全 文 ：
综述与专论

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2010年第 5期
基因组文库的构建和池化筛选
陈献伟 1, 2  娜日苏 1  朱超 1, 3  王会1, 4  雷娜 1, 4
高剑峰 2  关伟军 1  马月辉1
( 1中国农业科学院北京畜牧兽医研究所,北京 100193; 2石河子大学生命科学学院,石河子 832003;
3广西大学动物科学技术学院,南宁 530004; 4山西农业大学,太谷 030801)
  摘  要:  作为物种保护策略的重要部分, 建立濒危畜禽的基因组文库, 可有效保存濒危畜禽种质资源。 BAC ( bacter ia l
artific ia l chrom osom e )文库具有高容量、遗传特性稳定和嵌合体少等优点,因而被用于畜禽基因组文库的构建。对 BAC文库的
构建方法和文库池化筛选系统作一综述。
关键词:  BAC 载体  基因组文库  池化  筛选
Construction and Screening ofGenom ic L ibrary
Chen X ianw ei
1, 2
Na R isu
1
Zhu Chao
1, 3
W angH ui
1, 4  LeiNa1, 4  Gao Jianfeng GuanW eijun1  M aYuehui1
(
1
Institute of Beijing Animal Science and Veterinary, CAAS, B eijing 100193; 2 College of L ife Science, Shihez i University, Shihezi 832003;
3
College of Animal Science and T echnology, Guangx i University, N anning 530004;
4
Shanx i Agricultural University, Taigu 030801)
  Abstrac:t  Construction of the genom ic L ibra ry of domestic anim a l as the basic component of species conse rvation strategy can
preserve endangered an im al germ plasm resources effic iently. Be ing capab le o f inse rting large fragm en ts, m a inta in ing the stability of in

serted DNA in E. coli, produc ing few chim er ism es, BAC libra ry have been con tributed to researches o f construction o f g enom ic library.
Th is pape r descr ibed the construction m ethod and screen ing system o f BAC library.
Key words:  BAC vectors Genom ic library Poo ling Screening
收稿日期: 2009
12
29
基金项目:国家科技支撑项目 ( 2006BAD13B08, 2008BADB2B 01 ) ,转基因重大专项 ( 2008ZX08009
003) , 国家 863!计划项目 ( 2006AA10Z198,
2007AA10Z170)
作者简介:陈献伟,男,硕士,主要从事分子生物学研究工作; E
m ai:l cxw ei02@ 163. com
通讯作者:关伟军,男,教授,博士生导师,主要从事动物细胞分子生物学方面研究工作; E
m ai:l w jguan86@ iascaas. n et. cn
马月辉,男,研究员,博士生导师,主要从事动物遗传资源保护方面研究工作; E
m a i:l yu ehu i
m a@ 263. net
高分子量的 DNA文库是基因组研究的基础,如
重要经济性状基因的图位克隆 [ 1 ]、比较基因组研
究 [ 2]、基因组测序及物理图谱的构建 [ 3]。 BAC载体
具有容量大、遗传特性稳定和嵌合体少等优点,非常
适合于基因组文库的构建。
1 BAC文库的研究进展
基因组文库是利用 DNA重组技术将某种生物
细胞的核 DNA的全部或大部分片段随机地连接到
克隆载体上,之后转移到适当的宿主细胞中,通过细
胞增殖而形成的各个片段的无性繁殖系的总集。
基因组文库构建的关键取决于所使用的克隆载
体。自 Cohen等 [ 4 ]构建第一个质粒载体 pSC101以
来,相继出现了大量的克隆载体。克隆载体大致可
分为噬菌体系列和人工染色体系列。前者主要包括
质粒 ( p lasm id)、噬菌体 ( bacteriophage)、柯斯质粒
( cosm id,又称粘粒 )等, 其主要特点是载体在宿主细
胞内能稳定遗传、易分离、转化效率高,但克隆容量
有限,一般小于 45 kb。许多真核生物的基因庞大而
复杂,难以克隆到这些载体中。后者主要有酵母人
工染色体 ( yeast art ific ia l chromosome, YAC )、细菌人
工染色体 ( bacterial artif icial chromosome, BAC )以及
可转化人工染色体 ( T ransformation A rt ific ia l Chromo

some, TAC)和哺乳动物人工染色体 ( mamm alian arti

fic ia l chromosome, MAC)等, 显著特点是载体的容载
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 5期
能力大,约 100- 350 kb。这些具有较大外源片段承
受能力的人工染色体对于真核生物基因组文库的构
建极为有利。
近年来得到广泛应用的克隆载体主要是细菌人
工染色体 ( BAC )。细菌人工染色体是在大肠杆菌
F
因子基础上发展而来的。F
因子的复制是严谨型
的,在每个细胞中仅有 1 - 2个拷贝, 这样就减少了
质粒所携带的外源片段发生重组的可能性,而且 F

