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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 4 期
长白猪 ×蓝塘猪及其杂种基因组甲基化片段克隆与分析
肖正中1，2 刘小红3 王翀1 李加琪1 莫德林3 陈瑶生3
(1华南农业大学动物科学学院，广州 510642;2广东韶关学院英东农业科学与工程学院，韶关 512005;3中山大学生命科学学院，广州 510006)
摘 要: 应用甲基化敏感扩增多态性(MSAP)技术对 6 头长白公猪和 50 头蓝塘母猪及 51 头长白 ×蓝塘杂交 F1代 3 个
群体基因组 DNA胞嘧啶甲基化位点进行检测，旨在克隆和分析父母代猪及其杂种 F1代之间基因组 DNA 共同甲基化片段和
差异片段，并找到其同源基因。结果显示，从MSAP条带中分离、克隆得到 18 条 3 个群体共同的甲基化片段、10 条母代独有的
甲基化片段和 9 条杂交一代独有的甲基化片段，其中有 1 条 3 个群体共有的甲基化片段通过 EST拼接和电子延伸后在 NCBI
数据库中找到同源基因，即猪类酪氨酸蛋白激酶 Lyn基因(GeneID:LOC100152890，序列号:XM_001926250)。结果表明，长蓝
杂交 F1代与其父母代之间的基因组甲基化存在异同，为通过 MSAP技术克隆猪基因组 DNA甲基化片段及寻找其对应的甲基
化基因提供可能，也会为将来研究这些甲基化基因表达调控机制奠定基础。
关键词: 猪 DNA 甲基化 MSAP 克隆
Cloning and Analysis of DNA Methylation Fragment in
Landrace × Lantang Pigs and Their Hybrids
Xiao Zhengzhong1，2 Liu Xiaohong3 Wang Chong1 Li Jiaqi1 Mo Delin3 Chen Yaosheng3
(1College of Animal Science，South China Agricultural University，Guangzhou 510642;2College of Yingdong
Agricultural Science and Engineering，Shaoguan University，Shaoguan 512005;3State Key Laboratory of Bio-control，
School of Life Science，Sun Yat-Sen University，Guangzhou 510006)
Abstract: To clone and analyze common and different methylation fragments between parents pigs and their F1 hybrids，and find
their homologous genes，genome DNA cytosine methylation was detected in 6 Landrace boars，50 Guangdong Lantang sows and 51 Land-
race × Lantang F1 hybrids by MSAP in this study． The results showed 18 co-methylation fragments in three populations，10 only moth-
ers’methylation fragments and 9 only F1 hybrids’methylation fragments were separated and cloned from MSAP fragments，among all of
these fragments，one which resided in three populations was found a homologous gene in NCBI database after spliced with EST and elec-
tronic extension，i． e．，Sus scrofa similar to Tyrosine protein kinase Lyn gene(GeneID:LOC100152890，SN:XM_001926250)． The re-
