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研究报告

生物技术通报
BIOTECHNOLOGY
BULLETIN 2011年第 1期
棉花抗逆相关基因 GhDr1的克隆及生物信息学分析
丁忠涛
张锐
郭三堆
(中国农业科学院生物技术研究所 国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程,北京 100081 )


摘
要:
通过 TAIL-PCR的方法从棉花中克隆到未知功能的新基因 GhD r1, 生物信息学分析结果表明, GhD r1的预测蛋
白含有酪氨酸激酶和蛋白酶 C磷酸化位点、潜在的锌指类功能模块、MAPK磷酸化位点及 MAPK相互作用识别位点;与 GhDr1
同源基因位于同一基因簇的基因多为参与逆境信号转导的蛋白。推测 GhD r1基因可能在逆境信号转导途径的磷酸化级联反
应中被调节, 参与棉花逆境应答的生理过程。
关键词:
生物信息学
棉花
GhD r1基因
TAIL-PCR
抗逆
Cloning and B ioinformatics Analysis of Cotton Gene GhDr1
Related to Resistance to Abiotic Stresses
Ding Zhongtao
Zhang Rui
Guo Sandui
(B iotechnology R esearch Institute, ChineseA cademy of Agricultural Sciences,
N ationalK ey Facility forCrop G ene Resources and Genetic Imp rovement, Beijing 100081)


Abstrac:t
W e cloned a new cotton gene GhDr1 o f unknown function by them ethod of TA IL-PCR. The b io in fo rm atics ana lysis re-
su lts w ere as fo llow s: phospho ry lation sites o f ty rosine k inase and prote in C ex ist in the pred icted pro te in sequence o f GhDr1; poten tia l
zinc- finger func tiona lm oti,f MAPK phospho ry lation sites andMAPK in terac tion docking mo tif a re also found in the pred icted prote in se-
quence o fGhD r1; the genes located in the sam e gene c luste rw ith the hom o logous genes ofGhDr1 aremostly invo lved in signal transduc-
tion pathw ays o f ab io tic stresses. So w e speculated GhDr1 m ay be regu la ted in the phosphory lation cascade o f signa l transduction path-
w ay s and partic ipate in the phy sio log ical process in response to ab io tic stresses o f co tton.
Key words:
B io informa tics
Cotton
GhDr1 gene
TA IL-PCR
Resistance to ab io tic stresses
收稿日期: 2010-06-11
基金项目:农业部国家转基因重大专项 ( 2008ZX005-004)
作者简介:丁忠涛,男,硕士研究生,研究方向:植物基因工程; E-m ai:l d ingzhongtaoch ina@ 126. com
通讯作者:郭三堆,男,研究员,博士生导师,研究方向:植物抗虫基因工程; E-m ai:l gsdu@i m ai.l caas. net. cn
植物在受到环境胁迫时,能够通过代谢反应来
阻止、降低或修复由逆境造成的损伤以保持正常生
理活动的特性称为植物的耐逆性, 植物的耐逆性通
过细胞信号转导途径完成。植物细胞上的信号受体
捕捉非生物逆境信号后在细胞内产生第二信使 [ 1 ] ,
第二信使介导 MAPK和 CDPK等信号路径的蛋白磷
酸化, 级联反应激活下游一系列转录因子表达,转录
因子又特异地激活应答胁迫的靶基因, 产生使细胞
免受胁迫伤害的物质, 以增强植物对胁迫的耐受能
力。处于逆境信号转导通路上的蛋白会影响植物对
非生物逆境的耐受性。目前已有相当多的植物抗逆
相关调节基因或功能基因被克隆出来, 采用基因工
程的方法调控这些基因的表达, 可以改良植物的抗
逆性状。
本实验室先前在克隆棉花抗逆相关基因的过程
中扩增到了陆地棉可能与逆境相关的 346 bp基因
片段, 本研究在此基础上通过 TA IL-PCR技术获得
了一个未见报道的棉花基因 GhDr1的基因组及 cD-
NA序列。由于 GhDr1在其他物种中的同源基因少
有研究, 本研究希望通过生物信息学技术, 预测
GhD r1蛋白的氨基酸序列组成、理化性质、跨膜结
构、胞内定位、功能域,构建系统进化树并根据同源
基因所在染色体区域上下游基因功能等方面的信
息, 综合分析预测 GhD r1基因的功能。
生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 1期
1
材料与方法
1. 1
材料
1. 1. 1
DNA模板
改良 CTAB法 [ 2]提取本实验室
自育的陆地棉品种 Y18的基因组 DNA, 用于克隆
GhDr1的基因组序列。
1. 1. 2
RNA模板
改良的热硼酸法 [ 3]提取陆地棉
品种 Y18的花蕾 RNA,反转录后用于克隆 GhD r1的
cDNA序列和作为 RT-PCR的模板。
1. 1. 3
质粒、载体与菌株
大肠杆菌菌株 E. coli
TOP10、T4 DNA连接酶、载体 pGEM-T easy购自 Pro-
mega公司, PCR 试剂购自 GeneStar公司, LA Taq
DNA聚合酶、ExTaq DNA聚合酶购自 TaKaRa公司。
琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生物技术公司,反转
录试剂盒为 TOYOBO公司的 ReverTra A ce-
-反转录
试剂盒。DNA M arker为 MB I公司 DNA LadderM ix#
SM0331,引物合成由上海生工生物工程技术服务有
限公司完成,其它化学试剂均为国产或进口分析纯。
1. 2
方法
1. 2. 1
TA IL-PCR ( thermal asymmetric interlaced
PCR)
[ 4, 5]
在已知的基因片段上设计 3组 TA IL-PCR
的嵌套特异性引物 SP1、SP2和 SP3,在 cDNA序列上
设计 3组 TA IL-PCR的嵌套特异性引物 cFSP1、cFSP2
和 cFSP3,与两种简并引物 AD1和 AD2组合, 分别以
棉花 Y18的基因组 DNA和花蕾总 RNA反转录生成
的 cDNA为模板进行 TA IL-PCR反应。第 1轮 PCR
反应包括 5次高严谨性反应 ( 94
变性 30 s, 60
退
火 60 s, 72
延伸 2m in)、1次低严谨性反应 ( 94
变
性 30 s, 25
退火2m in, 72
延伸 2m in)和 15次热不
对称的超级循环 ( 94
变性 30 s, 60
退火 60 s, 72