因子能携带的外源片段可达 1mb,表明 F
因子更适
合于克隆大片段的 DNA。
BAC克隆体系的第一代载体 pBAC108L (图
1)
[ 5]。 pBAC108L能克隆的外源片段可达 300 kb,
但它存在的一个问题是只有 10% - 50%的转化子
是重组子。自从 BAC载体问世以来, 出现了许多
目的在于增加易用性和用于特定系统和环境的修
饰。 pBe loBAC11[ 5]和 pBACe3. 6 [ 6]是对 pBAC108L
进行修饰构建的载体, 通常作为进一步修饰的基
础载体 (图 2)。 pBe loBAC11代表了第二代的 BAC
克隆系统, 也是应用非常广泛的一种 BAC载体。
其外源 DNA片段的容量最大可至 300 kb以上, 可
应用于基因组文库的构建工作。主要特点是在
pBAC108L的多克隆位点上增加了 LacZ基因, 可
用于蓝白斑筛选。然而 pB eloBAC11仍是低拷贝
质粒。
图 1 pBAC108L载体
图 2 pBeloBAC11载体
Frengen等 [ 6] 构建了 pBACe3. 6载体 (图 3 )。
pBACe3. 6是在 pBAC108L 的基础上构建的, 但比
pBeloBAC11修饰程度高。此外, 它利用了不同于
pBeloBAC11蓝白斑选择的另一选择机制, 其多克隆
位点位于蔗糖致死基因 sac B上, 这样重组克隆可
以在含有蔗糖的培养基上进行阳性选择。
图 3 pBAC e3. 6载体
1997年, Ham ilton等 [ 7]结合根癌农杆菌双元载
体和 BAC载体的特点,构建了一种 双元 BAC载体
( a b inary BAC) !,即 BIBAC。 B IBAC作为第三代文
库载体, 不仅具有第二代载体的特征, 而且有植物
12
2010年第 5期 陈献伟等:基因组文库的构建和池化筛选
转化的功能。 B IBAC转化技术在双子叶植物中已
经建立, Ham ilton等 [ 8, 9]通过农杆菌介导的方法把
克隆在 B IBAC2中的完整的 150 kb大小的人类
DNA片段转进了番茄和烟草。 TAC ( transforma