sults indicated the DNA methylation had some differences between Landrace × Lantang F1 hybrids and their parents． This study provid-
ed the possibility in cloning pig genome methylation fragments and seeking their homologous genes by MSAP，and also could lay the ba-
sis for a future research on methylation gene expression and regulation．
Key words: Sus scrofa DNA Methylation MSAP Clone
收稿日期:2010-09-27
基金项目:国家自然科学基金重点项目(U0731003) ，广州市科技攻关重点项目(2008Z1-E121)
作者简介:肖正中，男，博士，讲师，研究方向:动物遗传育种与繁殖;E-mail:xiaozhzhlele@ 163． com
通讯作者:陈瑶生，男，博士，教授，研究方向:分子数量遗传学;E-mail:chyaosh@ mail． sysu． edu． cn
DNA甲基化是在发育过程中，虽然基因表达调
控发生改变，但核苷酸序列没有变化，它可以遗传，
也可能发生逆转(脱甲基化)［1］。DNA 甲基化是表
观遗传学(Epigenetics)的重要研究内容之一。在高
等生物中，胞嘧啶甲基化在基因表达调控中扮演了
重要的角色［2 － 4］。DNA甲基化及去甲基化，再加上
组蛋白修饰，直接制约基因的活化状态。
基因之所以发挥功能是基因表达的结果，基因表
达又是基因调控的结果，而 DNA 的甲基化又调控着
基因的表达。大量的研究结果表明，杂种优势本质上
2011 年第 4 期 肖正中等:长白猪 ×蓝塘猪及其杂种基因组甲基化片段克隆与分析
是源于基因表达的变化，所以研究杂种与其亲代基因
组 DNA的甲基化也有助于为揭示杂种优势的分子机
制提供理论参考。Bird 等［5］认为，DNA 甲基化是可
遗传的，并参与基因转录的调控，是正常发育、分化所
必须的，具有重要的生物学意义。但 Hepburn等［6］对
植物 DNA甲基化进行了研究，特别对 DNA甲基化与
基因的转录抑制表达进行了分析，认为杂交能使甲基
化程度得以解除或重新编排。所以，亲代的甲基化并
不一定会遗传给其杂交后代，那么为什么杂种和其亲
代之间会存在共有的甲基化位点?这些基因之所以
保持甲基化状态可能对维持生物体的正常生长发育
有重要意义。另外，不同品种、亲子代间甲基化差异
片段很可能与品种的特异性状相关，如这些片段中是
否有与肉质等性状相关的基因片段，所以，筛选这些
与品种特异性状显著相关的甲基化差异片段可作为
猪选种选配有效的分子标记。
本试验应用 MSAP技术对长白公猪和广东地方
猪种蓝塘母猪及其杂交 F1代 3 个群体基因组 DNA
进行甲基化分析，检测它们的甲基化程度，克隆部分
3 个群体共有的甲基化片段和各自独有的甲基化片
段，并通过同源比对，寻找其同源基因，从而为通过
MSAP法寻找猪的甲基化基因以及研究甲基化基因
表达调控机制探索新的途径。
1 材料与方法
1. 1 材料
用于 MSAP 分析的组织样本:6 头纯种长白公
猪 × 50 头纯种蓝塘母猪以及它们的 51 头杂交 F1
代。所有个体采集耳组织样品，样品采自广东省韶
关市新丰板岭原种猪场健康猪群。
1. 2 DNA提取
参考上海生工生物工程有限公司的基因组
DNA提取试剂盒方法，自配试剂。取耳组织大约
10 mg，与 200 μL 细胞裂解液(含 1. 5% CTAB，
5. 85% NaCl)混匀，加入 2%蛋白酶 K 1. 5 μL，置于
55℃水浴锅中消化过夜;然后再加入 300 μL氯仿抽
提，再加入 250 μL沉淀液(含 1% CTAB)沉淀;去掉
上清液，立即加入 50 μL 1. 2 mol /L NaCl 溶解 DNA
样品，加入 1. 5 μL 1%RNase A，然后置于 55℃水浴
锅中水浴 5 － 10 min;加入 150 μL冷乙醇，－ 20℃放
置 10 min，离心后倒掉乙醇，加入 300 μL 75%乙醇
清洗，离心风干，加入 50 μL TE，37℃水浴锅中水浴
溶解，4℃保存备用。得到的样品 DNA 用 ND-1000
Spectrophotometer测定 OD 值和 DNA 浓度，然后用