延伸 2 m in, 94
变性 30 s, 60
退火 60 s, 72
延伸
2 m in, 94
变性 30 s, 44
退火 60 s, 72
延伸
2 m in)。第 2轮反应将第 1轮反应的产物稀释 100
倍作为模板进行 15次热不对称的超级循环 ( 94
变
性 30 s, 61
退火 60 s, 72
延伸 2 m in, 94
变性 30
s, 61
退火 60 s, 72
延伸 2 m in, 94
变性 30 s, 44

退火 60 s, 72
延伸 2m in)。第 3轮反应将第 2轮反
应的产物稀释 100倍作为模板同样进行 15次热不对
称的超级循环,反应参数同第 2轮。
1. 2. 2
在线生物信息学数据库及软件
根据 NC-
B I、EB I、GenBank、EXPACY和 So ftberry等 [ 6]网站提
供的各种在线生物信息学软件进行综合分析, 部分
分析程序如下:用 Protparam和 ScanSite pI /Mw程序
分析编码蛋白的氨基酸序列组成、相对分子量和等
电点等理化特性;用 SOPMA [ 7]程序预测基因编码蛋
白的二级结构; 用 ProtSca le和 TM pred软件分析蛋
白质的亲疏水性和预测跨膜区; 用 PSORT[ 8]软件对
蛋白的亚细胞定位特性进行预测; 用 SignalP3. 0程
序预测蛋白序列中潜在信号肽序列; 用 N etPhos2
0
预测蛋白序列中潜在的磷酸化位点; 用 PROSCAN、
ELM、SMART和 MotifScan预测基因编码蛋白序列
上潜在的功能域位点。同源序列的检索在 NCBI的
BLAST服务器上运行。
表 1
PCR所用引物
用途 类型 引物序列 ( 5
- 3
)
TAIL-PCR 嵌套特异性引物 SP1: GTCTGCCAAATTACTTGC-