t ion
competent artificia l chromosom e)也是一种直接
用于转化的人工载体 。 1999年, L iu等 [ 10]结合
PAC载体和双元载体的特点, 构建了植物可转化
基因人工染色体 TAC载体 Py ltac7和 Py ltac17。
TAC载体能在大肠杆菌和根癌农杆菌中以单拷贝
形式复制。
目前,已有人 [ 4]和一些哺乳动物的基因组 DNA
BAC文库建成,如猪 [ 11]、牛 [ 12 ]、大熊猫 [ 13]和鲶鱼 [ 14]
等动物。通过 BAC文库的构建, 不仅长久而有效地
保存动物基因遗传资源, 而且, 为进一步研究、开发
和利用其与重要经济性状、生殖和遗传性疾病相关
的功能基因,提供可靠的基因材料平台。
2 BAC文库的构建方法
基因组 DNA文库的构建流程相对简单, 但其
需要很多特殊的处理以及必要的仪器设备, 成功的
关键都体现在操作的细节上。BAC文库的构建过
程包括以下几个步骤。
2. 1 BAC载体的制备
载体制备的好坏, 直接关系到文库中空白载体
的比例和文库的质量,载体的纯度越高,获得阳性克
隆的概率越高, 文库的质量也越好。采取酶切的同
时进行彻底的脱磷处理 [ 4] , 以减少或避免空白载体
的比例,保证其符合建库要求。
载体的制备主要包括 BAC载体的大量提取和
纯化, C sCL
E tB r密度梯度离心纯化得到的超螺旋
质粒, BAC载体的后期处理 (酶切和去磷酸化 ) ,载
体脱磷效果检测,载体自连回收。
2. 2 高分子量 (HMW ) DNA的制备
由于构建 BAC文库需要得到尽可能完整的大
片段 DNA,因此, 首先要保证将细胞核包埋在琼脂
糖凝胶块中的质量,即细胞核的质量和浓度、琼脂糖
凝胶的浓度等。而且如果是组织样品, 一般使用液
氮将组织捣碎,并在整个研磨过程中使组织浸泡在
液氮中,然后包埋在低熔点琼脂糖中形成 Plugs!,
以此来保护核 DNA免受降解。
2. 3 高分子量 DNA的不完全消化
高分子量 DNA的不完全消化的目的使通过限
制性内切酶的不完全消化, 产生大量比较适合和集
中的片段,一般通过脉冲场凝胶电泳进行两次片段
选择 [ 15, 16 ]。
DNA的分离一般有一次尺度选择和二次尺度
选择 (尺度选择即脉冲电泳 ) , 在脉冲场电泳条件
下, 由于不同分子量的 DNA片段发生 共迁移 !, 在
大片段中混有很多小片段 DNA, 而这些小片段 DNA
在连接过程中效率要明显高于大片段 DNA,从而影
响基因组文库的构建质量。二次尺度选择法得到的
DNA连接转化效率较高,转化后插入的片段整齐度
好, 空载率低。为了获得纯度高、含量多的大片段、
减少大片段的降解,同时又尽可能的去除小片段,采
用二次尺度法进行大片段 DNA的分离, 按照部分酶
切所确定的最佳酶用量, 对基因组 Plugs进行大量
酶切,然后进行脉冲场电泳。
2. 4 大片段 DNA和载体的连接
大片段 DNA能否有效地连接到载体上, 主要取
决于插入片段与载体的比例, 对于不同的生物采用
的比例不同,大部分处于 1∀5- 15(摩尔比 )范围 [ 5]。
2. 5 将连接产物转化入受体细胞
对于转化大肠杆菌而言, 电转化是目前使用最
普遍的一种方法。研究表明 [ 17] , 文库中载体的平
均插入大小主要与转化效率相关。插入片度越
大,转化效率越低; 反之,越高。此外, 转化条件也
直接影响转化效率、插入片段大小及假阳性克隆
的含量。
2. 6 挑选阳性克隆、构建文库
阳性克隆的分检有人工和使用机器手技术两
种。一般通过 lacZ的插入失活,显示蓝白斑的负同
选择来筛选重组子,但是在基因组文库构建中常常
发现有 1% - 10%左右的假阳性, 用机器人操作时
假阳性更高。现在又产生了正向选择的 BAC载体
pBACe3. 6, pBAC /SACB
[ 18]
,利用 sacB的插入失活,
产生的零背景可使机器人进行挑选重组子时不必进
行菌落间的分辨,便于自动挑取收集。
2. 7 文库的保存管理与质量检测
文库构建完成后,还需要对文库进行评价,其质
量的高低标准包括文库中克隆的数量、平均插入片
13
生物技术通报 B iotechnology  Bulletin 2010年第 5期
段的大小、克隆的稳定性、细胞器 DNA的含量以及
假阳性克隆的含量等。
3 BAC文库的池化和筛选
基因组 BAC文库有数万到数十万个克隆组成,
因此建立高效的管理和筛选系统是必要的。筛选系
统有 PCR筛选系统和 Sou thern杂交筛选系统两种。
3. 1 PCR筛选系统
建立 PCR筛选系统需要对所有的克隆进行保
存和池化。整个 BAC文库由若干个超级池组成,每
个超级池有 10个 384孔板组成。将一个超级池的
行克隆、列克隆和每板的克隆分别合并成池,提取质
粒 DNA作为第二步 PCR筛选的模板,同时将 10个
板的克隆合并提取 DNA, 即有了第一步筛选超级池
的 DNA。对 BAC文库进行两步
3D筛选的过程:首
先,用目的序列的 PCR引物筛选文库的若干个超级
池的 DNA,得到阳性超级池号; 之后用阳性超级池
的板池、行池、列池的 DNA进行第二步筛选,得到阳
性的板池号、行池号、列池号;从冻存的文库中依照
筛选结果得出的克隆地址, 挑出阳性克隆, 再次做
PCR验证。
Bonet等 [ 19]构建了野草莓的 BAC文库, 共有
18 432个克隆,存于 48块 384孔板中, 压缩到 48个
96孔板中。他将每 6块 96孔板的克隆混在一起,
共形成 8个超级池。用 70个分子标记进行 PCR分
析,以超级池质粒为模板通过 PCR的方法确定含有
目的片段的阳性单克隆。W ang等 [ 20]构建了尖吻鲈
的 BAC文库, 49 152个克隆保存在 128块 384孔板
中,由 11个超级池构成, 每个超级池分成 48个 96
孔板, 对文库进行超级池、板池和行列池 3步法筛
选,用 24个微卫星和 15个 EST对文库进行 PCR筛
选表明文库具有较好的基因组覆盖率。
3. 2 HD杂交膜筛选系统
一般材料 BAC文库库容量都是数以万计, 若同
时对这些数目庞大的 BAC进行分析,非常困难。常
规 BAC文库的研究一般都是以尼龙膜为载体, 用机
械手将整个文库顺序点到膜上。将膜在固体培养基
上培养一段时间后进行菌落原位裂解,将 DNA结合
在膜上,再用特异性探针进行 Southern杂交筛选阳
性克隆。每张膜可容纳 50 000以上的克隆。一个
库用 6- 7张膜就可以包括。杂交膜筛选缺点是
Southern杂交要用到同位素 [ 21] , 存在假阳性和污
染, 放射性元素对人和环境都会产生影响, 成本
也高。
对于功能基因克隆的筛选,用 PCR筛选系统得
到的结果比从高密度杂交膜筛选系统得到的结果更
为可靠,假阳性少, 而且方法简单、快速。但是对于
构建大区域的物理重叠群, 高密度膜杂交筛选阳性
克隆可以一次得到一个标记的所有重叠克隆, 更有
利于快速的构建 BAC重叠群。
4 展望
细菌人工染色体 ( BAC )具有容量大、易于分离
和操作等特性,比其它载体系统构建的基因组文库
有更高的覆盖率和稳定性。利用 BAC文库容量大
的特点,进行基因筛选、目的基因定位、表达调控等
研究是 BAC文库利用的发展方向。BAC文库将在
动物基因资源保存、基因组学、后基因组学等研究中
发挥重要的作用。
参 考 文 献
[ 1] Qu in iou SM, W aldb ieser GC, Duke MV, et a.l A f irst generation
BAC based phys icalm ap of the channel cat fish genom e. J BMC Ge

