全 文 ：研究报告 生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
染色质免疫沉淀试验中基因组 DNA
超声破碎条件优化策略
李敏俐 1 关善辉 2 陆祖宏1
( 1东南大学生物电子学国家重点实验室,南京 210096; 2山东省泰安市中心医院麻醉科,泰安 271000)
摘 要: 染色质免疫沉淀试验中对共价交联的基因组染色质进行超声处理以获得适当大小的 DNA片段是 ChIPSeq和
Ch IPchip成功的前提。影响基因组 DNA破碎的因素很多,细胞浓度、细胞裂解方式、超声体积、探头深度、超声环境、超声时
间和超声功率等都会对超声效果产生影响。如何获得各个可变参数的优化组合是一个需要多次摸索的过程, 借鉴其它研究
者已经建立的优化条件进行探索是一条比较省时简便的途径。本研究针对超声时间、细胞裂解方式、超声环境和超声功率等
因素进行优化; 利用优化的条件超声, 得到适合大小的 DNA片段;对这些片段进行染色质免疫沉淀试验,获得已知靶基因的特
异性富集; 证明超声优化条件是成功的。本研究提出的超声优化策略及获得的优化条件为后续 ChIPSeq试验创造了前提条
件, 也对其他研究者具有借鉴意义。
关键词: 超声 染色质免疫沉淀 基因组 DNA ChIPSeq ChIPchip
OptimalU ltrasonic Conditions for Shearing the Genom ic DNA in
the Chromatin Immunoprecipitation Experiment
L iM inli
1
Guan Shanhu i
2
Lu Zuhong
1
(
1
StateK ey Laboratory of Bioelectronics, Southeast University, N anj ing 210096;
2
D epartm ent of Anesthesiology of Tai an CentralH osp ital Shandong Province, Tai an 271000)
Abstrac:t Shear ing the cro sslinked genom ic DNA to an optim a l size is a key step in chrom atin immunoprecipitation and tha tw ill
affect the subsequent Ch IPSeq or ChIPch ip resu lt. There are m any var iable factors that m ay influence the fragm en t s ize such as cell
concentration, cell lysis bu ffer, depth of the probe, sonication hours and the sonication pow er et a.l It is a long process to get the optim a l
comb ination of the var ious var iable param eters. L earn from the other estab lished optim a l conditions for exp loration is a relative ly easy
and timesav ing approach. In th is paper, ultrason ic time, cell lys is me thod, ultrason ic env ironm ent and fac to rs such as u ltrason ic pow er
w ere optim ized. U sing the optim ized cond itions, w e ach ieved DNA fragm ents of su itab le size. W hen immunoprecipitate these fragm en ts,
spec ific known ta rget gene was enriched at a h igh leve .l These exper im ent results showed that our optim ized ultrason ic condition w as
successfu.l The u ltrasonic optim ization strategyw e proposed and the optimum conditions we ach ieved can prov ide precond itions to subse
quent ChIPSeq expe rim ne t and w ill prov ide significance to the o ther researchers.