TAACTCTGACTC
SP2: GGATGAAGCTTCCGTAAC-


AGCCACT
SP3: GTCCATGTCAGGTAGTGC-


CTGTACTGCT
cFSP1: CTCCATATATAATACC-



CAGATCATCGTAG
cFSP2: TCATCCCAGATTTTATT-



CTCGGC
cFSP3: TCACCATTTGTCGAG-



TCGAATCCCAG
随机简并引物 AD1: TCTT ICGNAC ITNGGA
AD2: TTG IAGNAC IANAGG
RT-PCR
上游引物 RT-F1: AATACGAGATGGATGT-



GCTG
下游引物 RT-R1: CTTGCTAACTCTGACTC-



TACTCACTG
2
结果与分析
2. 1
基因组 GhD r1基因的克隆
本实验室在克隆棉花抗逆相关功能基因的过程
中,通过 3
-RACE获得了 346 bp的基因片段, BLASTn
结果显示,该片段与拟南芥预测蛋白 Drough-t respon-
sive fam ily protein同源性达 78%。故将此基因片段
暂命名为 GhDr1( Gossyp ium hirsutum drough-t respon-
sive 1)片段,并推测完整基因可能参与棉花抗逆相
100
2011年第 1期



丁忠涛等:棉花抗逆相关基因 GhDr1的克隆及生物信息学分析
关生理过程。
为了获得全长 GhD r1基因组序列, 在 346 bp
GhD r1基因片段 5
端区域设计了 3个 TA IL-PCR嵌套
特异引物 SP1、SP2和 SP3, 分别与随机引物 AD1和
AD2配组, 以棉花基因组 DNA为模板, 经过 3轮
TA IL-PCR热不对称温度循环分级反应,分别获得了
1. 8 kb和 3. 0 kb的阳性条带 (图 1)。测序分析表明,
1. 8 kb的序列包含于 3. 0 kb的序列中, 经序列拼接
后,最终获得长为 3 341 bp的 GhD r1基因组片段。
1- 3.分别为特异引物 SP1、SP2和 SP3与随机引物 AD1
的 3轮 TA IL-PCR反应的电泳结果; 4 - 6.分别为 SP1、
SP2和 SP3与随机引物 AD2的 3轮 TAIL-PCR反应的电
泳结果
图 1
GhDr1的基因组 TA IL-PCR
2
2
GhDr1基因的克隆及结构分析
将 3 341 bp的 GhD r1基因组序列提交到 GRAL
网站进行预测,获得了可能的基因外显子区序列,并
以其 5
-末端和 3
-末端序列设计 RT-PCR正反向引
物 RT-F1和 RT-R1,以热硼酸法提取的陆地棉 Y18
花蕾 mRNA经反转录后生成的 cDNA为模板, 扩增
获得了 1
4 kb的特异 cDNA片段 (图 2-A )。
鉴于最初 346 bp的基因片段已经包含了 GhDr1
的 cDNA序列 3
-UTR区, 为了获得其全长 cDNA序
列,在上述获得的 1
4 kb cDNA序列 5
端再设计 3个
嵌套特异 TA IL-RTPCR引物 cFSP1、cFSP2和 cFSP3,
以同样的花蕾 cDNA为模板经 3轮 TA IL-PCR热不对
称温度循环分级反应,最终获得 500 bp cDNA序列
(图 2-B) , 测序拼接后最终得到长为 1 913 bp的
GhDr1基因。
A: M. M arker; 1.花蕾 cDNA 为模板, RT-F1和 RT-R1为
正反向引物的扩增结果。B: 1- 3. 分别为特异引物 cF-
SP1、cFSP2和 cFSP3与随机引物 AD1的 3轮 TA IL-PCR
反应的电泳结果; 4 - 6. 分别为 cFSP1、cFSP2和 cFSP3
与随机引物 AD2的 3轮 TAIL-PCR 反应的电泳结果;
7 - 9.分别为特异引物 cFSP1、cFSP2、cFSP3与随机引物
AD1的另一次 3轮 TA IL-PCR反应的电泳结果;第 3泳
道的较亮条带为阳性结果
图 2
RT-PCR( A)和 TAIL-PCR (B)
获得 GhD r1基因的 cDNA序列
将 GhD r1基因的 cDNA 1 913 bp序列和基因组
序列进行同源性比对,发现 GhDr1基因由 4个外显
子和 3个内含子组成。如图 3所示, GhDr1基因的
外显子总长度为 1 485 bp, 4个外显子中最大的为第
4外显子 ( 587 bp) ,最小的为第 2外显子 ( 94 bp) , 3
个内含子中最大的为第 2内含子 ( 659 bp), 最小的
为第 1内含子 ( 76 bp)。
FGENESH预测基因的转录起始位点在翻译起
始位点 ATG上游 492 bp处, 符合 PyPyANT /APyPy