nom ics, 2007, 8: 40.
[ 2] Jung S, M ain D, S taton M, et a.l Syn teny conservat ion b etw een the
Prunus genom e and b oth th e p resen t and an cest ralA rabidopsis ge

nom es. JBMC G enom ics, 2006, 7: 81.
[ 3] Zheb entyayeva TN, Sw ire
C lark G, Georgi LL, et a.l A fram ew ork
physicalm ap for peach, a m odel Rosaceae species. J Tree Genetics
andG enom es, 2008, 4: 745
756.
[ 4] Cook RJ, L loyd RS, W agner C. Iso lation and characterization of cD

NA clon es for rat liver 10
form yltetrahyd rofolate d ehydrogen ase. J
B io lCh em, 1991, 266 ( 8) : 4965
4973.
[ 5] Sh izuya H, B irren B, K im U J, et a.l C lon ing and stab lem ain tenan ce
of 300
k ilobase
pair fragm en ts of hum an DNA in Esch erich ia col iu

sing an F
factor
based vector. J Proc NatlA cad S ciUSA, 1992, 89:
8794
8797.
[ 6] Frengen E, W eiehenhan D, Zhao B, et a1. A m odu lar, pos it ive selec

tion bacterial artif icial ch rom osom e vector w ith m u ltip le cloning
sites. Gen om ics, 1999, 58( 3) : 250
253.
[ 7 ] H am ilton CM. A b inary
BAC system for plant transform at ion w ith
h igh
m olecu lar
w eight DNA. G ene, 1997, 200: 107
116.
[ 8] H am ilton CM, Lew isC, et a.l Stab le tran sfer of intact h ighm olecu lar
w eight DNA into plan t chrom osom es. Proc Nat l A cad Sci USA,
1996, 93 ( 18) : 9975.
[ 9] H am ilton CM, Frary A, Xu Y Tanks ley SD, Zhang H B. Construction
14
2010年第 5期 陈献伟等:基因组文库的构建和池化筛选
of tomato genom ic DNA libraries in b iN ary
BAC ( B IBAC ) vector.
P lant J. 1999, 18: 223
229.
[ 10 ] L iu YG, Sh irano Y, Fukak iH, et a1. Com p lem en tat ion of p lan tm u

