全 文 ：·研究报告·
生物技术通报
B IO TECHNOLOGY　BULL ETIN 2009年第 10期
凹甲陆龟沙门氏菌的分离鉴定及
毒力因子基因的 PCR检测
黄道超 1, 2 　姜波 2 　杨光友 2, 3 　牛李丽 3 　王强 3
余星明 3 　邓家波 3 　赵波 3 　陈维刚 3
(1重庆医科大学附属儿童医院 动物实验中心 ,重庆 400014; 2四川农业大学 动物疫病与人类健康四川省重点实验室 ,
雅安 625014; 3成都动物园 ,成都 610041)
　　摘 　要 : 　从成都动物园因腹泻死亡的凹甲陆龟体内分离到一株病源菌 ,经选择性分离培养、生化试验、血清型鉴定等 ,
确定该病源菌为 D群肠炎沙门氏菌 ,其抗原结构式为 1, 9, 12∶g, m∶- 。该菌株对小鼠有较强的致病性 ,能引起人工感染小鼠
大量死亡 ,且从其体内分离到相同特性的菌株 ;药物敏感性试验证实该分离菌对头孢曲松、氧氟沙星、卡拉霉素、多粘菌素、复
方新诺明、呋喃唑酮等敏感 ,对链霉素、四环素、氯霉素等耐药 ;同时根据 GenBank中已报道的沙门氏菌毒力因子 ivnA和 ivnE
的基因序列 ,设计两对特异性引物对该菌进行 PCR检测 ,结果在该菌中成功扩增并检测出 ivnA和 ivnE基因。本试验尝试了
沙门氏菌的 PCR检测方法 ,为该分子诊断技术的全面推广奠定了良好基础 ,也为今后该疾病的预防、诊断和治疗提供了科学
的实验数据。
关键词 : 　凹甲陆龟 沙门氏菌 分离 鉴定 毒力因子基因 PCR
Isola tion and Identif ication of Sa lm onella in M anouria im pressa and
Detection of Virulence Factor Gene by PCR
Huang Daochao1, 2 J iang Bo2 Yang Guangyou2, 3 N iu L ili3 W ang Q iang3
Yu Xingm ing3 Deng J iabo3 Zhao Bo3 　Chen W eigang3
(1 Departm ent of Anim al Experim ental Center, Affiliated Children’s Hospita l of Chongqing M edical University, Chongqing 400014;
2 Key Laboratory for Anim al D isease and Hum an Health of S ichuan Province, S ichuan Agricultural University, Ya’an 625014;
3 Chengdu Zoo, Chengdu 610041)
　　Abs trac t: 　A bacteria strain of Sa lm onella was isolated from a deadM anouria im pressa suffered with diarrhea in Chengdu2Zoo. Af2
ter culture, isolation, biochem ical reaction and serological test, it was identified as Salm onella enteritid is of group D, and its antigenic
structural formula was 1, 9, 12: g, m: - . The strain with high pathogenicity caused mass mortality of mouses infected artificially, and
the same strain was isolated from dead mouses. In drug sensitivity test, the strain was sensitive for ceftriaxone, Ofloxacin, kalamycin,
polymyxin, SMZ2TMP, furaltadone, and resistant for phytomycin, ambramycin, amphemycin. Meanwhile, according to the sequences
of ivnA and ivnE genes reported in GenBank, two pairs of specific p rimers were designed for detection of virulence factor genes. A t re2
sults, ivnA and ivnE genes were amp lified and detected successfully by PCR. The study p rovided a basis for the universal use of molec2
ular diagnostic technique, and supp lied scientific experimental datas for p reventing, diagnosing and curing the disease in future.
