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生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN 2011 年第 3 期
PCR相关技术在植物病毒检疫检测中的应用
顾青雷 刘昊 张绍红
(张家港出入境检验检疫局，张家港 215600)
摘 要: PCR和建立在 PCR 基础上的分子生物学技术以其灵敏、快速、简便等优点广泛应用于植物病毒的检测。阐述
反转录聚合酶链式反应、免疫捕捉反转录 PCR、PCR-单链构型多态性、实时荧光定量 PCR、差异显示 PCR 和巢式 PCR 等相关
技术的原理及其在植物病毒检测中的应用现状，以期为我国植物病毒的检疫检测提供有益参考。
关键词: 植物病毒 PCR 检疫检测
Application of PCR Related Techniques in Plant
Virus Quarantine and Detection
Gu Qinglei Liu Hao Zhang Shaohong
(Zhangjiagang Entry-Exit Inspection and Quarantion Bureau，Zhangjiagang 215600)
Abstract: PCR and the technology in molecular biology based on PCR have been widely used in the detection of plant virus for
their high-sensitivity，fast-response and easily-operation． The paper elaborates the principles of technology of RT-PCR，IC-RT-PCR，
PCR-SSCP，real-time PCR，DD-PCR and nested PCR and their application status in the detection of plant virus to provide reference for
quarantine and detection of plant virus．
Key words: Plant virus PCR Quarantine and detection
收稿日期:2010-10-13
作者简介:顾青雷，男，本科，农艺师，主要从事进境国际航行船舶植物疫情检疫检测等方面工作;E-mail:eagle6416@ 126． com
近年来，植物病毒在世界各国的危害日趋严重，
所发现和报道的病毒种类日益增多，目前植物病毒分
为 18个科(包括 3个含有动物病毒的科、2 个由反转
录转座子组成的科) ，76个属(包括 20 个未定科的悬
浮属) ，共有近 1 000 种病毒，其中包括约 280 个暂定
种［1］。加入WTO 以后，随着我国的对外开放及国际
贸易不断扩大，境外植物病毒通过口岸进入境内的风
险逐渐加大，我国出入境检验检疫部门面临着空前的
挑战。由于各种原因，目前植物病毒在口岸被检验检
疫机关截获的机率依然不高，远远低于昆虫和真菌检
出率。目前，国内针对植物病毒的检疫方法主要包括
鉴别寄主反应(生物学方法)、电镜观察、血清学试验
和分子生物学手段。聚合酶链式反应(polymerase
chain reaction，PCR)技术是一种在体外快速扩增特定
DNA序列的方法。PCR 及其相关技术以其快速、灵
敏和准确等优点已广泛应用于植物病害的检测研
究［2］。自 1983年美国 PE 公司的 Mullis 等发明了聚
合酶链式反应并推出了第一台 PCR 仪以来，不断衍
生出多种新的技术，使其敏感性和特异性大大增强，
可检测的最低病毒含量达到 fg水平。
1 反转录聚合酶链式反应(reverse transcri-
ption PCR，RT-PCR)
常规 PCR 可检测植物 DNA 病毒，RT-PCR 可检
测植物 RNA 病毒。Saiki 等于 1998 年首创 RT-PCR
技术，先将 mRNA反转录为 cDNA，再做 PCR扩增，电
泳后即可得到待检测的结果，已经成功地运用到不同
的植物病毒检测［3］。病毒 RNA的成功提取是运用这
些技术的前提。目前病毒 RNA 提取方法主要有两
类:一是先提纯病毒，再从提纯病毒中提取病毒RNA;
二是直接提取带毒寄主植物总 RNA作为起始反转录