的特征, 并在其上游 - 30 bp和 - 70 bp处有 TATA
盒、CCAAT盒等启动子特征序列。 cDNA序列 3
端
Po ly( A)结构位于终止密码子后 160 bp处。从基因
结构来看, GhD r1符合典型的真核生物基因结构。
图 3
GhD rl的基因结构示意图
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 1期
2
3
GhDr1蛋白的理化性质
GhDr1基因的 cDNA经 V ectorNTI 10软件、ORF
finder和 Softberry的 BESTORF程序预测, 其 CDS区
均为 1 485 bp,且位置相同。因此推断, GhD r1的编
码区全长为 1 485 bp,编码 494个氨基酸残基。Pro-
tparam和 ScanS ite pI/Mw在线分析结果表明, 推断
的 GhD r1蛋白分子式为 C2498H 3920N 698O775 S28,分子量
约为 57
028 kD, 等电点为 5
36。其氨基酸成分组
成见表 2, 含量较多的氨基酸包括 Leu、Asp、Arg、
G lu、Lys、Ser、Thr等。碱性带正电荷的氨基酸 ( K、
R)共 66个, 酸性带负电荷的氨基酸 ( D、E )共 77
个,整个蛋白为带负电酸性蛋白质。预测不稳定指
数为 37
02,半衰期大于 10 h,属于稳定蛋白。
表 2
GhD r1序列中各种氨基酸的数量和所占比例
氨基酸
种类 数量
所占比例
(% )
氨基酸
种类 数量
所占比例
(% )
A la( A) 26 5
3 Leu( L ) 41 6
3
A rg( R) 30 6
1 Lys( K) 36 7
3
A sn (N ) 34 6
9 M et(M ) 17 3
4
A sp (D ) 49 9
9 Phe( F) 18 3
6
Cys( C) 11 2
2 Pro( P) 21 4
3
G ln (Q ) 21 4
3 S er( S) 27 5
5
G lu ( E ) 28 5
7 Thr(T ) 28 5
7
G ly( G) 21 4
3 Trp (W ) 9 1
8
H is(H ) 7 1
4 Tyr( Y) 16 3
2
Ile( I) 26 5
3 V al(V ) 28 5
7
2
4
GhDr1的亲疏水性、亚细胞定位预测
ProtScale预测 GhDr1氨基酸序列的亲疏水性结
果 (图 4-A )表明, GhDr1氨基酸序列第 461位的 A la分
值最高为 1
889,疏水性最强;第 407位的 Gly分值最低
为- 3
056,亲水性最强。GhDr1的整个氨基酸序列中
亲水性氨基酸明显多于疏水性氨基酸,且在337- 415位
存在集中亲水区。用 SPLIT4
0、TMHMM及 TM pred
程序也均没有发现该蛋白有明显的疏水区域和跨膜
结构。TM pred软件预测 GhDr1蛋白跨膜区的结果 (图
4-B),没有发现由内向外或由外向内的跨膜螺旋。Pro-
tparam预测 GhDr1蛋白的亲水性平均数 ( GRAVY )为
- 0
657,即该蛋白是水溶性的。PSORT预测 GhD r1定
位于细胞质的分值为 5
0,可能性最大, 其次定位于线
粒体、叶绿体和细胞核,分值均为 2
0,据此推测 GhDr1
为胞质蛋白。另外,经 SignalP3
0程序预测 GhDr1蛋
白序列中无明显的信号肽序列,因此最终推测 GhDr1
蛋白是细胞质内的可溶亲水性蛋白。
2
5
GhDr1的二级结构、三级结构预测
用 SOPMA软件预测 GhD r1蛋白的二级结构,
结果 (图 5)表明, 该蛋白
螺旋区为 201个氨基酸,
占 40
69%;延伸链为 50个氨基酸, 占 10
12%;
-
转角为 21个氨基酸,占 4
255%;无规则卷曲为 222
个氨基酸, 占 44
94%。
螺旋区组成该蛋白主体
结构,而较多的
-转角和无规则卷曲则可能构成蛋
白特异功能区域。在进行 GhD r1的三级结构预测
时, 由于同源蛋白均为没有研究的功能未知蛋白,所
以不能通过同源建模分析高级结构,只是通过 CPH-
models-3
0 Server预测了 GhDr1的同源蛋白序列中
比较保守的 N端部分的蛋白空间三维结构 (图 6),
主要由
螺旋和无规则卷曲构成, 这一空间结构很
可能促成特定的催化活性中心等功能域的形成。
A图中横坐标为氨基酸位点,纵坐标正值代表疏水性,负值代表亲水性; B图中实线为由内向外的跨膜螺旋值,虚线为由外向内的
跨膜螺旋值,分值超过 500为显著性结果
图 4
GhDr1蛋白的亲疏水性 (A )和跨膜区 ( B)预测
102
2011年第 1期