ddH2O稀释成相同浓度(50 ng /μL) ，置于 4℃冰箱
保存备用。
1． 3 MSAP分析
对每份 DNA，同时设置 EcoR I +Msp I 和 EcoR
I + Hpa II两种酶切组合分别对基因组 DNA 进行酶
切，连上接头，分别用预扩增引物(Pre-PCR primers)
和选择性扩增引物(Select-PCR primers)进行两轮扩
增，设计选择性扩增引物组合 60 对，筛选 20 对扩增
效果好且多态性较高的引物作为第二轮的扩增引
物。选择性扩增反应条件采用 touch down PCR，程
序如下:94℃预变性 5 min→［94℃ 30 s，65℃(－
0. 7℃ per cycle)30 s，72℃ 60 s］× 13 个循环 →
(94℃ 30 s，56℃ 1 min，72℃ 2 min)× 24 个循环→
72℃ 5 min。产物加上样缓冲液变性后，在 6%的聚
丙烯酰胺凝胶上检测。接头、引物序列见表 1。
1. 4 甲基化片段的克隆测序与序列分析
根据 PAGE电泳结果，查找父母代和子代甲基
化差异和共有片段，在 PAGE 胶上用解剖刀片在特
定位置从聚丙烯酰胺凝胶上切下目的片段，每条带
用 100 μL灭菌蒸馏水再水化，在 100℃煮 5 min，然
后慢慢冷却到室温，13 200 r /min 离心 5 min 后，将
上清液转移到另一干净试管用于 PCR扩增的模板。
琼脂糖凝胶电泳回收纯化 PCR 产物，并克隆测序。
对测序获得的甲基化序列在 NCBI 网站中的 Blast
程序进行在线分析。找到甲基化片段的同源序列或
同源基因。
2 结果与分析
2. 1 父母代猪及其杂交 F1代基因组甲基化分析
用 EcoR I /Msp I和 EcoR I /Hpa II两种酶切组
合分别对 6 头长白公猪和 50 头蓝塘母猪及 51 头长
白 ×蓝塘杂交 F1代 3 个群体共 107 个个体耳组织基
因组 DNA进行酶切比较，前者产生的条带记为 M，
后者产生的条带记为 H。筛选 20 对多态性高的引
物组合对酶切产物进行扩增。产物经 6%变性聚丙
烯酰胺凝胶电泳银染显色见图 1。图 1 显示了 E8 /
HM2 和 E1 + HM1 引物组合的扩增结果，若同一位
置 H、M具有相同的带，即未甲基化条带;H 无带、M
有带的模式，即全甲基化条带;H 有带、M 无带的模
式，即半甲基化条带。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 4 期
表 1 用于MSAP分析的 AFLP引物和接头序列
引物 /接头 序列( →5 3) 引物 /接头 序列( →5 3)
EcoRⅠadapter
CTCGTAGACTGCGTACC
AATTGG TACGCAGTCTAC E + AGG primers(E10) GACTGCGTACCAATTC + AGG
E + A primer(Pre-PCR primers) GACTGCGTACCAATTC + A E + AGA primers(E11) GACTGCGTACCAATTC + AGA
Selective-PCR primers(E1 － E12) E + AAA primers(E12) GACTGCGTACCAATTC + AAA
E + AAC primers(E1) GACTGCGTACCAATTC + AAC HpaⅡ / MspⅠadapter
GACGATGAGTCTAGAA
CGTTCTAGACTCATC
E + AAT primers(E2) GACTGCGTACCAATTC + AAT HM + T primer(Pre-PCR primers) GATGAGTCTAGAACGG + T
E + ACT primers(E3) GACTGCGTACCAATTC + ACT Selective-PCR primers(HM1-HM5)
E + AGT primers(E4) GACTGCGTACCAATTC + AGT HM + TTC primers(HM1) GATGAGTCTAGAACGG + TTC
E + ACC primers(E5) GACTGCGTACCAATTC + ACC HM + TAC primers(HM2) GATGAGTCTAGAACGG + TAC
E + AAG primers(E6) GACTGCGTACCAATTC + AAG HM + TAG primers(HM3) GATGAGTCTAGAACGG + TAG