Key words: Son ica tion Ch rom a tin immunoprecip itation Genom ic DNA ChIPSeq ChIPch ip
收稿日期: 20091209
作者简介:李敏俐,女,讲师,研究方向:生物医学工程; Em a i:l lm@l seu. edu. cn
通讯作者:陆祖宏,男,教授,博士生导师, Em ai:l zh lu@ seu. edu. cn
免疫沉淀试验 ( chroma tin immnoprec ipitation,
ChIP )是研究 DNA与蛋白质体内相互作用的标准方
法 [ 1] , ChIP与高密度芯片 ( m icroarray )或测序 ( se
quencing)相结合是目前研究全基因组范围内 DNA
与蛋白质相互作用的主要技术 [ 2, 3 ] ,运用 ChIPSeq或
ChIPchip取得了前所未有的高通量的遗传信息, 系
统地揭示了体内转录因子调控和组蛋白修饰、核小
体定位等表观遗传方面的遗传机制 [ 4- 6]。成功的染
色质免疫沉淀试验是后续测序或芯片杂交的前提,
而超声获得适当大小的片段是染色质免疫沉淀试验
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
成功的基础。ChIP 技术由 O rlando于 1997年创
立 [ 7]。其基本原理是甲醛交联固定细胞, 使细胞内
的 DNA与蛋白质及蛋白质与蛋白质之间相互作用
形成复合体;然后裂解细胞并超声处理交联的染色
质,使染色质 DNA破碎为适当大小的片段; 用特异
性抗体免疫沉淀所研究的蛋白与 DNA的复合物
(非特异性免疫球蛋白 IgG的免疫沉淀作为对照 ) ;
最后将免疫沉淀后的样品进行反交联, 分析得到的
DNA序列。
在整个免疫沉淀试验过程中, 超声是可变性最
强的一步。有很多因素影响超声效果,如细胞类型、
细胞交联程度、超声时间、细胞浓度、细胞裂解方式、
超声体积、探头深度、超声功率和所用的超声仪器
等,所以,每个试验都要针对特定的具体情况进行条
件优化。借鉴以前研究者所用的条件, 对可能影响
超声结果的因素如超声时间、细胞裂解方式、超声环
境和超声功率等条件进行优化探索, 以期提出染色
质免疫沉淀试验中基因组 DNA的超声优化策略,为
后续 ChIPSeq试验创造前提条件, 同时为其他研究
者提供借鉴。
1 材料与方法
11 仪器与试剂
宁波新芝 TZIID型细胞粉碎仪, 低温离心机
( eppendorf公司 ) , 9600型热循环仪 ( PerkinE lm er) ,
电泳仪 PAC3000 ( B ioRad) , 凝胶成像系统 ( Synge
ne, Gene Genius)。二步裂解法的裂解液配方: 裂解
液 A: 5mM Pipes( KOH ), pH 80, 85 mM KC,l 05%
NP40,裂解液 B: 50 mM T ris, pH81, 10mM EDTA,
1% SDS。三步裂解法裂解液配方: 裂解液 A: 50
mM HEPESKOH, pH 75, 140 mM N aC,l 1 mM ED
TA, 10% g lycero,l 05% NP40, 025% TritonX100;
裂解液 B: 10 mM TrisHC ,l pH80, 200 mM NaC ,l 1
mM EDTA, 05 mM EGTA; 裂解液 C: 10 mM Tris
HC ,l pH80, 100 mM N aC ,l 1 mM EDTA, 05 mM
EGTA, 01% 脱氧胆酸钠, 05% N月桂酰肌氨酸。
蛋白酶抑制剂 Cock tail ( S igm a, p8340 ); PM SF
(南京生兴公司, P0012); 玻璃珠 ( 212- 300 m, S ig
ma, G9143) ; 磁珠 ( Dynabeads, 11203, 上海英俊公