丁忠涛等:棉花抗逆相关基因 GhDr1的克隆及生物信息学分析
A. GhDr1序列中各二级结构单元的具体位置,其中 h为
-螺旋, e为延伸链, c为无规则卷曲, t为
-转角; B. GhDr1的二级结构示
意图,其中竖线长度由长至短分别表示为
-螺旋,延伸链,
-转角,无规则卷曲
图 5
GhDr1的二级结构预测
图 6
CPHmodels-3
0 Server预测 GhDr1的 N端
81个氨基酸残基的空间三维结构示意图
2
6
GhDr1的同源比对和系统进化树分析
使用 B lastp程序对 GhD r1预测蛋白的氨基酸序
列进行同源性检索, 结果显示, GhDr1与以下 Gen-
Bank注册号的蛋白同源性较高:蓖麻 (R icinus commu-
nis)的 XP _002523138
1蛋白;葡萄 ( Vitis vinif era)的
XP _ 002269324
1 蛋白、CBI36907
1蛋白 和 XP _
002280943
1蛋白;毛果杨 (Populus trichocarpa)的 XP_
002301492
1蛋白;拟南芥 (Arabidop sis thaliana )的 NP_
567224
1蛋白和 AAC78711
1蛋白。它们与 GhDr1
的同源性分别为 61%、57%、55%、49%、56%、49%和
49%。从同源性比对的结果 (图 7-A)来看, GhDr1与其
同源蛋白总体同源性较高, 在 GhDr1氨基酸序列的
20- 147位、199- 324位和 437- 492位与其同源蛋白有
最高的相似性,说明这些区域在进化上比较保守,可能
与这一蛋白家族的功能关系密切。从分子聚类分析的
结果 (图 7-B)来看, GhDr1与蓖麻的 XP_002523138
1
蛋白和毛果杨的 XP_002301492
1蛋白亲缘关系最近。
而在进化上的亲缘关系,棉花与葡萄、毛果杨、蓖麻也
较近。GhDr1与上述蛋白间的同源性关系与这些物种
间进化上亲缘关系是相符的。
2
7
GhDr1的功能域预测
GhD r1蛋白含有比普通蛋白质更多的丝氨酸和
苏氨酸,推测 GhD r1蛋白可能含有较多的潜在磷酸
化位点。用磷酸化位点预测程序 NetPhos 2
0分析
GhD r1蛋白 (图 8) ,发现有 10个潜在的 Ser磷酸化
位点、7个潜在的 Thr磷酸化位点、7个潜在的 Tyr
磷酸化位点。总体 GhDr1蛋白中磷酸化位点比正
常蛋白多出许多, 推测 GhD r1蛋白功能的发挥可能
与激酶磷酸化有关。
用 MotifScan和 PROSCAN程序预测 GhDr1编码
蛋白序列上潜在的功能域位点, 结果表明,该蛋白存
在的翻译后修饰位点包括 3个 N-糖基化位点、8个酪
氨酸激酶 II磷酸化位点、3个 N-豆蔻酰化位点、5个
蛋白激酶 C磷酸化位点。GhDr1的同源蛋白也存在
这些同样的 motif区域。这些翻译后修饰位点在植物
抗逆相关蛋白如 Na+ /H+逆向运输蛋白 [ 3]中被发现。
103
生物技术通报 B iotechnology
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图 7
GhD r1与其同源蛋白的同源性比对 ( A)和分子系统进化树 (B )
Ser磷酸化位点; Thr磷酸化位点; Tyr磷酸化位点
图 8
N etPhos 2
0 Server预测 GhD r1的磷酸化位点