Key wo rds: 　M anouria im pressa　Salm onella　 Isolation　 Identification　V irulence factor gene　PCR
收稿日期 : 2009206224
基金项目 :成都大熊猫繁育研究基金会项目 (CPF008) ,重庆医科大学校级课题项目 (XBYB2008043)
作者简介 :黄道超 (19822) ,男 ,硕士研究生 ,研究方向 :野生动物疾病学 ; E2mail: huangdaochao@ yahoo. com. cn
通讯作者 :杨光友 (19642) ,男 ,博士 ,教授 ,研究方向 :分子寄生虫学　　沙门氏菌病是由某些特定血清型的致病性沙门氏菌所引起的一类急性、败血性传染病。沙门氏菌 广泛分布于自然界 ,它是肠杆菌科中一大类重要的革兰氏阴性致病菌 ,该菌极易污染食物、水源、土壤
2009年第 10期 黄道超等 :凹甲陆龟沙门氏菌的分离鉴定及毒力因子基因的 PCR检测
等人类生活环境 ,通常引起人和动物食物中毒、急性
胃肠炎和痢疾等疾病 ,严重时可导致机体死亡。
WHO已把沙门氏菌列入具有严重危害的食物传播
性人兽共患病病原菌 [ 1 ]。近年来 ,由于人们生活质
量提高 ,生活环境得以改善 ,卫生条件也有所保障 ,
人类遭受沙门氏菌的侵袭 ,鲜有报道 ,但野生动物生
活环境相对暴露 ,加上圈养状态下各种应激因素的
刺激 ,其感染沙门氏菌的几率随之增加。
凹甲陆龟 (M anou ria im pressa )属龟鳖目、陆龟
科 ,是仅产于亚洲的一种陆栖龟 ,其品种珍稀 ,为国
家二级野生保护动物 [ 2 ]。饲养在成都动物园的凹
甲陆龟先后出现了以腹泻为主要症状的疾病 ,经一
系列实验室工作初步诊断为沙门氏菌感染 ,并在其
中一只死亡凹甲陆龟体内分离得到一菌株。为此 ,
本试验就对该菌株进行了进一步的形态学、血清学
和生化试验鉴定 ,并且开展了该菌株对小鼠的人工
感染试验、药物敏感性试验和沙门氏菌毒力因子基
因 invA ( invasion p rotein A )、invE ( invasion p rotein
E)的 PCR检测 ,以期为今后该疾病的预防、诊断和
治疗提供科学的试验数据。
1 材料与方法
111 材料
饲养在成都动物园的以腹泻为典型症状的凹甲
陆龟和一只因腹泻死亡的凹甲陆龟 ;普通肉汤培养
基、普通培养基平面、鲜血琼脂平面、麦康凯琼脂平
面、三糖铁琼脂斜面和半固体培养基为本实验室自
配 ;生化发酵管和药敏纸片购自杭州天和微生物试
剂有限公司 ;沙门氏菌诊断血清由卫生部成都生物
制品研究所提供 ;试验动物 KM小鼠由四川农业大
学动物中心提供 ; PCR试剂盒及其他分子生物学常
规试剂均购自宝生物工程 (大连 )有限公司 ;大肠杆
菌 DH5α由本实验室保存。
112 分离培养
按无菌操作程序采取死亡动物心脏、肝脏、脾
脏、肺脏、肾脏、腹腔渗出液进行病料涂片和革兰氏
染色镜检 ,并将病料连续划线接种于普通培养基平
面、麦康凯琼脂平面、鲜血琼脂平面 , 37℃培养
24 h。观察菌落形态特征及革兰氏染色镜检 ,将可
疑菌落继续划线穿刺接种三糖铁琼脂斜面和半固体
培养基 ,然后从中再次分离纯化可疑菌 ,并用普通肉
汤培养保存菌株。
113 生化试验
生化试验及生物学特性的测定按郭万柱等 [ 1 ]
介绍的方法将分离株分别接种于三糖铁、葡萄糖、乳
糖、肌醇、卫矛醇、甘露糖、山梨醇、麦芽糖、蔗糖、鼠
李糖、阿拉伯糖、棉子糖、木糖、苯丙氨酸脱羧酶、赖
氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶、VP、MR、尿素试验和明
胶试验等生化发酵管 ,观察并记录细菌在各种生化
发酵管中的培养特性。
114 血清型鉴定
根据玻片凝集试验 [ 1 ]所述方法 ,挑取可疑沙门
氏菌一个纯培养物菌苔 ,分别置玻片两端 ,一端加生
理盐水一滴 ,另一端加 A～F多价血清一滴 ,搅匀 ,
判断结果 ;用同样方法将可疑沙门氏菌菌落分别与
沙门氏菌单价血清相互反应 ,判断结果 ,最后结合前
后两个结果对其进行抗原分析。
115 人工感染及毒力试验