模板。近年来，一步法 RT-PCR 体系已经建立，将反
转录和 PCR扩增在一个反应管内进行，节省时间并
降低了污染的可能性［4，5］。由于大多数病毒是 RNA
病毒，RT-PCR检测方法显得更为重要。周国辉［6］使
2011 年第 3 期 顾青雷等:PCR相关技术在植物病毒检疫检测中的应用
用双重 RT-PCR 在兰花样品上检测到 CymMV 和
ORSV，这种方法的灵敏度高，所需样品量少，在快速
检测低含量样品时十分有用。柳爱春等［7］研究建立
兰花病毒 CymMV和 ORSV双重一步法 RT-PCR的检
测方法，获得较理想的检出效果;扩增产物的核酸序
列经 BLAST分析，同源性均在 85%以上，证实了检测
结果的准确性。张威等［8］根据大蒜普通潜隐病毒
(garlic common latent virus，GCLV)的外壳蛋白区域
的保守序列设计合成一对寡核苷酸引物，以带毒植物
的总 RNA 为模板，进行反转录和 PCR 扩增，通过反
应体系和反应程序的建立与优化，扩增得到长 300 bp
的目的片段，并将目的片段转入大肠杆菌进行了克隆
和序列测定。测序结果与 GenBank 中其他 GCLV相
应区域的序列同源性最高达 98%，并对其检测的特
异性和灵敏度进行了验证，从而建立了快速、灵敏、特
异性强的 GCLV 分子生物学检测方法。吴志朋等［9］
根据马铃薯卷叶病毒的外壳蛋白基因序列，设计合成
了一对寡核苷酸引物，从感染 PLRV 的马铃薯病叶组
织中提取出病毒的 RNA，进行 cDNA 合成及 PCR 扩
增，得到一条长度约 620 bp 的特异 PCR扩增产物，与
理论设计的外壳蛋白基因大小一致。建立了快速灵
敏简便的 PLRV检测的新方法，其灵敏度要比 PLRV
的血清学检测方法高 104倍，在基因水平上为 PLRV
的检测提供了更新手段，并在农业部植物检疫实验所
马铃薯病毒检测中心推广应用。此外，其他学者采用
RT-PCR技术对马铃薯 S病毒［10］、马铃薯 X病毒［11］、
黄瓜病毒［12］、辣椒轻微斑驳病毒［13］和香蕉分化芽中
的黄花叶病毒［14］进行了检测。
2 实时荧光定量 PCR(real-time fluorescent
quantitative PCR)技术
随着定量技术的发展，形成了实时荧光定量 PCR
技术。它结合了荧光检测系统和 RT-PCR扩增系统，
标记染料插入到双链核酸中受激发光，在 PCR 扩增
的过程中就能检测模板 DNA有无扩增，是 PCR扩增
的真实检测(以往都是 PCR 之后用产物检测来判
断)。1996年，由美国 Applied Biosystems公司推出的
实时荧光定量 PCR技术，是指在 PCR指数扩增期间
通过连续监测荧光信号强弱的变化即时测定特异性
产物的量，并据此推断目的基因的初始量，不需要取
出 PCR产物进行分离。该技术不仅实现了对 DNA
模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更
强、能实现多重反应、自动化程度高，具实时性和准确
性等特点。实时荧光定量 PCR可以对 DNA、RNA样
品进行定量和定性分析。定量分析包括绝对定量分
析和相对定量分析。前者可以得到某个样本中基因
的拷贝数和浓度;后者可以对不同方式处理的两个样
本中的基因表达水平进行比较。除此之外，还可以对
PCR产物或样品进行定性分析，例如，利用熔解曲线
分析识别扩增产物和引物二聚体，以区分非特异扩
增;利用特异性探针进行基因型分析及 SNP 检测等。
虽然，实时荧光定量 PCR 在病毒检测研究中的应用
刚刚起步，但已经显示出了极好的应用前景。在 real-
time PCR中有 5种主要类型的探测化学物质用于实
时扩增，包括内嵌染料、双标记探针、FRET探针、分子
信标和 Ampliflor。漆艳香等［15］设计合成了苜蓿萎蔫
病菌实时荧光 PCR 引物和特异性探针，在国内首次
建立了苜蓿萎蔫病菌的实时荧光 PCR 检测体系，与
普通 PCR 相比，实时荧光 PCR 的灵敏度高 100 倍。
有研究表明，将实时荧光 PCR和RT-PCR结合可用以
检测番茄环斑病毒［16］。
3 免疫捕捉反转录-PCR(immunocapture re-
verse transcription PCR，IC-RT-PCR)
技术
免疫捕捉反转录 PCR(IC-RT-PCR)检测技术是
免疫学技术与 RT-PCR技术相结合建立起来的检测
技术。该技术不需进行病毒 RNA的抽提，操作更容
易，并且在不破坏病毒粒体的情况下，即可实现病毒