司 )。
12 K562细胞培养与交联
K562细胞用常规 RPM I1640培养基加 10% 新
生牛血清和双抗 (青霉素 105 IU /L、链霉素 105 IU /L )
培养, 2- 3 d换液 1次。取指数期生长细胞进行
1%的甲醛交联 (在交联的前 1天换液 ) , 室温下交
联 10 m in, 然后加入终浓度为 0125M的甘氨酸终
止反应, 1 PBS洗涤细胞后 - 80! 保存交联的细胞
备用。
13 超声后染色质处理
超声后的染色质 65! 反交联 6 - 16 h, 加入蛋
白酶 K 55! 消化 1 h, 然后用 Q iagen纯化柱纯化
DNA并进行琼脂糖凝胶电泳,扫描记录电泳结果。
14 超声条件优化
141 细胞裂解方式比较 二步裂解法:将交联过
的细胞先用裂解液 A (含 1 蛋白酶抑制剂 )冰上裂
解 10 m in, 然后 1 350 g低温离心 5 m in, 弃上清,
再加入裂解液 B (含 1 蛋白酶抑制剂 )冰上裂解
10m in后进行超声。
三步裂解法:将交联过的细胞先用裂解液 A(含
1 蛋白酶抑制剂 )冰上裂解 10 m in, 然后 1 350 g
低温离心 5 m in,弃上清; 再用裂解液 B (含 1 蛋白
酶抑制剂 )室温裂解 10 m in, 然后 1 350 g室温离
心 5m in,弃上清;最后用裂解液 C(含 1 蛋白酶抑
制剂 )冰上裂解 10 m in, 然后 1 350 g低温离心
5m in,弃上清。超声条件:冰水浴中超声, 细胞浓度
约为 1 107 /mL, 每次超声体积为 350 L,细胞粉碎
仪的输出功率 85% ,超声 5 s, 间歇 99 s, 超声总时
间为 24m in。
142 超声时间优化 细胞裂解方法为三步裂解
法。超声条件:细胞浓度约为 1 107 /mL, 超声体积
为 350 L,细胞粉碎仪的输出功率 85% ,超声 3 s,
间歇 6 s,超声时间以 8m in为时间梯度,取 6次, 最
长为 48m in。
143 超声溶液中玻璃珠对超声结果的影响 设
立 6管细胞进行超声,其中 1- 3号不加玻璃珠, 4-
6号加入 01 g玻璃珠, 1号与 4号管超声 6 m in, 2
号与 5号管超声 22 m in, 3号与 6号管超声 25m in,
细胞浓度约为 1 107 /mL,超声体积为 350 L,细胞
粉碎仪的输出功率 85%,超声 3 s,间歇 6 s。
144 超声功率对超声结果的影响 比较超声功
122
2010年第 5期 李敏俐等: 染色质免疫沉淀试验中基因组 DNA超声破碎条件优化策略
率输出为 85%和 60%的超声效果。设立 6管细胞,
超声条件: 细胞浓度约为 1 107 /mL, 超声体积为
350 L,超声 3 s,间歇 6 s,超声时间以 5m in为时间
梯度, 取 3次,最长为 15 m in。
15 运用优化的条件进行超声
交联的细胞用三步裂解法裂解后进行超声。超
声浓度为 1 107 /mL,超声体积为 350 L,细胞粉碎
仪的输出功率 85% ,超声 3 s,间歇 6 s,探头深度为
距离 Eppendorf管底部 3 mm 左右, 超声时间为 20
m in。共设立 5管平行的细胞进行超声。
表 1 引物序列及扩增产物长度
基因 引物 核酸序列 ( 5∀- 3∀) 扩增产物长度
( bp)
PA I1 上游 ACAGGCAGAGGGCAGAAAGGT 247下游 CCAGATGTGGGCAGGAAATAGA
A ct in 上游 AGAGCCCACCTTCCTTCCC 281下游 CCCTTGCCGACTTCAGAGC
16 染色质免疫沉淀试验及对特异靶点的富集
检测
超声后的 DNA与蛋白质复合体进行转录因子
cJun的染色质免疫沉淀试验。取超声溶液离心后
上清液的 10%作为 inpu t DNA, 保存在 - 80! 留待