将分离菌的新鲜肉汤培养物稀释成 110 ×109
CFU /m l浓度 (采用琼脂平板涂抹法对其进行浓度
计数 [ 1 ] ) ,以 012 m l/只的剂量腹腔注射接种于 10
只成年 KM小鼠 (雌雄各半 ) ,并用同样剂量的无菌
普通肉汤给 10只 KM小鼠腹腔注射接种 ,作为阴性
对照试验。观察记录 48 h内动物发病和死亡情况 ,
并及时对死亡动物进行病理解剖和病原分离。
116　药物敏感性试验
根据纸片扩散试验 [ 1 ]所述方法 ,将分离菌新鲜
肉汤培养物稀释成 110 ×109 CFU /m l浓度 ,用移液
器取 80μl菌液 ,每次 20μl,分别移取到琼脂平板
的 4个象限 ,然后沿平板边缘涂布均匀 ,加盖后放置
5 m in。平板稍干后 ,用镊子将药敏纸片平放在平
板上 ,轻压使其紧贴平板表面。每个平板贴 4张
药敏纸片 ,两张纸片相距 25 mm ,纸片与平板边缘
距离不小于 15 mm ,贴好纸片的平板于 37℃培养
18 h后 ,以各抗菌药物纸片说明书为判定标准观
察结果。
117 毒力因子的 PCR检测
根据 GenBank中已报道的沙门氏菌毒力因子
ivnA (登录号 : U43273)和 ivnE (登录号 : U43267)基
因序列 ,利用引物设计软件 Primer510设计如下两
对特异性引物。
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IvnA: PAF : 5′2AACTTTATTGGCGGTATTTC23′
PAR : 5′2CGTAACAACCAATACAAATG23′
IvnE: PEF : 5′2GGCGGAAGTACAGAAATTTG23′
PER : 5′2ACGTTGGTAGCCATAAC TGG23′
ivnA基因引物所扩增产物长度为 234 bp, ivnE基
因引物所扩增产物长度为 511 bp。引物设计好后按
《分子克隆指南 》[ 3 ]所述方法进行沙门氏菌基因组
DNA提取 ,然后参照宝生物公司 PCR试剂盒的使用
说明书 ,以基因组 DNA为模板进行 PCR扩增 ,扩增
反应为 25 μl体系 ,其中 10 ×PCR buffer 215μl、
dNTPs(10 mmol/L) 1μl、MgCl2 (25 mmol/L) 215μl、
上下游引物 (25μmol/L)各 2μl、基因组 DNA 2μl、Taq
酶 (5 U /μl) 0125μl、H2O 12125μl。 ivnA基因 PCR反
应程序 : 94℃预变性 5 min; 94℃变性 45 s, 52℃退火
45 s, 72℃延伸 60 s,循环扩增 35次 ; 72℃延伸 10 min。
ivnE基因 PCR反应程序 : 94℃预变性 5 m in; 94℃变性
45 s, 50℃退火 45 s, 72℃延伸 60 s,循环扩增 35次 ;
72℃延伸 10 min。与此同时设立大肠杆菌 DH5α基因
组 DNA为模板进行 PCR扩增的阴性对照。扩增结束
后取2μl PCR产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳检测。
2　结果
211　分离菌培养特性
该分离菌经涂片、染色、镜检 ,呈革兰氏阴性 ,单
个、成对或成丛存在 ,为两端钝圆的细小杆菌 ,有鞭
毛 ,无芽孢 ;在普通平板上生长时菌落细小 ,直径
0121～0160 mm,圆形 ,凸起 ,光滑 ,边缘整齐 ,暗乳白
色 ;在麦康凯琼脂平面生长的菌落同样细小 ,直径
0120～0163 mm,无色透明 ,边缘整齐 ,光滑凸起 ;在鲜
血琼脂平面上生长产生大菌落 , 直径 0145 ～
0182 mm,凸起 ,暗白色 ,不溶血 ,边缘整齐 ;在三糖铁
斜面划线和穿刺培养后 ,斜面为红色 ,底层为黑色 ;
采用穿刺半固体培养基法观察细菌的运动性时 ,该
菌呈刷状分布生长 ,具有运动性。
212 生化试验
生化试验结果显示该菌对乳糖、蔗糖、鼠李糖、
山梨醇、卫矛醇、肌醇、山梨醇、阿拉伯糖、棉子糖等
不发酵 ;对葡萄糖、麦芽糖、甘露醇等均能发酵产酸
产气 ;明胶试验、M. R. 试验呈阳性 ,尿素试验、V. P.