E + ACA primers(E7) GACTGCGTACCAATTC + ACA HM + TTG primers(HM4) GATGAGTCTAGAACGG + TTG
E + ACG primers(E8) GACTGCGTACCAATTC + ACG HM + TGC primers(HM5) GATGAGTCTAGAACGG + TGC
E + AGC primers(E9) GACTGCGTACCAATTC + AGC
M． DL2000 Marker;H，M．分别为两种不同的酶切组合(EcoR I + Hpa II和 EcoR I +Msp I) ;1－ 3．分别
代表父代、母代和杂交 F1代个体;A．母代独有的甲基化片段;B．杂交 F1代独有的甲基化片段;C． 3
个群体共有的甲基化片段
图 1 MSAP分析的 6%聚丙烯酰胺凝胶电泳图
2. 2 甲基化片段的克隆测序及序列分析
根据 6% PAGE 电泳图，找到蓝塘猪、长白猪及
其杂交 F1代 3 个群体之间的全甲基化、半甲基化差
异条带和 3 个群体中共有的甲基化条带，然后回收、
克隆测序，将测序得到的序列放在 NCBI 数据库中
Blast分析，找到同源序列。本试验克隆的全甲基化
和半甲基化片段共 37 条，其中有 18 条是在 3 个群
体中都存在的甲基化条带，有 10 条是蓝塘猪(母
代)中独有的甲基化条带，有 9 条是杂交 F1代独有
的甲基化条带，所以共有 19 条是甲基化差异条带。
通过 Blast 发现，到目前为止，其中有 33 条在 NCBI
的 HTGS数据库中能够找到相应的猪基因组同源序
列(序列相似性达 95% － 100%) ，4 条序列到目前
为止还没有找到完全匹配的同源序列;这些甲基化
片段的基本信息见表 2。但通过分析，这些甲基化
片段的同源序列都是某条染色体上的 Working Draft
Sequence序列，在 NCBI 数据库中很难找到序列中
具体的基因信息，所以这些有同源序列的甲基化条
带也很难找到对应同源基因。本结果为将来分析亲
代及其杂种之间的甲基化差异基因的表达调控奠定
基础。
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2. 3 同源基因的获取及序列验证
通过对克隆的甲基化片段分析，其同源序列缺
乏具体的基因信息，所以，还要将这些序列放在 NC-
BI中 EST数据库中进行 Blast，结果发现其中 A18
序列的 117 bp 与猪的一条 EST 序列(序列号:
CJ017166. 1)相似性达 100%，100 bp 与猪的一条
EST序列(序列号:CJ016339. 1)相似性达 100%，98
bp与猪的一条 EST 序列(序列号:BW970248. 1)相
似性达 100%。然后应用这 3 条 EST 进行电子延
伸，根据延伸序列设计引物进行 PCR 扩增，克隆测
序得到一条 1 296 bp 序列。再将此序列在 NCBI 网
站 Nucleotide collection(nr /nt)数据库中 Blast，结果
(图 2)显示，该克隆所获得的序列与猪的类酪氨酸
蛋白激酶 Lyn基因 mRNA(Sus scrofa similar to Tyro-
sine protein kinase Lyn mRNA，序 列 号:XM _
001926250，GeneID:LOC100152890)部分序列相似
性达 100%，即认为找到了同源基因。箭头所示序
列为猪的类酪氨酸蛋白激酶 Lyn 基因 mRNA 部分
序列。该基因 CDS 长为 1 743 bp，基因组全长为
57 955 bp。通过比对发现，A18 甲基化序列与该基
因的基因组 DNA部分序列相似性为 100%，说明克
隆的 A18 甲基化序列是酪氨酸蛋白激酶 Lyn 基因
中的一个片段，位于该基因的第 7 内含子和第 8 外
显子上(甲基化的 CCGG位点位于第 8 外显子上)。
所以认为，甲基化片段 A18 的同源基因就是猪的类
酪氨酸蛋白激酶 Lyn基因。
根据 NCBI上公布的猪类酪氨酸蛋白激酶 Lyn
基因 mRNA序列设计引物，以猪的混合 cDNA 为模
板，扩增该基因的 CDS 序列来验证 NCBI 数据库中
该基因序列的准确性。PCR产物用 1. 5%琼脂糖凝
胶电泳检测(图 3) ，然后克隆测序，获得部分 CDS
序列 1 643 bp。测序结果与猪酪氨酸蛋白激酶 Lyn