后用。剩余上清液分两部分:一部分不加抗体,直接
与磁珠孵育,作为对照; 另一部分与已经和 cJun抗
体 ( Santa cruz生物技术公司, sc1694)孵育 6 h以上
的磁珠孵育。然后进行磁珠洗涤与洗脱。取出 In
putDNA,冰上解冻后与免疫沉淀样品同时进行反
交联, 经过蛋白酶 K和 RNA酶消化, Q iagen纯化柱
纯化后取部分 DNA定量。 PCR扩增看家基因
A ctin和已知的 cJun靶基因 PA I1[ 8, 9]。引物序列
见表 1。 PCR体系包含以下物质: 上、下游引物
( 10 M )各 125 L, dNTP混合物 ( 10 mM each)
05 L, 10 PCR Buffer (不含 M g2 + ) 25 L,
M gC l2 16 L, TaqDNA Po lymerase ( 5 U /L )
05 L, 模板 1 L, 灭菌双蒸水 164 L。反应总
体积为 25 L。在 PCR热循环仪中进行扩增反
应。反应参数: 94! 5 m in; 94! 30 s, 64! 30 s,
72! 30 s共 30个循环;最后 72! 延伸 7 m in。反
应结束后取 5 L扩增产物作琼脂糖凝胶电泳,
PAC3000( B ioRad)紫外凝胶成像仪上检测片段大
小,并拍照记录。
2 结果与讨论
21 细胞裂解方式对超声效果的影响
如图 1A所示,同样的超声参数条件下二步裂
解法没有打断染色质,条带集中在 2 000 bp之上;而
三步裂解法具有较好的打断效果,条带呈弥散状,主
带集中在一定的范围区间内。关于细胞裂解方式,
不同试验方案各不相同, 如 Farnham[ 10]实验室和
Shang
[ 11]采用 SDS二步裂解法, Young[ 12 ]实验室采
用三步裂解法。本研究比较了二步裂解法和三步裂
解法的超声结果, 相同参数条件下三步裂解法取得
的效果较好。二步裂解法与三步裂解法的区别在于
裂解液成分与超声之前的裂解处理次数。裂解液中
关键是去污剂的类型与浓度, 二步裂解法的裂解液
B(也是超声时的裂解液 )中含有 1%的 SDS, SDS是
离子型去污剂, 对核膜的裂解效果比较好。但 SDS
存在两个主要的缺点:易于产生泡沫,降低超声能量
的效率;在冰水浴中易于结晶,不易控制。一个较为
优化的超声体系, 超声过程中产生的热量能够抵消
使 SDS结晶的低温。但在试验初始进行时,往往要
经过多次摸索才能得到一个适合的条件, 而 SDS
的结晶将影响试验进程, 所以最后一步的裂解液
中不推荐使用 SDS。如果用 SDS裂解细胞, 那么
在超声时应该使溶液中 SDS的浓度不高于 01% ,
并且后续抗体免疫沉淀时应该将溶液中的 SDS换
为温和的非离子型去污剂 [ 13 ] , 否则将影响免疫沉
淀效果。
细胞甲醛交联后,细胞内的骨架蛋白、部分细胞
基质蛋白、染色质及 DNA结合蛋白可能交联在一起
形成一个复合体, 而在后续免疫沉淀反应中希望得
到的是与抗体特异结合的特异蛋白, 众多杂蛋白的
存在将影响免疫效果,增加非特异性结合,所以超声
之前首先用裂解液进行几次裂解离心将一些可溶蛋
白分离出去,以便得到相对较为纯的蛋白与 DNA复
合体。超声之前先进行二步裂解离心的三步裂解法
可以更好地分离杂蛋白, 故三步裂解法优于二步裂
解法。
123
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
A.裂解方式优化,M100 bp分子量标准; 1, 2.用二步裂解法
的两个重复; 3, 4.三步裂解法的两个重复; B.超声时间优
化,M. DL2000分子量标准; C.超声溶液中玻璃珠对超声结
果的影响; D.超声功率优化; M. DL2000分子量标准
图 1 超声条件优化结果电泳图
22 超声时间优化
超声优化常用的一个策略是设置时间梯度,通
过琼脂糖凝胶电泳观察片段大小。如图 1B所示,
随着时间延长, 超声主带逐渐下移, 小片段逐渐增