试验呈阴性 ;苯丙氨酸脱羧酶呈阴性、赖氨酸脱羧
酶、鸟氨酸脱羧酶呈阳性 ,结果详见表 1。
表 1　分离菌生化试验结果
　生化项目 　结果 　生化项目 　结果
　三糖铁 (上 /下层 ) TR I 　 + (R /B) 　葡萄糖 GLU 　 + +
　乳糖 LAC 　 - 　肌醇 INO 　 -
　甘露醇 MNT 　 + + 　卫矛醇 DUL 　 -
　山梨醇 SOR 　 - 　麦芽糖 MAL 　 + +
　蔗糖 SUC 　 - 　鼠李糖 RHA 　 -
　阿拉伯糖 ARA 　 - 　木糖 XYL 　 +
　M. R. 　 + 　棉子糖 MEL 　 -
　V. P. 　 - 　苯丙氨酸脱羧酶 PHE 　 -
　尿素试验 URE 　 - 　赖氨酸脱羧酶 LYS 　 +
　明胶试验 GEL 　 + 　鸟氨酸脱羧酶 OR I 　 +
　注 :“ + ”阳性或产酸 ;“ - ”阴性 ;“ + + ”产酸产气 ;“R”红色 ;“B”黑色
213　血清型鉴定
玻片凝集试验结果显示该菌株能与 O 多价血
清、O1单因子、O9单因子、O12单因子、H 多价血清、
Hg单因子和 Hm单因子血清产生凝集呈阳性 ,与其
他血清不产生凝集呈阴性 ,按照《伯杰氏细菌鉴定
手册 》[ 4 ]沙门氏菌血清型鉴定标准 ,该菌株为 D群
肠炎沙门氏菌 ,其抗原结构式为 1, 9, 12∶g, m∶- 。
214　毒力试验
攻毒小鼠在接种菌液 12～48 h后发生 100%
(10 /10)死亡 ,阴性对照组小鼠无任何病变 , 100%
(10 /10)存活。死亡前小鼠精神沉郁 ,被毛粗乱、无
光泽 ,食欲减退或停食 ,眼角有粘稠分泌物 ,四肢干
燥脱水。剖解死亡小鼠可见其肝脏出血肿大 ;脾脏
有出血点 ;胃肠黏膜出血、水肿 ;腹腔内有大量渗出
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2009年第 10期 黄道超等 :凹甲陆龟沙门氏菌的分离鉴定及毒力因子基因的 PCR检测
物。同时 ,按前述方法从死亡小鼠体内分离培养出
与感染菌株相似的菌落 ,经鉴定与所分菌株相同。
215 药物敏感性试验
药物敏感性试验结果显示 ,该菌株对头孢曲
松、氧氟沙星、卡拉霉素、多粘菌素、复方新诺明、
呋喃唑酮特别敏感 ,而对青霉素、红霉素、强力霉
素极不敏感 ,甚至对链霉素、四环素、氯霉素产生
耐药 (表 2)。
表 2　药物敏感性试验结果
药物名称 含量 (μg /片 ) 抑菌圈直径 (mm) 判定结果
　青霉素 ( PCN) 　10 IU 6 低敏
　庆大霉素 ( GM) 10 15 中敏
　链霉素 ( STM) 10 0 耐药
　氨苄青霉素 (AMP) 10 14 中敏
　先锋霉素 (CEP) 30 18 中敏
　头孢曲松 (CEF) 30 27 高敏
　多粘菌素 ( POL) 30 23 高敏
　四环素 ( TCN) 30 0 耐药
　氯霉素 (CAF) 30 0 耐药
　红霉素 ( EMU) 15 6 低敏
　复方新诺明 ( SMZ/TMP) 23175 /1125 22 高敏
　呋喃唑酮 ( FUR) 100 24 高敏
　强力霉素 (DOTC) 30 8 低敏
　阿莫西林 (AMO) 10 18 中敏