基因 CDS序列进行同源比对，相似性达 99. 8%，即
为同源序列。说明 NCBI 网上公布的该基因序列的
可用性。
3 讨论
本研究从 MSAP 条带中切下的 37 个甲基化片
段中，能够回收的都是小于 500 bp，在 100 － 300 bp
左右的片段较易回收，因为小片段条带粗而清晰，容
易切胶回收，回收浓度高，较容易扩增，而大片段条
带细，切胶后经过处理损失过多，回收率很低，很难
扩增。
这些回收片段经克隆测序，并经在 NCBI 中的
HTGS数据库中 Blast后，虽然大多数都找到同源序
列，但这些序列的信息有限，很难通过这些同源序列
得到相关的基因信息，可能的原因是这些甲基化片
段包含的 CpG位点位于基因的调控(如启动子)区
的 CpG岛上，这些位点的甲基化与基因的表达调控
有密切关系，NCBI 数据中收录的启动子序列有限，
所以很难找到这些甲基化片段对应的同源基因。本
研究虽然克隆到 3 个猪群中的部分甲基化差异片
段，这些片段可能与品种的特异性状相关，但都没有
找到对应的同源基因，所以给这些甲基化差异片段
的分析带来困难。随着数据库中的猪基因组序列信
息的完善，这些片段对应的同源基因将会获得，将会
为分析父母代及其杂交一代之间基因表达的差异奠
定基础。
这些甲基化片段中，只有 1 条 3 个群体共有的
甲基化 A18 片段找到对应的同源基因，这个片段包
含的甲基化的 CpG位点位于该基因的外显子区，并
且该 CpG 位点在 3 个群体中都处于甲基化状态，
Grunau等［7］研究表明，在基因的内部或邻近区域发
生甲基化可以抑制这些基因的表达，而去甲基化又
可以激活基因的表达，本研究中的 A18 片段中的
CpG位点在 3 个群体中的甲基化状态可能也会抑制
该基因表达，猜想该位点可能是该基因的一个调控
元件。但对外显子区调控元件的研究方法报道的很
少，以至于本试验无法找到合适的方法来研究外显
子区高甲基化的 CpG位点对基因表达调控的影响。
4 结论
本研究运用 MSAP技术检测了长白 ×蓝塘猪及
其杂交 F1代 3 个群体基因组胞嘧啶甲基化，并克隆
了 3 个群体中部分甲基化差异片段及共有的甲基化
片段，并找到其中 1 条甲基化片段的同源基因。结
果表明，长蓝杂交 F1代与其父母代之间的基因组甲
基化存在异同。本研究为通过 MSAP技术克隆猪基
因组 DNA 甲基化片段及寻找其对应的甲基化基因
提供可能，也为将来研究这些甲基化基因表达调控
机制奠定基础。
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表 2 MASP片段在数据库中的同源序列
片段a 限制性片段 长度(bp) GenBank登录号 同源序列
A1 M 163 FP680582. 3 SSC 11 clone CH242-181F6
A2 M 109
CU466481. 6
CU633491. 6
SSC 15 clone CH242-418H10
SSC 15 clone CH242-180A11
A3 M 409 CU856255. 2 SSC 15 clone CH242-105N9
A4 M 206
CU633797. 2
CU856255. 2
SSC 13 clone CH242-235H14
SSC 15 clone CH242-105N9
A5 M 117 No significant homology
A6 M 115 FP312625. 2 SSC 8 clone CH242 － 175A12
A7 M 116
CU930011. 2
FP565765. 1
SSC 16 clone CH242-55K9
SSC 12 clone CH242-119G14
A8 M 110 FP312945. 2 SSC 13 clone CH242-41B12
A9 M 151 CU550662. 2 SSC 13 clone CH242-201D20
A10 M 109 CU582934. 2 SSC 1 clone CH242-100F2
A11 M 80 No significant homology
A12 M 388 No significant homology
A13 M 130
CU928700. 2
CU928650. 2
SSC 9 clone CH242-394M17
SSC 5 clone CH242-92N11
A14 M 133 CU655989. 2 SSC 12 clone CH242-259P17