加,当超过 24 m in后,再增加时间,电泳图没有明显
改变。关于超声片段大小,不同试验方案说法不一,
通常要求片段平均长度在 035- 10 kb或片段集
中在某一区域范围内。如 Act ivmot if公司 ( www. ac
t ivemoti.f com )推荐超声片段长度 02- 15 kb, Up
state公司 ( www. m illipore. com )推荐长度为 02 -
10 kb, Ka llesen等 ( www. bcm. edu / rosen lab)推荐
03- 15 kb, Lee[ 12 ]推荐至少有 1 /4的片段在 02
- 06 kb。超声片段长度过大将降低抗体免疫沉淀
效率, 过大的片段能够从电泳图中轻松看出,但超声
太过却不容易发现。交联的的染色质具有物理性质
上的限制,不可能随着超声时间延长而无限变小,所
以避免超声过度的方法是设立一系列的时间梯度,
观察电泳图,小心选择适合的时间周期。
Fan
[ 14]发现, 当超声片段大小在 75 - 300 bp
时,蛋白结合位点的富集度提高了 2- 4倍, 但本研
究暂不确定多的小片段是否导致后续试验的背景问
题。Lee[ 12]发现过度超声将影响后续杂交时的背景
信号。所以如果 ChIP试验的目的是进行 ChIPch ip
或 Ch IPSeq,则应该严格控制超声条件。如果只是
用 RTPCR或狭缝印迹等低通量方法检测某个基因
的存在与否,那么超声条件优化要求标准可以降低。
此外,本研究发现, 超声效果还可以通过超声过
程中溶液状态变化来判断, 好的超声效果从外观上
看液体应该由混浊变为透明,片状悬浮物消失。
23 超声溶液中玻璃珠对超声结果的影响
有文献报道超声溶液中加入玻璃珠有助于交联
的 DNA与蛋白质复合体的打断 [ 15 ] , 研究结果发现
玻璃珠的存在与否并不重要。从图 1C可以看出,
泳道 1- 3(超声溶液中不含玻璃珠 )的电泳图与泳
道 4- 6(超声溶液中含有玻璃珠 )的电泳图几乎一
致,说明玻璃珠在其中起的作用并不明显。并且玻
璃珠有可能对染色质产生吸附作用而造成 DNA的
损耗,所以建议不用玻璃珠。
24 超声功率对超声结果的影响
从图 1D可以看出, 提高功率有助于基因组
DNA的打碎。当超声功率在 60%时,同样的参数条
件下有部分基因组 DNA未被打碎,电泳时 DNA集
中在加样孔的位置; 超声功率在 85%时, 随着时间
延长,大片段消失, 主带集中在一定区域。在超声条
件优化时,可以先取一个中等大小的功率,调整超声
时间,在延长时间无效情况下可以提高超声功率,但
是过高的能量易于产生泡沫而降低超声效率, 必须
小心操作。
25 运用优化的条件进行超声
从图 2A可以看出,运用优化的超声条件超声,
染色质分布均匀, 约 1 /4的条带分布在 200- 600 bp
之间 [ 12] ,这些染色质可以用于后续的免疫沉淀试验。
26 染色质免疫沉淀试验及对特异靶点的富集
检测
在 Input DNA、免疫沉淀 DNA和对照免疫沉淀
DNA 3份样品中分别对特异靶基因和对照基因 (通
常采用看家基因 )进行 PCR扩增是检验染色质免疫
沉淀是否成功的重要质量控制步骤。扩增结果显示
(图 2B) , cJun抗体特异地免疫沉淀了 PA I1基
因, 而对看家基因 A ctin无扩增; 对照是未经特异
抗体免疫的 DNA直接与磁珠孵育, A ctin和 PA I1
都没有扩增,说明磁珠本身的非特异性结合量极少。
124
2010年第 5期 李敏俐等: 染色质免疫沉淀试验中基因组 DNA超声破碎条件优化策略
后续试验结果中非特异性结合处于一个可以接受的
水平; Inpu tDNA是打碎的基因组 DNA, 包含所有的
基因, 所以 A ctin和 PA I1都有扩增。电泳结果证
明免疫沉淀样本是成功可用的。
A :运用优化的超声条件电泳结果图, M. DL2000分子量