　氟哌酸 (NOR) 10 19 中敏
　氧氟沙星 (OFL) 10 22 高敏
　环丙沙星 (C IP) 10 18 中敏
　卡拉霉素 ( KAN) 30 27 高敏
216 毒力因子检测
根据 GenBank 中所登录的沙门氏菌 ivnA 和
ivnE全基因序列设计了两对特异性引物 ,然后运用
PCR的方法 ,以沙门氏菌基因组 DNA为模板扩增出
了大小约 234 bp (图 1)和 511 bp (图 2)的特异性条
带 ,其大小与预期结果一致 ,表明成功扩增并检测到
沙门氏菌 ivnA 和 ivnE基因 ,而以大肠杆菌基因组
DNA为模板的阴性对照则无条带产生。
M. DL 3000 Marker;
1～5. 沙门氏菌 ivnA基因 PCR扩增结果 ;
6. 大肠杆菌 PCR扩增作为阴性对照
图 1　 ivnA基因 PCR扩增检测
M. DL 3000 M srker;
1～6. 沙门氏菌 ivnE基因 PCR扩增结果
7. 大肠杆菌 PCR扩增作为阴性对照
图 2　ivnE基因 PCR扩增检测
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3　讨论
凹甲陆龟喜生活于干燥环境 ,栖息场所比较固
定 ,其性情胆怯 ,多以植物为食 ,偶尔摄食肉类 [ 2, 5 ]。
由于本次成都动物园发病的凹甲陆龟正处于驯养阶
段 ,它们对温度和噪音都特别敏感 ,容易受环境因素
的影响 ,人为给予的刺激过于频繁或是对食物搭配
不适应 ,都是其发病的诱因。而且这种龟多是长年
自由生活在野外 ,不习惯于笼舍饲养 ,一旦被限制在
笼舍中时 ,在一些应激因素的作用下导致机体抗病
力下降 ,加上环境消毒不严 ,食物卫生把关不严等可
能是引发本病的重要因素。
沙门氏菌病是由某些特定血清型的沙门氏菌所
引起的一类急性、败血性传染病。沙门氏菌属有多
达 2 500多种血清型 ,且每年都有新增血清型出现 ,
我国自 1991年底就报道了 37个群 , 255个血清型
及变异型 ,大多数血清型对人和动物都具有较强致
病作用 [ 6 ]。近年来 ,沙门氏菌病的发生和流行趋势
表现得更为多元化 ,被感染动物的范围有逐年拓宽
的趋势。除大量关于家畜家禽感染不同血清型沙门
氏菌的报道外 ,许多野生动物如水貂、朱鹮、奇彩山
鸡、马鹿、蛇、鹦鹉、大雁、小灵猫等 [ 7～12 ]都可感染该
病 ,这可能与沙门氏菌自身致病性强 ,血清型多 ,以
及变异型菌株逐年递增有关。
不同来源和血清型的沙门氏菌菌株其毒力存在
一定差别 ,本次分离的菌株致病性较强 ,可导致人工
感染小鼠全部死亡 ,这也是导致本次凹甲陆龟死亡
的直接原因 ,而且该分离菌对链霉素、四环素、氯霉
素等产生较强的耐药性 ,这给本次治疗的针对性、有
效性带来了一定难度。同时由于农业、畜牧业、水产
业大量滥用抗生素做添加剂 ,导致各种细菌耐药质
粒的循环产生并进化 ,使得人和动物对多种抗生素
的耐药性越来越高。因此 ,在兽医生产实践中更应
该注意各种抗生素的科学使用 ,不合理使用抗菌素
不仅会影响动物健康 ,甚至会给人类生存带来很大
的潜在风险。
目前对沙门氏菌的检测大多仍采用细菌分离、
生化鉴定、血清分型和免疫酶等传统方法 ,其过程烦