的检测。该方法中的病毒特异性抗体可用依赖于
dsRNA的单克隆抗体替代，为不具备病毒特异性抗
体或采用免疫学技术很难检测的病毒提供了一个可
行的检测方法。其灵敏度与典型的 RT-PCR 检测技
术相同［17］。陈建军等［18］在检测葡萄卷叶病毒Ⅲ
时，比较了常规的 RT-PCR 和 IC-RT-PCR 技术，发现
RT-PCR 不很稳定，易受环境、实验仪器和实验员身
体上 RNA 酶的影响，植物组织中蛋白质、DNA 和多
糖也直接影响试验结果，而 IC-RT-PCR 可以避免上
述问题，使检测简便、快速。已有报道表明，从 10 －4
稀释度的番木瓜叶粗汁液(相当于 0． 5 μg鲜叶组织
的量)中检测到了番木瓜环斑病毒［19］。
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin 2011 年第 3 期
4 PCR-单链构型多态性(PCR single-strand
conformational polymorphism，PCR-SS-
CP)
PCR-SSCP是一种简单、快速和经济的检测突变
的技术，是进一步研究细菌、真菌及病毒在不同地理
区间差异的有效手段。PCR-SSCP 是在完成靶 DNA
的 PCR扩增之后进行单链 DNA多态性分析。在 SS-
CP凝胶中电泳时，单链 DNA的泳动速率主要取决于
二级空间结构，因此若 DNA片段中碱基发生突变，将
会引起单链 DNA二级空间结构的改变，使 SSCP凝胶
上出现异常移动的电泳带(即 SSCP 阳性)。将单链
的扩增 DNA或组织基因组 DNA 通过中性的聚丙烯
酰胺凝胶电泳，根据其电泳位置的改变可分辨出单个
碱基的改变。PCR扩增的片段在变性剂或低离子浓
度下经高温处理变性为单链，形成亚稳定构象，由于
碱基组成差异而形成构象的不同，在非变性聚丙烯酰
胺凝胶中表现出电泳迁移率不同，即多态性。但
PCR-SSCP的重复性较差，且不能检测所有变异的位
置。刘升学等［20］利用 PCR-SSCP 对新疆甜菜坏死黄
脉病毒 RNA2变异进行了研究，通过分析来自新疆不
同地区 BN YVV RNA2的片段，将12个 BN YVV分离
株分为 4个变异类型，初步明确了新疆分离株存在分
化，并有明显的地域分布性。
5 差异显示 PCR(differential display PCR，
DD-PCR)技术
1992 年，Liang 和 Pardee［21］首次提出差异显示
技术(DD-PCR) ，并且利用这一技术克隆了几个基
因。由于该技术具有快速、灵敏、简单和可分析低丰
度 mRNA的优点［22］，很快成为克隆新基因和研究植
物基因表达的有力工具。这项技术最初用于医学研
究上，近年来已开始在高等植物研究中应用，为研究
高等植物的发育、生理代谢及基因表达提供了重要
的技术手段。差异显示的基本原理是，利用一系列
的 oligo(dT)引物，逆转录真核生物细胞中全部表达
的 mRNA，通过 PCR 扩增的方法，转换成 cDNA 双
链，再利用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，将有差异的片
段分开，筛选出目的基因。Benito 等［23］通过研究番
茄真菌病害，利用差异显示法对抗病机理进行了探
索。研究发现，健康的番茄叶和被真菌或烟草枯斑
病毒侵染的番茄叶的 mRNA 有较大差异。在病菌
侵入后，植物防卫基因会迅速产生一系列 mRNA，产
生蛋白与病原菌相互作用，杀死病原菌或病毒。在
相互作用过程中，有 3 个 mRNA 片段(ddB-2、ddB-5
和 ddB-47)大量积累，但相互作用后，则很快消失。
这表明，植物的抗病与某些防卫基因的瞬时表达有
密切关系。叶楠等［24］以中国优良大豆品种东农 46
及大豆疫霉优势生理小种 1 号菌株为材料，利用
mRNA 差异显示技术研究东农 46 与大豆疫霉根腐
病菌非亲和互作中前后基因表达的差异，寻找并分
离出与大豆疫霉根腐病抗病性相关的 9 条 cDNA 片
段，通过这些差异片段的序列分析进一步阐述大豆
对疫霉根腐病菌的分子抗病机制。
6 巢式 PCR(nested PCR，N-PCR)技术
巢式 PCR是指利用两套 PCR引物(巢式引物)
对进行两轮 PCR扩增反应。
在第一轮扩增中，外引物用以产生扩增产物，此
产物在内引物的存在下进行第二轮扩增。由于巢式
PCR反应有两次 PCR扩增，从而降低了扩增多个靶
位点的可能性(因为与两套引物都互补的引物很