tan tw ith large genom ic DNA fragm en ts by a transformat ion
compe

ten t art ificial ch rom osom e vector accelerates positional clon ing.
PNAS, 1999, 96( 11 ): 6535
6540.
[ 11 ] Rogel
Gaill C, Bou rgeaux N, B illau lt A, et a.l Con struction of a
sw ine BAC lib rary: appl icat ion to the characterizat ion and m app ing
of porcine typ e C endoviral elements. J Cytogenet C ell Genet,
1999, 85: 205
211.
[ 12 ] E ggen A, Gau tier M, B illaut A, et a.l Con struction and character

ization of a bovine BAC l ibrary w ith four genom e
equ ivalen t cover

age. J Genet Sel Evo,l 2001, 33: 543
548.
[ 13 ] L iuW, Zhao YH, L iu ZL, Zhang Y, et a.l C onstru ct ion of a 7
fold
BAC lib rary and cytogeneticm app ing of10 genes in the giant panda
(A ilu ropoda m elanoleu ca ) . J BMC Genom ics, 2006, 7: 294.
[ 14 ] Qu in iou SM, W aldb ieser GC, Duke MV: A first generat ion BAC

based physicalm ap of the chann el catfish genom e. J BMC G enom

ics, 2007, 8: 40.
[ 15] K im U J, B irren BW, S lepak T, et a.l Construction and ch aracteriza

t ion of a hum an bacterial art ificial ch rom osom e l ibrary. J G enom

ics, 1996, 34: 213
218.
[ 16] Zhang Y, Zhang X, S cheuring CF, et a.l Con struction and ch arac

terizat ion of tw o bacterial art ificial ch rom osom e libraries ofZ hikong
sca llop ( Ch lamys farreri Jon es et Preston ) , and iden tification of
BAC clones con ta in ing the genes involved in its innate immune sys

tem. JM ar B iotechno,l 2008, 10: 358
365.
[ 17] Tao QZ and Zh ang HB. C lon ing and stab le ma intenan ce of DNA
fragm ents over 300 kb in E sch erichia coli w ith conven tional p las

m id
based vectors. J Nucleic AcidsR es, 1998, 26: 4901
4909.
[ 18] B endahmane A. Zero
background p lasm id vector for BAC lib rary
con struction. J B ioTechn iques, 1999, 26( 2 ): 228
230, 232.
[ 19] Bonet J, G irona EL, SargentD J, et a.l The developm en t and ch arac

terisat ion of a bacterial art ificial ch rom osom e lib rary for F ragaria
vesca. J BMC ResNotes, 2009, 2: 188.
[ 20] W ang CM, Lo LC, Feng F, et a.l Con struction of a BAC lib rary and
m app ing BAC clones to th e linkage m ap of Barramund ,i La tes ca l

carif er. J BMC Genom ics, 2008, 9: 139.
[ 21] Feng J, V ick BA, LeeMK, et a.l Con struction of BAC and BIBAC
l ibraries from sun flow er and ident ification of link age group
sp ecific
clon es by overgo hyb rid izat ion. JTheor App lGenet, 2006, 113: 23

32.

科学出版社新书

病毒学精要概览 (双语版 )
(英 ) T .斯科恩  著, 朱俊萍  李相辉  安静  译
978
7
03
026886
7
50. 00 2010年 3月出版
内容简介: 本书是 Co ffeeH ouse Notes on V iro logy一书的中英双语版本,内容涵盖了病毒学的
基本原理、概念以及与病毒学密切联系的学科中各项热点议题, 例如:病毒和肿瘤、病毒和免疫系
统、病毒进化及新病毒等。书中丰富的病毒实例几乎囊括了医学病毒学中所有重要的类群和相关
医学问题。本书语言极其精炼、简单,以解答 75个问题的形式阐释了病毒学中最普遍的性质和规
律, 为庞杂丰富的病毒学世界搭建起一个精要概括的知识框架。
相信该书有助于普通高等学校和医学高等院校相关专业的本科生、研究生、教师以及相关领
域的科研人员在最短的时间内学习和掌握病毒学的基本原理和事实。更希望通过对本书的阅读,
激发起读者探索病毒学世界的兴趣。
欢迎各界人士邮购科学出版社各类图书 (免邮费 )
邮购地址: 北京东黄城根北街 16号  科学出版社  科学出版中心  生命科学分社
邮编: 100717 联系人: 周文宇 ( 010- 64031535)
网上订购: www. dangdang. com  www. joy. com  www. amazon. cn www. be ifabook. com
更多精彩图书请登陆网站 http: / /www. lifescience. com. cn, 欢迎致电索要书目
15