标准; 1- 4为 4个平行样品; B:染色质免疫沉淀 DNA
对特定基因扩增结果电泳图, M. 100 bp分子量标准;
1.对A ctin的扩增产物; 2.对 PA I1的扩增产物
图 2 电泳结果
3 讨论
综合以上优化条件, 提出染色质免疫沉淀试验
中基因组 DNA的超声优化策略。通常来说,超声的
细胞浓度在 1 107 /mL左右, 超声体积视具体仪器
而定, 对于宁波新芝 TZIID型细胞粉碎仪, 适合的
超声体积为 330- 400 L, 过大体积将使超声能量
无法均匀有效地达到每一处,产生超声不均匀现象,
部分片段过大,部分过小;探头深度以距离 15 mL
Eppendorf管底部为 3- 5 mm为宜,超声功率起始设
在 85%,超声参数的设置影响并不是很大。本研究
尝试过 3 s开, 6 s间歇; 1 s开, 3 s间歇; 5 s开, 99 s
间歇, 试验结果并无很大差异 (数据未展示 )。超声
过程中由于高能量的作用而使溶液变热, 高温可使
蛋白变性而影响后续的免疫沉淀反应, 间歇时间让
处于冰水浴中的管子冷却, 只要不引起溶液温度过
高,间歇的时间长短并无太大影响。以上条件确定,
可以在超声时间上设计几个梯度进行摸索, 如果超
声片段依然不均匀,在调整时间无效的情况下可以
尝试调低或调高超声功率,及整细胞浓度,最终得到
一个针对所使用仪器及细胞类型的最适条件。
由于 ChIPSeq和 ChIPch ip试验时间较长和花
费较高,无法将每种条件下的超声片段都应用于高
通量分析观察超声效果对最后测序或芯片杂交的结
果影响,只能从片段大小和特异靶基因的富集程度
判断超声和染色质免疫沉淀试验是否成功。运用优
化的条件对人白血病细胞株 K562细胞超声, cJun抗
体免疫沉淀后检测已知靶点富集度,测序分析这些免
疫沉淀获得的 DNA序列,并与人类基因组比对分析
获得 600多个 cJun的结合位点 (未发表的数据 )。
总之,本研究建立的超声优化条件和优化策略对于染
色质免疫沉淀中超声优化步骤具有借鉴意义。
参 考 文 献
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(下转第 140页 )
125
生物技术通报 B iotechnology Bulletin 2010年第 5期
3 讨论
人 IL6是一种具有广泛生物学活性的多功能
单链糖蛋白细胞因子, 可由多种类型的淋巴类和非
淋巴类细胞产生,如 T细胞、B细胞、单核巨噬细胞、
成纤维细胞和内皮细胞等, 在维持机体的生理平衡
中起十分重要的作用。糖基化与否对 IL6生物学
活性影响不明显 [ 7] ,因此可通过基因工程方法在细
菌中高效表达 IL6, 为其生物学活性的研究提供试
验基础。
天然状态下体内 IL6含量极微, 纯化困难, 使
它的研究与应用受到极大的限制。用基因重组技术
制备的重组抗原以纯度高、宜于制备的特点,克服了
上述不足 [ 8 ]。本试验成功克隆并构建了 pET28a
( + ) IL6重组质粒, 并在 BL21中得到高效表达,
且经W estern b lo tt ing鉴定正确。提取包涵体, SDS
PAGE电泳后,切胶回收蛋白,得到高纯度的目的蛋
白,证明了 IL6是以包涵体形式表达。用人 IL6检
测试剂盒检测显示纯化后的蛋白具有较高的免疫活
性,为后续研究提供了试验基础。
适当的 IPTG浓度、诱导时间、温度等既可以诱
导重组蛋白最大限度的表达,又可避免过高的 IPTG
浓度对工程菌的毒害作用。本研究通过改变 IPTG
浓度、诱导培养时间、卡那霉素浓度及培养温度等因
素, 优化了 IL6的表达条件, 使得蛋白表达量在原
来基础上有较大提高, 占总蛋白的 40% , 为大量制
备 IL6蛋白提供了试验基础。
参 考 文 献
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