SMART预测结构模块时发现, GhDr1蛋白含有
RINGv、MADF、PHD、Zn _dep _PLPC、Zn f_C2HC、z-f
AD、R ING等同源性偏低的锌指类功能相关模块。
SBASE预测也发现在 GhDr1蛋白的 319- 337位存
在 Z inc finger, R ING-type- like domain。 SMART预测
同样在 GhDr1的同源蛋白中发现较多同源性偏低
的锌指类模块,说明 GhDr1及其同源蛋白可能为一
类较新的锌指类蛋白。
ELM预测 GhD r1蛋白序列中 58- 67位、470 -
479位含有 MAPK相互作用识别位点, 14- 20位、
321- 327位、353- 359位、355- 361位存在 MAPK
磷酸化位点。推测 GhDr1参与 MAPK信号转导路
径的磷酸化级联反应。
另外,本实验室在分析了多个棉花 BAC克隆子
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2011年第 1期



丁忠涛等:棉花抗逆相关基因 GhDr1的克隆及生物信息学分析
后,发现位于同一基因簇上的相邻基因,在功能上也
很可能相互关联。因此, 本研究分析了已经全基因
组测序的拟南芥和葡萄基因组上的 GhD r1同源基
因簇, 希望籍此能更全面地推断 GhDr1的生物学功
能。M ap V iew er分析拟南芥中同源 NP _567224
1
蛋白的上下游基因, 有参与信号级联的 PHD型锌指
C1-like蛋白激酶、参与反式高尔基体网络的突触融
合蛋白 -t SNARE、含有 C2H2型锌指的 D i19( Drought
induced)蛋白、定位于胞质的 MYND型锌指蛋白等,
这些蛋白均是参与植物逆境反应和信号转导相关的
功能蛋白。葡萄与棉花的亲缘关系更近,其 GhDr1同
源 XP_002269324
1蛋白基因簇MapV iew er分析结果
(表 3)也表明,上下游基因中有参与信号转导的 Ca2 +
结合蛋白、磷脂酰肌醇样 COBRA-like蛋白, 并且还有
与拟南芥同源基因簇中相同的 D i19、-t SNARE等, 说
明这一基因簇结构比较保守。这一结果也从另一个
方面说明了 GhDr1很可能参与棉花逆境反应和信号
转导。
表 3
MapV iew er预测 GhDr1同源蛋白
基因簇上下游基因的功能
GhDr1同源蛋白基因簇
上下游基因 基因功能
拟南芥 NP_567224
1
蛋白上下游基因
C2H 2型锌指蛋白 Di19 (D rought in-
duced 19)