A15 M 104 CU570759. 2 SSC 9 clone CH242-99E8
A16 M 198
FP236147. 4
FP312748. 3
SSC 6 clone CH242-367C11
SSC 12 clone CH242-236A2
A17 M 101 FP236147. 4 SSC 6 clone CH242-367C11
A18 M 217 CU407092. 2 SSC 4 clone CH242-518H24
B1 M 111
CU914798. 2
CU393569. 2
SSC 1 clone CH242-186J13
SSC 1 clone CH242-269N6
B2 M 85
CU633206. 2
CU651640. 2
SSC1 clone CH242-117K11
SSC 5 clone CH242-142L12
B3 M 90 CU466297. 3 SSC 10 clone CH242-461L20
B4 M 106 CU463008. 2 SSC 5 clone CH242-511E2
B5 M 71
CU694801. 3
CU972422. 2
SSC11 clone CH242-421I16
SSC11 clone CH242-177D3
B6 M 178
CU896607. 2
CU606924. 2
SSC 1 clone CH242-194M4
SSC 15 clone CH242-268G20
B7 M 98 CU571206. 2 SSC 11 clone CH242-205K3
B8 M 163 FP680582. 3 SSC 11 clone CH242-181F6
B9 M 71
CU468988. 2
CU468381. 2
CU467910. 2
SSC 7 clone CH242-228I11
SSC 7 clone CH242-149M19
SSC 7 clone CH242-139H4
B10 M 122
CU469258. 2
CU694493. 2
SSC 6 clone CH242-85F21
SSC 5 clone CH242-34O14
C1 M 122 FP565633. 1 SSC 15 clone CH242-384M23
C2 M 86 CU467806. 2 SSC 2 clone CH242-95E16
C3 M 67 CU633640. 2 SSC 13 clone CH242-164P16
C4 M 127 CU972460. 2 SSC 6 clone CH242-516P3
C5 H 155
CU914675. 2
FP565667. 1
SSC 18 clone CH242-449K18
SSC 18 clone CH242-152K15
C6 H 165 FP102436. 3 SSC 9 clone CH242-219P18
C7 H 183 CU929530. 2 SSC 8 clone CH242-276G10
C8 M 133
FP104556. 2
FP312929. 2
SSC 3 clone CH242-225P24
SSC 3 clone CH242-307D17
C9 M 101 No significant homology
a表示用 EcoR I + Hpa II和 EcoR I +Msp I两组酶切后所扩增出来的片段经克隆测序的片段，序列已在 GenBank数据库中 BLAST比对;H
和 M分别指的是用 EcoR I + Hpa II和 EcoR I +Msp I消化;片段 A1 － A18 是从所有个体中扩增得到;片段 B1 － B10 是从母代个体中扩增
得到的;片段 C1 － C9 是从杂交 F1代个体中扩增带到
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箭头所示为猪的类酪氨酸蛋白激酶 Lyn基因 mRNA部分序列
图 2 验证的电子延伸序列在 NCBI数据库中 Blast结果
M． DL2000 Marker;1－ 3. 3 个相同重复样品
图 3 猪酪氨酸蛋白激酶 Lyn基因部分 CDS扩增电泳图
参 考 文 献
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(责任编辑 李楠)
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