱法提取效
果 ,将提取的样品量从 5 g增加到 10 g,其中 CTAB
法提取的 DNA可以通过 P3一次 PCR检测出 ,但扩
增条带亮度较弱 ,而热碱法仍旧不行 (结果未显
示 ) ,说明 CTAB法提取的效率比热碱法要高。
3　讨论
加工产品的 DNA提取是制约转基因食品检测
的瓶颈问题 [ 2, 3 ]。加工产品的 DNA提取有 3个问题
值得注意。 (1)首先是样品的前处理。由于加工产
品成分复杂 ,而含有 DNA的有效成分又非常少 ,因
此根据加工产品的特点进行一些前处理或许获得
一些较好效果 ,本研究根据番茄酱酸性 ( pH310～
510)的问题 ,采用弱碱液对其进行中和 ,并对其中
糖份等添加成分进行有效溶解稀释后 ,通过离心回
收干物质进行抽提取得较好效果。 (2) DNA提取方
法的选择。目前 DNA提取方法很多 ,商业试剂盒虽
然提取效率高 ,但基本上只针对小样品的提取 ,由于
提取的样品量少 ,用试剂盒提取一些加工产品的
DNA,效果并不理想。而常规的 CTAB法不受量的
限制 ,可以将样品量加大 ,这样可以起到浓缩的效
果 ,积少成多 ,反而提取的效果较好。 ( 3)引物的设
计和扩增方法的选择。既然加工产品的 DNA大量
降解 ,因此可用于扩增的 DNA片段一般很短 ,本研
究采用 3对扩增片段长度不等引物进行扩增 ,结果
显示只有最短的 P3才能扩增出目的片段 (97 bp ) ;
另外 , PCR扩增方法上 ,一次 PCR没有结果并不能
说明没有提取成功 ,而有可能是样品的 DNA含量太
低 ,可以采用扩增效率更的高嵌套或 PCR 荧光
PCR,这样可以大大提高扩增的成功率。
参 考 文 献
1　宋林 ,杨昌举 ,胡品洁. 中国食物与营养 , 2005, 6: 9～12.
2　 Kakihara Y, Matsufuji H, Chino M, Takeda M. Food Control, 2006,
17 (10) : 808～813.
3　 Cankar K, Stebih D, D reo T, et al. BMC B iotechnol, 2006, 6 (1) : 37.
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