反式高尔基体网络植物突触融合
蛋白 t-SNARE
磷脂酰肌醇样 COBRA- like蛋白

PHD型锌指,参与信号级联, 蛋白
激酶 C, C 1-l ike
MYND型锌指蛋白,定位于胞质

含有参与决定花形成的 MADS盒
的转录因子
葡萄 XP_002269324
1
蛋白上下游基因功能
D i19蛋白
t-SNARE突触融合蛋白的 N端结
构域
COBRA-like蛋白,磷脂酰肌醇样
含有 C a2+结合蛋白同源结构域,可
参与信号转导途径
含有信号接收域的、N端有 DNA结
合域的蛋白
3
讨论
植物对干旱、低温和盐碱等非生物逆境胁迫的应
答普遍存在,植物处于逆境环境条件时能够通过信号
转导调节相关基因的表达。逆境信号首先被植物细
胞上的 G蛋白偶联受体、组氨酸激酶、细胞膜离子通
道蛋白等逆境信号受体感知 [ 1]。这些信号受体介导
在植物细胞内产生内源 ABA、IP3、PLC /PLD、ROS、
DAG、活性氧、Ca2+等种类的第二信使。这些第二信
使可以引起蛋白磷酸化级联物 MAPK、CDPK、C IPK
等信号转导途径蛋白质磷酸化,级联反应将逆境信号
放大, 并最终将处于通路下游的 MYB /MYC、AP2 /
EREBP、NAC、锌指类、bZIP等转录因子 [ 10, 11 ]直接激
活,特异性地启动渗透调节因子、胚胎晚期发生丰富
蛋白 ( LEA蛋白 )、抗冻蛋白、热激蛋白、水通道蛋白、
活性氧清除酶类等应答非生物胁迫的靶基因大量表
达。通过这样的信号转导过程最终能使植物适应并
耐受非生物逆境。
植物在非生物逆境条件下主要的信号传导通路
有 3条 [ 1] : 不依赖 Ca2+的 MAPK路径、Ca2+偶联的
CDPK信号路径和依赖 Ca2+的 SOS信号路径。传
导信号的关键分子 MAPK和 CDPK都是保守的 Ser /
Thr蛋白激酶。MAPK s是一个较大的 Ser /Thr蛋白
激酶家族,非生物逆境信号被细胞信号受体感知后
通过激酶级联反应激活 MAPK, MAPK可以将底物
序列上 ( Ser /Thr) Pro位点的 Ser或 Thr磷酸化,最终
激活下游转录因子、细胞骨架相关蛋白、酶类等。但
由于 80%的蛋白序列中, 都含有 ( Ser/Thr) Pro位
点, MAPK s与底物特异性结合时还需要相互作用识
别位点 [ 12] ,特征序列为底物蛋白序列上的氨基酸短
序列,如 ( R /K ) XXXX# X#, 其中#为疏水性氨基酸,
XXXX ( 2- 6个任意氨基酸串联 )常含有可以形成
转角或终止螺旋的 Pro、A sn或 G ly[ 13]。
本研究克隆到未知功能的新基因 GhDr1后通
过生物信息学分析预测, GhDr1为细胞质内的可溶
亲水性蛋白。磷酸化位点预测发现, GhD r1序列中
有 10个潜在的 Ser磷酸化位点、7个潜在的 Thr磷
酸化位点,因此推测 GhD r1蛋白功能的发挥可能与
激酶磷酸化有关。翻译后修饰位点预测, 在 GhD r1
序列中发现了其他抗逆相关蛋白序列中普遍存在的
酪氨酸激酶 II磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、蛋白
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生物技术通报 B iotechnology
Bulletin 2011年第 1期
激酶 C磷酸化位点等修饰位点。
ELM功能域预测在 GhDr1蛋白序列的 14- 20
位、321- 327位、353 - 359位、355- 361位发现了
MAPK磷酸化位点 ( Ser /Thr) Pro序列, 同时在 58-
67位和 470- 479位发现符合 ( R /K) XXXX#X#氨基
酸短序列规则的 MAPK相互作用识别位点。因此
推断, GhDr1在逆境信号转导的 MAPK路径中作为
MAPKs的底物被磷酸化参与抗逆相关生理过程。
另外,本实验室已经将 GhDr1基因在模式植物拟
南芥中过量表达,以进一步分析该基因的生理功能。
参 考 文 献
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(责任编辑
马鑫 )
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