琐、费时费力 ,且肠杆菌科细菌间的生化反应多有交
叉 [ 13 ] ,因此 ,为有效地预防和控制疾病发生 ,建立快
速、敏感而又特异的检测沙门氏菌的方法是非常必
要的。随着分子细菌学研究的发展 ,人们对细菌的
毒素、侵袭素与毒力岛等毒力因子认识的不断加深 ,
细菌的检测方法已经从传统的一般表型特征鉴定深
化为遗传特征的鉴定 [ 14 ]。沙门氏菌的毒力因子 ivnA
和 ivnE基因就是位于染色体上编码毒力相关基因的
称为毒力岛的特定区域 ,该区域编码与侵袭力有关的
III型分泌系统 ( type III secretion system, TISS) ,它是
一个由多组分蛋白复合体形成的跨膜通道 ,主要通过
分泌毒力蛋白 ,并把这些毒力蛋白直接注入宿主细胞
发挥致病作用 [ 15 ]。 ivnA和 ivnE等侵袭蛋白是细菌
侵入细胞必需的介导因子 ,决定细菌进入宿主上皮细
胞的能力 ,与沙门氏菌的致病性密切相关 [ 16 ]。本试
验结合沙门氏菌 ivnA和 ivnE基因的特性 ,在生化试
验和血清型鉴定结果的基础上 ,利用分子生物学技
术 ,通过 PCR方法对该分离菌进行了再次分子诊断 ,
这保证了该疾病的确诊 ,同时为进一步全面开展沙门
氏菌分子检测研究奠定了良好基础。
参 考 文 献
1　郭万柱 ,吴彤 ,陈瑶先 ,动物微生物学. 成都 :四川科学技术出版
社 , 1997, 373～443.
2　于洪贤 ,两栖爬行动物学. 哈尔滨 :东北林业大学出版社 , 2001,
127～128.
3　萨姆布鲁 J,弗里奇 EF,曼尼阿蒂斯 T,分子克隆实验指南 (第 2
版 ) . 北京 :科学出版社 , 1998: 880～887.
4　布瑞德 ,伯杰氏细菌鉴定手册 (第 8版 ) . 北京 :科学出版社 ,
1984: 436～442.
5　周婷. 野生动物 , 1998, 19 (2) : 19.
6　焦新安 ,刘秀梵. 国外医学微生物学分册 , 1999, 22 (1) : 28～30.
7　张毅 , 任荣清. 贵州畜牧兽医 , 2005, 29 (2) : 22～22.
8　张发慧. 中国畜牧兽医 , 2005, 32 (1) : 56～56.
9　甘小琳. 江西医学检验 , 1998, 16 (3) : 140～141.
10　王芝英 , 胡世君. 西南农业大学学报 , 2004, 26 (2) : 230～232.
11　王自然 , 李永红. 山东畜牧兽医 , 2003, (6) : 35～36.
12　刘振相 , 钟福生. 中国动物检疫 , 2001, 18 (11) : 25～26.
13　陈金顶 ,索青利 ,廖明 ,等. 中国人兽共患病杂志 , 2004, 20 ( 10) :
868～871.
14　Kubori T, Matsushima Y, Nakamura D, et al. Science, 1998, 280:
602～605.
15　王效义. 生物技术通讯 , 2004, 15 (2) : 160～162.
16　Wood MW , Jones MA, W atson PR, et al. Mol M icrobiol, 1998,
29: 883～885.
061