少)增加了检测的敏感性;又有两对 PCR 引物与检
测模板的配对，增加了检测的可靠性。一般应用于
动物方面，如病毒、梅毒螺旋体、HIV和肿瘤基因等。
巢式聚合酶链反应也称套式 PCR，在这种技术中，
首先用一对外引物进行第一轮 PCR，再使用第一对
引物扩增的 DNA序列内部的一对引物再次扩增，所
以称为巢式 PCR。由于使用了两对引物并且进行
了两轮扩增反应，因此试验的敏感性和特异性均增
强。在一定情况下，这种方法对减少 PCR后扩增产
物的污染问题极为有用，但它增加了每次试验的复
杂性。为了节约，可在第二轮扩增时采用半巢式，设
计单条引物，另一条引物与第一轮扩增共用，效果也
优于单次扩增。巢式 PCR，可以在 106基因组背景
下检测到一个拷贝的病毒基因，也不像二次 PCR 容
易产生成片的产物，是效果最好的 PCR，但也因此
是最容易污染的 PCR。李河等［25］利用设计的 GF1 /
GR2 特异性引物与 ITS 区通用引物进行巢式 PCR
扩增，灵敏地扩增出了油茶根腐病菌层生镰刀菌
DNA。毛钧等［26］利用 LG 和 Cxx 两对引物，通过试
验优化设计，建立了比较可靠的甘蔗宿根矮化病巢
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2011 年第 3 期 顾青雷等:PCR相关技术在植物病毒检疫检测中的应用
式 PCR 检测体系。张巧萍等［27］应用常规 RT-PCR
和巢式 PCR方法从表现同心圆症状的文心兰植株
上检测得到预期 DNA 片段，且巢式 PCR 检测灵敏
度比常规 PCR高。序列分析结果表明，该病毒的 N
基因序列和已经发表的凤仙花坏死斑病毒(登录号
为 AB109100、AB207803 和 DQ425096)核苷酸序列
同源性为 99%，确定表现同心圆症状的文心兰上携
带了凤仙花坏死斑病毒。陈微等［28］以 3 株黄瓜尖
镰孢菌(Fusarium oxysporum f． sp． cucumarinum)、23
株镰孢菌属(Fusarium spp．)真菌和分离自土壤的
20 株真菌、6 株细菌和 7 株放线菌为材料，采用化学
裂解法提取总 DNA，进行 PCR-RFLP和巢式 PCR检
测。试验证明，PCR-RFLP程序不能完全区分 Fusar-
ium属内不同种，而巢式 PCR 对黄瓜尖镰孢菌具有
特异性。
7 讨论
目前，植物病毒的检测方法对口岸检疫部门要
求较高，很多一线检疫部门不具备开展病毒检测工
作的条件。传统的生物学检测方法所需时间太长，
不适于口岸部门进行检测。PCR 及其相关技术的
灵敏性是其他常规检测手段所不能比拟的，理论上
讲，只要待测样品中有一个靶分子，PCR 就能阳性
扩增，随即带来了假阳性偏高的问题，故需要其他技
术方法配合进行综合判断。虽然 PCR 及其相关技
术用于植物病害的检测操作简单，但检测方法需在
对病原体的分子背景有相当了解的基础上才能建
立。PCR 技术还需要昂贵的仪器设备和专业化的
技术支持，迄今多处于实验室研究阶段，实际应用尚
少，难以推广普及。随着研究的不断深入及分子生
物学的快速发展，PCR 技术将在植物病害的检测方
面发挥更大的作用。
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(下转第 90 页)
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本研究通过常规 PCR 方法从玉米中分离了低
温和高盐诱导型启动子 Lsp，序列分析表明该启动
子区存在大量的植物逆境应答元件，如响应干旱失
水应答元件 DRE、MYB /MYC，低温应答元件 CBF-
HV、LTR，TC-rich repeats 以及植物激素应答元件。
其中 DRE、MYB /MYC、CBFHV、LTR 等参与植物干
旱、缺水和盐胁迫等逆境的应答。GARE 是 GA 的
应答元件;在 Lsp 序列中出现的这些与逆境应答相
关的顺式作用元件预示着该基因可能在植物的逆境
应答中发挥重要作用。通过叶盘转化法转化烟草，
GUS染色初步表明 Lsp 具有一定的启动活性，为探
明玉米逆境胁迫启动子表达调控序列及其调控机制
的研究奠定基础。
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(责任编辑 马鑫
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